Hibridación de sondas de DNA LIVe en cortes de tejidos preservados en parafina

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1 Hibridación de sondas de DNA LIVe en cortes de tejidos preservados en parafina Utilization protocol for LIVe DNA probes on paraffin-embedded tissue sections Hibridação con Sondas LIVe para cortes de tecidos preservados em parafina 1

2 PROTOCOLO DE UTILIZACIÓN Hibridación para cortes de tejidos preservados en parafina Materiales Provistos: ADN marcado con moléculas fluorescentes (sonda). Buffer de Hibridación Reactivos para preparar solución de montaje (Antifade y DAPI) Sales para preparar 80ml de Buffer de Desparafinado* Sales para preparar 80ml de Buffer de Pretratamiento* *ver protocolos de preparación mas abajo. Materiales extras requeridos: 2XSSC* Soluciones de etanol 70, 90 y 100% Acido clorhídrico 0.2N Agua destilada Pepsina 0.5%* Detergente no-iónico ph-metro o papel para medir ph Cubreobjetos Soluciones de enjuague (1 y 2)* Cemento de contacto removible Tubos 0,2 o 0,5ml Recipientes para enjuagues (Coplin) Aceite de inmersión Cámara húmeda Termómetro *ver protocolos de preparación mas abajo. Equipamientos requeridos: Microscopio de fluorescencia: No siempre un microscopio utilizado en reacciones de inmunohistoquímica u otro tipo de análisis con fluorescencia resulta adecuado. Los requerimientos para observar correctamente una reacción de FISH son los siguientes: o Fuente de Excitación: Se recomienda una lámpara de mercurio de 100 Watt con una vida útil de 200horas. Es necesario que una vez colocada, la lámpara sea alineada correctamente. o Objetivos: Para la ubicación del blanco (interfases o metafases) se recomiendan objetivos de 10, 20 y/o 40X. Para el análisis de la reacción es necesario un objetivo de inmersión especial para fluorescencia con una apertura numérica 0,75. o Filtros de excitación-emisión: Cada fluorocromo observado requerirá de diferentes filtros. Los requerimientos para nuestras sondas se muestran en el cuadro a continuación: Fluorocromo Excitación (nm) Emisión (nm) Verde Rojo DAPI

3 Micropipetas (1-10µl o similar) Microcentrífuga Vórtex Timer Baño de inmersión Incubadora 37ºC) Placa termostática o hibridizador Preparación de soluciones extras: Buffer de Deparafinado Agregar las sales provistas en el tubo rotulado Buffer de Desparafinado a 70ml de H2O ultrapura. Agregar de 400ul de detergente no iónico (NP40, Tween o similar) Llevar a ph 8 con HCl. Completar hasta volumen final (80ml) con H2O ultrapura. Luego de preparado mantener en heladera a 4ºC Buffer de Pretratamiento: Agregar las sales provistas en el tubo rotulado Buffer de Pretratamiento a 50ml de H2O ultrapura. Llevar a ph 8.5 con HCl. Completar hasta volumen final (80ml) con H2O ultrapura. Luego de preparado, mantener en heladera a 4ºC Pepsina Solución Stock: 10% [0.1g/ml] Diluir 0.1g de pepsina en 1ml de Agua Ultrapura (Importante el ph debe ser = 2) Luego de preparado guardar a -20ºC Solución de trabajo: 0.05% [0.5mg/ml] Pepsina solución Stock: 0.4ml HCl 12N (fumante): 0.66ml H2O destilada: 79ml (Importante el ph final debe ser = 2) Luego de utilizar, guardar a 4ºC hasta 30 días o 4 usos. 2XSSC: Cloruro de Sodio (NaCl) 300mM Citrato de Sodio (Na3C6H5O 7) 30mM Ajustar a ph:7 con Acido clorhídrico (HCl) 1N Luego de preparado, mantener en heladera a 4ºC Enjuagues 1 y 2: En un coplin adecuado para 80ml, agregar 80ml de 2XSSC y 0,080ml de detergente no-iónico. Luego de preparado, mantener en heladera a 4ºC 3

4 Precauciones y advertencias (Leer atentamente): Reactivo analítico. Para uso en investigación solamente. Este producto NO está probado para uso diagnóstico o terapéutico. Las reacciones así como la interpretación de las mismas deben ser realizadas por personal idóneo debidamente entrenado. Todas las muestras biológicas deberían ser tratadas como posibles transmisores de agentes infecciosos. Se debe evitar la exposición de la muestra a ácidos o bases en alta concentración así como también al calor extremo. Estos factores dañan el DNA y pueden causar el fallo de la reacción de FISH. Una vez extraída la alícuota a utilizar, la sonda debe ser guardada nuevamente a -20ºC. La falla u omisión de cualquiera de los pasos del protocolo detallado más abajo puede generar resultados erróneos o inaceptables. Las soluciones de enjuague pos-hibridación (ver protocolo) deben ser renovadas periódicamente debido a que son propensas de contaminación. El buffer de hibridación contiene formamida, un teratógeno, por lo que debe evitarse el contacto con la piel y las mucosas. Se recomienda el uso de guantes y chaqueta de trabajo durante todo el proceso. Es necesario controlar siempre la temperatura de las soluciones que se utilizan calientes. Todos los materiales peligrosos deben ser descartados de acuerdo a las normativas de su institución. 4

5 Protocolo de utilización Desparafinado: Pasos previos Preparar 1 recipiente (coplin) con Buffer de Desparafinado. Por lo menos 30 minutos antes de comenzar el proceso de desparafinado, colocar en un baño termostático a 90ºC. (Opcional) Incubar los preparados conteniendo los cortes de tejido a 58ºC durante 30 minutos. Sumergir los vidrios en Buffer de Desparafinado a 90ºC durante minutos. Enjuagar 2 veces en Etanol 100% 3 minutos cada vez. Dejar secar Pretratamiento: Pasos previos Preparar un recipiente (coplin) con Buffer de Pretratamiento. Colocar en un baño termostático a 71ºC. Antes de utilizar corroborar que la temperatura interna de la solución sea de 71ºC (±1ºC) Preparar un recipiente (coplin) con Solución de trabajo de Pepsina en un baño termostático a 37ºC. Antes de utilizar corroborar que la temperatura interna de la solución sea de 37ºC (±1ºC) Sumergir 20 minutos los preparados en HCl 0.2N a temperatura ambiente. Enjuagar en Agua destilada 3 minutos 2 veces. Sumergir los preparados en el Buffer de Pretratamiento a 71ºC durante 30 minutos. Sumergir los vidrios en 2 baches sucesivos de 2XSSC, 5 minutos en cada uno. Enjuagar brevemente en agua destilada. Sumergir los preparados en la solución de Pepsina durante 7 a 15 minutos. Enjuagar la pepsina sumergiendo los preparados en 2 baches sucesivos de H2O, 3 minutos en cada uno. Deshidratar en Etanol 70, 90 y 100% 2 minutos en cada uno. Dejar secar completamente. Co-desnaturalización: Preparación de la sonda: Descongelar la sonda, homogeneizar en Vórtex Centrifugar brevemente Atemperar el buffer de hibridación En un tubo de PCR agregar: 7µl de Buffer de hibridación 1µl de sonda Homogeneizar en Vórtex Centrifugar brevemente 5

6 Revelado Co-desnaturalización: Sobre el reverso del portaobjetos marcar la región a hibridar (los 8µl preparados hibridan una región aproximada de 22x22mm). Agregar la solución de sonda sobre la región marcada Colocar un cubreobjetos de tamaño adecuado Sellar los bordes del cubreobjetos con cemento de contacto removible Colocar el portaobjetos así montado sobre una superficie caliente (hibridizador, plancha termostática, etc.). En ocasiones es conveniente colocar una gota de agua sobre la placa calefactora y luego colocar sobre ésta el portaobjetos montado, de esta forma se logra una película de agua entre el portaobjetos y la superficie caliente optimizando la transferencia de temperatura. Calentar a 71ºC durante 8 a 15 minutos. Colocar en cámara húmeda, incubar a 37ºC toda la noche. Pasos previos Por lo menos 30 minutos antes, calentar la solución de enjuague 1 a 71ºC (±1ºC) corroborando con un termómetro calibrado la temperatura dentro del recipiente. Atemperar la solución de enjuague 2 a temperatura ambiente. Atemperar la solución de contracolorante previamente preparada (ver protocolo adjunto) a temperatura ambiente. Enjuague del exceso de sonda Extraer el portaobjetos de la cámara húmeda. Quitar cuidadosamente el cemento de contacto. Sumergir el portaobjetos en una solución de 2XSSC a temperatura ambiente hasta que el cubreobjetos se desprenda (2 a 5 minutos). Sumergir el portaobjetos en el enjuague 1 durante 2 minutos exactamente. Sumergir el portaobjetos en el enjuague 2 un mínimo de 1 minuto. Drenar el exceso de líquido. Deshidratar en etanol 70, 90, 100% 1 minuto en cada uno. Dejar secar completamente Colocar sobre la región hibridada una gota (aprox. 10µl) de contracolorante. Agregar un cubreobjetos de tamaño mayor a la región hibridada. Drenar el exceso de contracolorante presionando suave y uniformemente con papel absorbente. Eliminar posibles burbujas de aire presionando suavemente con la punta de un tip. La reacción está lista para ser analizada. 6

7 Protocolo Resumido: Paso Tiempo Desparafinado (Opcional) Incubación a 58ºC Mínimo 30 Buffer Desparafinado 90º Etanol 100% x2 3 Dejar secar /// Pretratamiento HCl 0.2N 20 H2O 3 Buffer Pretratamiento 71ºC 30 2xSSC x2 5 Enjuagar brevemente en agua /// Pepsina 37ºC 7-15 H2O X2 3 Etanol 70, 90, 100% 2 Dejar secar /// Codesnaturalización-Hibridación Co-desnat 71ºC 8-15 Hibridación 37ºC Aprox. 18hs Revelado Enjuague 1 71ºC 2 Enjuague 2 Tº Amb Mínimo 1 Etanol 70, 90, 100% 1 Dejar secar /// Montado con Sn. Montaje /// 7

8 Fluorescent in situ Hybridization Protocol (to perform on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections) Materials Provided: fluorescently labeled DNA (probe). Hybridization Buffer Reagents for mounting solution (antifade and DAPI) # Reagents to prepare 80ml Dewaxing buffer * Reagents to prepare 80ml Pretreatment Buffer * # see attached protocol * see preparation instructions below. Materials required but not provided 2XSSC* Ethanol solutions 70, 90 y 100% Hydrocloric Acid 0.2N Pepsin 0.5%* Non-ionic detergent ph-meter or ph indicator papers Coverslips Wash solutions (1 y 2)* Rubber cement 0,2 or 0,5ml tubes Coplin jars Moist chamber Calibrated thermometer *see prepatation instructions below. Equipment Required: Fluorescence microscope: Not always a microscope used in immunohistochemistry reactions or other fluorescent analysis is appropriate. The requirements to properly observe FISH reactions are as follows o Excitation Source: a 100 Watts mercury lamp with a lifespan of 200 hours is recommended. It is necessary that once positioned, the lamp is correctly aligned. o Objectives: To target location (interphases or metaphases) objectives of 10, 20 and / or 40X are recommended. The reaction analysis requires a special fluorescence immersion objective with a numerical aperture 0.75 o Excitation-emission filters: Each fluorochrome require different filters. The requirements for our probes are listed in the table below: Fluorochrome Excitation(nm) Emission (nm) Green

9 Red DAPI Microcentrifuge Microliter pipettor for 1 to 10 μl volumes Vórtex Timer Water bath Incubator thermostatic plate or hybridizer Reagent preparation: Dewaxing Buffer: Add the salt provided in the tube labeled "Dewaxing Buffer" to 70 ml of ultrapure H2O. Incorporate 400ul of nonionic detergent (NP40, Tween or similar) Adjust to ph 8 with HCl. Complete to 80ml with ultrapure H2O. Store at 4ºC Pretreatment Buffer: Add the salt provided in the tube labeled "Pretreatment Buffer" to 50 ml of ultrapure H2O. Adjust to ph 8 with HCl. Complete to 80ml with ultrapure H2O. Store at 4ºC Pepsin: Stock solution: 10% [0.1g/ml] Dilute 0.1 g of pepsin in 1 ml of Ultrapure Water (ph:2!!) o Store at -20 C Working solution: 0.05% [0.5mg/ml] Pepsin Stock solution: 0.4ml 12N HCl (pure): 0.66ml Distilled H2O: 79ml o After use, store at 4 C for 30 days or 4 uses. 2XSSC: Sodium chloride (NaCl) 300mM Sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O 7)30mM Adjust ph to 7.0 with drops of Hydrochloric acid (HCl) 1N Wash solution 1 and 2: In a coplin suitable for 80ml, add 80ml of 2XSSC and 0.80 ml of non-ionic detergent. Adjust ph to Keep at 4ºC after use. Change after 1 week. 9

10 Cautions and warnings (Read carefully): Analytical reagent. For research use only. This product is NOT tested for diagnostic or therapeutic use. The reactions and the interpretation of them must be performed by qualified personnel properly trained. All biological samples should be treated as potential carriers of infectious agents. Avoid exposure of sample to acid or alkali in high concentration as well as extreme heat. These factors can damage DNA and cause failure of the FISH reaction. The failure or omission of any step of the protocol detailed below can lead to erroneous or unacceptable results. The hybridization buffer containing formamide, a teratogen and therefore should avoid contact with skin and mucous membranes. It is recommended the use of gloves and jacket work throughout the process. All hazardous materials should be discarded according to rules of your institution. 10

11 Slide pretreatment Dewaxing: Previous steps Prepare 1 coplin jar with Dewaxing buffer. At least 30 minutes before beginning the process of dewaxing, place in a water bath at 90 C. (Optional) Incubate the slides containing the tissue sections at 58 C for 30 minutes. Dip slides in Dewaxing buffer at 90 C for minutes. Rinse 2 times in 100% ethanol for 3 minutes. Allow to dry Pretreatment: Previous steps Prepare a coplin jar with Pretreatment buffer. Place in a water bath at 71 C. Before using verify if the internal temperature of the solution is 71ºC (± 1 C) Prepare a coplin jar with Pepsin working solution in a thermostatic bath at 37 C. Before using verify if the internal temperature of the solution is 37 C (± 1 C). Immerse slides in HCl 0.2N at room temperature for 20 minutes. Rinse in distilled water 3 minutes 2 times. Immerse slides in the Pretreatment buffer at 71 C for 30 minutes. Immerse in 2XSSC, 2 times, 5 minutes each. Briefly rinse in distilled water. Immerse slides in pepsin solution for 7 to 15 minutes. Rinse the pepsin by immersing in H2O, 2 times, 3 minutes each. Ethanol Dehydrate in 70, 90 and 100% 2 minutes each. Allow to dry completely. Co-denaturation: Probe preparation: Thaw the probe tube, mix on Vortex Centrifuge briefly Thaw the hybridization buffer In a PCR tube add: 7μl of hybridization buffer 1μl of probe Mix in vortex Centrifuge briefly Co-Denaturation: On the back of the slide highlight the region to hybridize (the 8μl prepared cover approximately a region of 22x22mm). Add the probe solution on the region to hybridize Place a coverslip of appropriate size. 11

12 Washing: Seal the edges with removable contact cement or place a sheet of Parafilm that exceeds the size of the coverslip. Place the mounted slide on a hot surface (hybridizer, thermostatic plate, etc.). Sometimes it is advisable to place a drop of water on the hot plate to optimize the temperature transfer. Heat to 71 C for 8 to 15 minutes. Place in a moist chamber and incubate at 37 C overnight Previous steps At least 30 minutes before washing, heat the wash solution 1 to 71 C (+/-1ºC). With a calibrated thermometer corroborate the temperature inside the coplin. Thaw wash solution 2 to room temperature. Temper the counterstain solution previously prepared (see attached protocol) at room temperature. Remove the slide from moist chamber. Carefully remove the rubber cement or Parafilm sheet. Immerse the slide in a 2XSSC solution at room temperature until the coverslip falls off. Immerse the slide in the wash solution 1 for exactly 2 minutes. Immerse the slide in the wash solution 2 for at least 1 minute. Take off the slide and drain excess liquid. Ethanol Dehydrate in 70, 90 and 100% 1 minute each. Allow to dry completely. Place on a drop of mounting solution on the hybridized region (aprox. 10µl). Place a coverslip of appropriate size Drain excess mounting solution by pressing gently and evenly with paper towels. Remove any air bubbles by pressing gently with a tip. The reaction is ready for analysis 12

13 Summary protocol: Step Time Dewaxing (Optional) Incubation at 58ºC Minimum 30 Dewaxing Buffer 90º Ethanol 100% x2 3 Allow to dry /// Pretreatment HCl 0.2N 20 H2O 3 Pretreatment Buffer 71ºC 30 2xSSC x2 5 Rinse briefly in water /// Pepsin 37ºC 7-15 H2O X2 3 Ethanol 70, 90, 100% 2 Allow to dry /// Co-denaturation/Hybridization Co-denaturation 71ºC 8-15 Hybridization 37ºC Aprox. 18hs Washing Wash solution 1 71ºC 2 Wash solution 2 Room Tº Minimum 1 Ethanol 70, 90, 100% 1 Allow to dry /// Mounting /// 13

14 PROTOCOLO DE UTILIZAÇAO Hibridação para cortes de tecidos preservados em parafina Materiais fornecidos: DNA marcado com moléculas fluorescentes (sonda). Buffer(tampão) de Hibridação Reativos para preparar solução de montagem (Antifade e DAPI) Sais para preparar 80ml de Buffer(tampão) de Desparafinado* Sais para preparar 80ml de Buffer(tampão) de Pré-tratamento* *ver protocolos de preparação abaixo. Materiais extras necessários: 2XSSC* Soluções de etanol 70, 90 y 100% Ácido clorídrico 0.2N Água destilada Pepsina 0.5%* Detergente não-iônico ph-metro ou papel para medir ph coverslip/lamínula Soluções de enxague (1 y 2)* Adesivo de contato removível Tubos 0,2 o 0,5ml Recipientes para enxagues (Coplin) Azeite de imersão Câmara úmida Termômetro *ver protocolos de preparação abaixo. Equipamentos requeridos: Microscópio de fluorescência: Nem sempre um microscópio utilizado em reações de imunoistoquímica ou outro tipo de análise com fluorescência resulta adequado. Os requerimentos para observar corretamente uma reação de FISH são os seguintes: o Fonte de Excitação: Recomenda-se uma lâmpada de mercúrio de 100 Watt com vida útil de 200horas. É necessário que uma vez colocada, a lâmpada seja alinhada corretamente. o Objetivos: Para a localização do alvo (interfases ou metafases) se recomenda objetivas de 10, 20 y/o 40X. Para a análise da reação é necessário um objetiva de imersão especial para fluorescência com una apertura numérica 0,75. o Filtros de excitação-emissão Cada fluorocromo observado precisará de diferentes filtros. Os requerimentos para nossas sondas podem ser vistas no quadro a continuação: 14

15 Fluorocromo Excitação (nm) Emissão (nm) Verde Vermelho DAPI Micropipetas (1-10µl ou similar) Microcentrífuga Vórtex Timer Banho-maria Incubadora 37ºC) Placa termostática ou hibridizador Preparação de soluções extras: Buffer(tampão) de Deparafinado Adicionar as sais fornecidas no tubo rotulado Buffer de Desparafinado a 70ml de H2O ultra pura. Adicionar 400ul de detergente não iônico (NP40, Tween ou similar) Levar o ph a 8 com HCl. Completar até volume final (80ml) com H2O ultra pura. Depois de preparado manter na geladeira a 4ºC Buffer(tampão) de Pré tratamento: Adicionar as sais fornecidas no tubo rotulado Buffer de Pretratamento a 70ml de H2O ultra pura. Levar o ph 8.5 com HCl. Completar até volume final (80ml) com H2O ultra pura. Depois de preparado, manter na geladeira a 4ºC Pepsina Solução estoque: 10% [0.1g/ml] Diluir 0,1 g de pepsina em 1 ml de água ultrapura (Note-se a ph deve ser = 2) Após a preparação armazenar a -20 C Solução de trabalho: 0,05% [0.5mg/ml] Pepsina solução stock: 0,4 ml HCl 12N (puro): 0.66ml H2O destilada: 79ml (Observe o ph final deve ser = 2) Após a utilização, armazenar a 4 C durante 30 dias ou 4 utilizações. 2XSSC: Cloreto de Sódio (NaCl) 300mM Citrato de Sódio (Na3C6H5O 7) 30mM Ajustar o ph a 7 com Ácido clorídrico (HCl) 1N Depois de preparado, manter na geladeira a 4ºC Enxagues 1 e 2: Em um coplin adequado para 80ml, adicionar 80ml de 2XSSC e 0,080ml de detergente não-iônico. Depois de preparado, manter na geladeira a 4ºC 15

16 Precauções e advertências (Ler com atençao): Reagente analítico. Para uso em investigação somente. Este produto Não está provado para uso diagnóstico ou terapêutico. As reações como a interpretação das mesmas devem ser realizadas por pessoal idôneo devidamente treinado. Todas as amostras biológicas deveriam ser tratadas como possíveis transmissores de agentes infecciosos. Deve-se evitar a exposição da amostra a ácidos ou bases em alta concentração como também ao calor extremo. Estes fatores danificam o DNA e podem causar a falha da reação de FISH. Uma vez extraída a quantidade a ser utilizada, a sonda deve ser guardada novamente a -20ºC. A falha ou omissão de qualquer dos passos do protocolo detalhado abaixo pode gerar resultados errôneos ou inaceitáveis. As soluções de enxague pós-hibridação (ver protocolo) devem ser renovadas periodicamente devido a que são propensas de contaminação. O buffer de hibridação contém formamida, um teratógeno, por isso se deve evitar o contato com a pele e as mucosas. Recomenda-se o uso de luvas e avental de trabalho durante todo o processo. É necessário controlar sempre a temperatura das soluções que se utilizam quentes. Todos os materiais perigosos devem ser descartados de acordo com as normativas da sua instituição. 16

17 Protocolo de utilização Desparafinado: Passos prévios Preparar 1 recipientes (coplin) com Buffer (tampão) de Desparafinado. Pelo menos 30 minutos antes de começar o processo de desparafinado, em um banho termostático a 90ºC. (Opcional)Incubar as preparações contendo os cortes de tecido a 58ºC durante 30 minutos como mínimo. Mergulhar os vidros no Buffer de Desparafinado a 90ºC durante minutos. Enxaguar 2 vezes em Etanol 100% 3 minutos cada vez. Deixar secar Pré-tratamento: Passos prévios Preparar um recipiente (coplin) com Buffer de Pré-tratamento. Colocar em um banho termostático a 71ºC. Antes de utilizar conferir que a temperatura interna da solução seja de 71ºC (±1ºC) Preparar um recipiente (coplin) com Pepsina Solução de trabalho. Colocar em um banho termostático a 37ºC. Antes de utilizar conferir que a temperatura interna da solução seja de 37ºC (±1ºC) Mergulhar 20 minutos as preparações em HCl 0.2N a temperatura ambiente. Enxaguar em Água destilada 3 minutos 2 vezes. Mergulhar as preparações no Buffer(tampão) de Pré-tratamento a 71ºC durante 60 minutos. Mergulhar os vidros em 2 espaços sucessivos de 2XSSC, 5 minutos em cada um. Enxaguar em Água destilada brevemente. Mergulhar as preparações em Pepsina solução de trabalho a 37ºC durante 7 a 15 minutos. Enxaguar a pepsina mergulhando as preparações em 2 espaço sucessivos de H2O destilada, 3 minutos em cada um. Desidratar em Etanol 70, 90 e 100% 2 minutos em cada um. Deixar secar completamente. Co-desnaturalização: Preparação da sonda: Descongelar a sonda, homogeneizar em Vórtex Centrifugar rapidamente Descongele o buffer(tampão) hibridização Em um tubo de PCR adicionar: 7µl de Buffer de hibridação 1µl de sonda Homogeneizar em Vórtex Centrifugar rapidamente 17

18 Revelado Co-desnaturalização: Na parte de trás da lâmina marcar a região a hibridar (os 8µl preparados hibridam uma região aproximada de 22x22mm). Adicionar a solução de sonda sobre a região marcada Colocar um coverslip/lamínula de tamanho adequado Selar as bordas do coverslip/lamínula com adesivo de contato removível Colocar a lâmina montada sobre uma superfície quente (hibridizador, prancha termostática, etc.). Em ocasiões é conveniente colocar uma gota de água sobre a chapa aquecedora e depois colocar sobre esta a lâmina montada, desta forma se consegue uma película de água entre a lâmina e a superfície quente melhorando a transferência de temperatura. Esquentar a 71ºC durante 5-15 minutos. Colocar em câmara úmida, incubar a 37ºC toda a noite. Passos prévios Pelo menos 30 minutos antes, aquecer a solução de enxague 1 a 71ºC (±1ºC) conferindo com um termômetro calibrado a temperatura dentro do recipiente. Moderar a solução de enxague 2 a temperatura ambiente. Moderar a solução de contra-corante previamente preparada (ver protocolo em anexo) à temperatura ambiente. Enxague do excesso da sonda Extrair a lâmina da câmara úmida. Tirar cuidadosamente o adesivo de contato. Mergulhar a lâmina em uma solução de 2XSSC a temperatura ambiente até que o coverslip/lamínula se solte (2 a 5 minutos). Mergulhar a lâmina no enxague 1 durante 2 minutos exatamente. Mergulhar a lâmina no enxague 2 um mínimo de 1 minuto. Drenar o excesso de líquido. Desidratar em etanol 70, 90 e 100% 2 minutos cada um. Esperar que seque completamente. Colocar sobre a região hibridada uma gota (aprox. 10µl) de contra colorante. Adicionar um coverslip/lamínula de um tamanho maior que a região hibridada. Drenar o excesso de contra colorante pressionando suave e uniformemente com papel absorvente. Eliminar possíveis bolhas de ar pressionando suavemente com a ponta de um clips. A reação está pronta para ser analisada. 18

19 Protocolo Resumido: Passo Tempo Desparafinado (Opcional)Incubação a 58ºC Mínimo 30 Buffer(tampão) Desparafinado 90º Etanol 100% x2 3 Deixar secar /// Pré-tratamento HCl 0.2N 20 H2O x2 3 Buffer(tampão) Pré-tratamento 71ºC 30 2xSSC x2 5 H2O brevemente /// Pepsina 37ºC 7-15 H2O X2 3 Etanol 70, 90, 100% 2 Deixar secar /// Co-desnaturalização-Hibridação Co-desnat 71ºC 8-15 Hibridação 37ºC Aprox. 18hs Revelado Enxague 1 71ºC 2 Enxague 2 Tº Amb Mínimo 1 Etanol 70, 90, 100% 1 Deixar secar /// Montado com Sn. Montagem /// 19