Determinação cromatográfica de riboflavina em leite
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- Felícia Botelho de Almada
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1 CROMATOGRAFIA Determinação cromatográfica de riboflavina em leite Marcela Segundo & Marcelo Osório FFUP MCQ MIA 2013/2014 Pág. 1
2 Introdução As vitaminas são nutrientes essenciais para a manutenção de uma boa saúde, estando presentes em vários alimentos. Contudo, nem sempre a quantidade existente nos alimentos é suficiente, existindo diversos produtos alimentares enriquecidos com vitaminas. Deste modo é necessário que quer os fabricantes quer as autoridades reguladoras possuam metodologias analíticas capazes de quantificar o teor vitamínico dos vários produtos alimentares existentes no mercado. Neste trabalho experimental irá ser efetuada a quantificação de riboflavina (vitamina B2), uma das mais importantes vitaminas hidrossolúveis, numa amostra de leite para recémnascidos. Devido à complexidade da matriz, para se proceder a esta determinação é necessário um processo de enriquecimento do analito e remoção da matriz prévio à determinação cromatográfica. Assim, a preparação da amostra será realizada através da utilização de um sistema de vácuo (figura 1) que incorpora até doze cartuchos de extração em fase sólida (SPE, do inglês, solid-phase extraction ), que contém uma fase sólida seletiva, constituída por um polímero de impressão molecular (MIP, do inglês, molecular imprinted polymer ). Este material possibilita a extração seletiva da riboflavina devido à complementaridade entre esta molécula e as cavidades impressas no polímero que está contido no cartucho. O procedimento de extração em fase sólida compreenderá quatro etapas, às quais se seguirá a determinação cromatográfica: 1 Condicionamento da fase sólida (1 ml metanol + 1 ml água) 2 Carregamento da amostra (1 ml leite) 3 Remoção da matriz (1 ml água) 4 Eluição dos analitos da fase sólida (3 1 ml 1% ácido acético em acetonitrilo) Figura 1. Sistema de vácuo para extração em fase sólida (reproduzido de Supelco ). Marcela Segundo & Marcelo Osório FFUP MCQ MIA 2013/2014 Pág. 2
3 No que respeita à determinação cromatográfica, a utilização de uma coluna monolítica que possui uma estrutura rígida e porosa (figura 2A), possibilita a utilização de caudais mais elevados e pressões mais baixas comparativamente às colunas convencionais empacotadas com micropartículas (figura 2B), permitindo a execução da corrida cromatográfica para o analito em estudo em aproximadamente seis minutos. Figura 2. A) Imagem de microscopia electrónica da estrutura porosa das colunas monolíticas; B) Comportamento do fluxo da fase móvel numa coluna convencional empacotada e numa coluna monolítica (reproduzido de Phenomenex ). Material, equipamento e reagentes Cromatógrafo: bomba, detector de fluorescência, coluna cromatográfica (Chromolith 100 x 4,6 mm), pré-coluna, fase móvel metanol (15% v/v), ácido acético (2,4% v/v), trietilamina (0,5% v/v) e ácido octanossulfónico (5 mm). Sistema de vácuo: bomba de vácuo, cartuchos com fase sólida, tubos de vidro, câmara de vidro, acetonitrilo, metanol, água ultra-pura. Marcela Segundo & Marcelo Osório FFUP MCQ MIA 2013/2014 Pág. 3
4 Procedimento Preparação do cromatógrafo: 1 Proceda à filtração por vácuo da fase móvel através de uma membrana de 0,22 µm. 2 Desgaseifique todas as soluções em banho de ultra-sons durante 15 minutos. 3 Utilizando o software do equipamento ajuste as seguintes condições de eluição: caudal (2 ml min -1 ), duração da corrida cromatográfica (3 minutos) e pressão máxima (25 MPa). Ajuste igualmente o detector de fluorescência para o comprimento de onda de excitação de 268 nm e de emissão para 516 nm, com um ganho de 10x, resposta standard (STD) e atenuação 8. 4 Purgue a bomba. 5 Aumente progressivamente o caudal da bomba até 2 ml min -1 utilizando o comando manual da bomba. 6 Carregue a rotina (acquisition sequence) riboflavina_aq_2 e aguarde até obter uma linha de base estável. 7 No computador que controla o cromatógrafo prima o botão start run. 8 Proceda à injeção dos padrões, registe os valores correspondentes aos tempos de retenção e respetivas áreas do pico. Preparação da amostra: 1 No equipamento ligado à bomba de vácuo, coloque o cartucho de SPE no cimo de uma das válvulas de controlo de fluxo e feche a válvula (rodar no sentido dos ponteiros do relógio). 2 Abra a válvula de vácuo (sentido contrário ao dos ponteiros do relógio). 3 Ligue a bomba de vácuo. 4 Adicione 1 ml de metanol (acondicionamento do cartucho). 5 Rode o cartucho ¼ de volta (abertura da válvula de fluxo). 6 Feche lentamente a válvula de vácuo (rodar no sentido dos ponteiros do relógio) até o manómetro indicar 10 Hg. Quando o nível do solvente chegar junto da fase sólida feche a válvula de fluxo. 7 Abra a válvula de vácuo. 8 Repita os passos 4-7 utilizando água em vez de metanol. 9 Retire o tubo e despeje o conteúdo e volte a colocar o suporte no interior da câmara de vidro. 10 Coloque a amostra (1 ml) e feche a válvula de vácuo para proceder à aspiração da amostra (máximo de 20 Hg). 11 Repita o passo Proceda à remoção da matriz repetindo os passos 4-7, adicionando 1 ml de água. 13 Repita o passo 9. Marcela Segundo & Marcelo Osório FFUP MCQ MIA 2013/2014 Pág. 4
5 14 Fechando a válvula de vácuo, proceda à secagem da fase sólida durante 10 minutos. 15 Retire o tubo de vidro e substitua-o por outro tubo limpo. 16 Proceda à eluição dos analitos repetindo os passos 4-7, adicionando 3 1 ml 1% ácido acético em acetonitrilo (v/v). Aplique uma leve corrente de vácuo entre cada uma das porções de eluente usadas. 17 Retire o tubo que contém o eluato. Evapore à secura e reconstitua com 1000 µl de fase móvel. 18 Proceda à injeção em triplicado do eluato no cromatógrafo, após diluição se necessário. ATENÇÃO: Nunca retire a cobertura do sistema ou remova os cartuchos sem repor previamente a pressão atmosférica. REGISTO DOS DADOS Dados experimentais obtidos para os padrões e amostra com pré-concentração do analito (injeção através do sistema). Conc / mg L -1 Área do pico Amostra Marcela Segundo & Marcelo Osório FFUP MCQ MIA 2013/2014 Pág. 5
6 RESULTADOS Com os dados obtidos: Proceda ao traçado gráfico Área de pico versus concentração (mg L -1 ). Determine (matematicamente) a concentração de riboflavina existente no eluato reconstituído e na amostra inicial. Calcule a percentagem de recuperação associada ao procedimento de extração, assumindo que a amostra analisada contém o teor de riboflavina indicado no rótulo. Marcela Segundo & Marcelo Osório FFUP MCQ MIA 2013/2014 Pág. 6
7 Discussão dos resultados Em função dos dados obtidos experimentalmente e dos cálculos efectuados, comente as seguintes afirmações: 1. A existência de uma etapa de pré-concentração dos analitos permite que o limite de detecção da metodologia seja mais baixo. 2. A existência de uma etapa de pré-concentração dos analitos origina um aumento de sensibilidade da metodologia. Marcela Segundo & Marcelo Osório FFUP MCQ MIA 2013/2014 Pág. 7
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