Bioquímica. Purificação de proteínas

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Wilson Raminhos Laranjeira
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1 Bioquímica Purificação de proteínas

2 Estratégia geral - Liberação da proteína do material biológico - Podem ser separados por fracionamento celular - Pode-se separar proteínas por características: Solubilidade Tamanho Carga elétrica Afinidade - Normalmente o primeiro passo de separação da proteína bruta é a adição de sais (sulfato de amônio) ou solventes orgânicos miscíveis com água Separação por diferença de solubilidade

Carga elétrica Afinidade - Normalmente o primeiro passo de separação da proteína bruta é a

3 Solubilidade da β-lactoglobina em função do ph em diferentes concentrações de NaCl

4 Estratégia geral - Devem-se seguir técnicas para separação parcial ex. Cromatografia Eletroforese - Faz-se importante métodos para detectar e quantificar a proteína de interesse - Por tecnologias de DNA recombinante é possível obter a proteína desejada em maiores quantidades

detectar e quantificar a proteína de interesse - Por tecnologias de

5 Centrifugação diferencial

6 Densidade e coeficiente de sedimentação

7 Centrifugação por gradiente linear Formação do gradiente de densidade ex. Alta d. 20% sacarose Baixa d. 5% sacarose Pode ser realizada em condições não desnaturante, preservando a estrutura nativa

8 A diálise pode separar moléculas grandes

9 Dextrana Cromatografia de exclusão - filtração em gel

10 Cromatografia de exclusão -filtração em gel

11 Material comumente utilizado na filtração em gel

12 Cromatografia de troca iônica Moléculas com a mesmo sinal de carga da resina selão eluídas primeiramente escolhe-se o ph e a concentração salina desejada

13 Cromatografia de troca iônica

14 Cromatografia por afinidade Muitas proteínas ligam-se específica e não-covalentemente a certas moléculas (enzimas, hormônios, anticorpos) - 1o: ligar a molécula que a proteína tem afinidade a uma matriz insolúvel (ex. Agarose) - 2o: passar a proteína (será adsorvida) - 3o: Eluir a proteína com adição concentrada de ligante

ligar a molécula que a proteína tem afinidade a uma matriz insolúvel (ex.

15 High-Pressure Liquid Chromatography

16 High-Pressure Liquid Chromatography

17 High-Pressure Liquid Chromatography (HPLC) Filtração em gel por HPLC define individualmente as proteínas devido sua grade resolução: (1) thyroglobulin (669 kd) (2) catalase (232 kd) (3) bovine serum albumin (67 kd) (4) ovalbumin (43 kd) (5) ribonuclease (13.4 kd)

resolução: (1) thyroglobulin (669 kd) (2) catalase (232 kd) (3)

18 Eletroforese Em um mesmo ph as proteínas apresentarão cargas diferentes A aplicação de um campo elétrico poderá separá-las Uso de um meio sólido: papel ou gel (evita movimentação por convecção)

19 Eletroforese em papel -Aplicação da em tira de papel ou acetato de celulose - As extremidades são imersas em tampão Distintos reservatórios - Aplica-se uma ddp específica - As proteínas migram em direção à carga oposta em velocidades proporcionais às suas cargas - Revelação por coloração específica

Aplica-se uma ddp específica - As proteínas migram em direção à carga

20 Eletroforese em papel

21 Eletroforese em gel Muito utilizado para mistura de proteínas ou outras macromoléculas Gel suporte: Agarose ou poliacrilamida Podem ter porosidade variável Separam por carga e por tamanho As proteínas menores migram mais rápido que as maiores, formando bandas Visualização por coloração específica

22 Eletroforese em gel SDS-Page Uso da Poliacrilamida em presença de SDS - O SDS liga-se a radicais hidrofóbicos das proteínas Ocorre a desnaturação - Padrão geral: uma molécula SDS (dodecil sulfato de sódio) a cada dois resíduos de aminoácido - Atribui carga negativa a proteína, mascarando a carga intrínseca da proteína nativa

23 Eletroforese em gel

24 Eletroforese em gel

27 Eletroforese (SDS-Page) bi-dimensional Separação pelo ponto isoelétrico

28 Eletroforese (SDS-Page) bi-dimensional 1) Separação pelo ponto isoelétrico Baixo ph + Baixo ph + Alto ph _ Alto ph _

29 Eletroforese (SDS-Page) bi-dimensional Proteínas de um mesmo pi são separadas Por seu tamanho Primeira dimensão pi Segunda dimensão tamanho

30 Gel de eletroforese bi-dimensional

31 Análise eletroforese SDS-Page das etapas de purificação de uma proteína

33 Determinação da Massa ESPECTROMETRIA DE MASSA COM ELETRONEBULIZAÇÃO - Espectrometria de massa com nebulização: electrospay) - A amostra de proteína em solvente ácido volátil é nebulizada em espectrofotômetro de massa - Na câmara de vácuo As gotículas evaporam deixando as moléculas desnudadas e não fragmentadas de proteínas com múltiplas cargas positivas - As moléculas são aceleradas em campo elétrico e desaceleradas com um campo magnético

34 MALDI-TOF Mass Spectrometry. (1) A amostra de proteína é ionizada (2) Um campo elétrico acelera os íonn para o detector (3) Os íons menores chegam primeiro (4) O pulso do laser de ionização também desencadeia um relógio que mede o tempo da trajetória dos íons (TOF)

35 Espectro de massa (MALDI-TOF) da Insulina e β-lactoglobulina

36 Detecção de proteínas por immunoblotting

37 Como conhecer a estrutura de proteínas Cristalografia de Raios X Imagem da difração de raios X da proteína - É necessário obter o cristal da proteína Técnica conhecida por cristalografia - Inicio com amostra concentrada de proteína - Formação do cristal (por agentes químicos) - No cristal: água reduzida/ moléculas ordenadas CADA PROTEÍNA POSSUÍ UM PADRÃO DE DIFRAÇÃO DE RAIOS X

38 Cristalização da Mioglobina Sulfato de amônio

39 Cristalografia de Raios X

40 Cristal de Mioglobina O salting ou lento favorece a formação de cristais

41 Raio X - Cristal de Mioglobina

42 Seção do mapa de densidade de elétrons da mioglobina

43 Como conhecer a estrutura de proteínas RMN Ressonância Magnética Nuclear A proteína fica em solução A solução é colocada no espectrômetro de ressonância A molécula é colocada sobre um forte campo magnético São aplicados pulsos de radiofrequência que são absorvidos pelos núcleos dos átomos da molécula de proteína exitando-os Quando os núcleos retornam a forma basal, emitem de volta radiofrequências específicas de cada um dos átomos

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