Objetivos. Critérios de Avaliação. Outline da disciplina PREPARO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE DE COMPOSTOS ORGÂNICOS
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- Felícia Stachinski Camilo
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1 PPGCF e PPGQ da UNIFAL-MG Disciplina QUI022 PREPARO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE DE COMPOSTOS ORGÂNICOS Objetivos Fornecer aos alunos do curso de PPGQ e PPGCF conhecimentos básicos sobre as principais técnicas e estratégias de preparo de destinadas à análise de compostos orgânicos. Prof. Dr. Eduardo C. Figueiredo eduardocf@unifal-mg.edu.br Outline da disciplina Introdução ao Preparo de Extração líquido-líquido Microextração em fase líquida Extração por fluido supercrítico Extração por Soxhlet Extração em fase sólida Microextração em fase sólida Extração sortiva em barra de agitação Microextração em sorbente empacotado Preparo de empregando polímeros de impressão molecular Preparo de empregando meios de acesso restrito Filtração e diálise Headspace QuEChers Extração por micro-ondas Extração por ultrassom Column swiching Microextração em fase sólida no capilar Critérios de Avaliação Prova teórica (P): 10 pontos Relatórios de aulas práticas (R): 5 pontos Trabalho (T): 10 pontos Nota final = (P+R+T)/2,5 Datas: Entrega do trabalho: Prova teórica: Resultado final: Por quê é necessário o preparo da amostra?? Amostra coletada HPLC, LC-MS/MS,... Etapas do procedimento analítico entrada Informação inicial saída Resultado analítico processo Preparo de amostra Amostra = não apropriada para a análise...por QUE?? Muito suja contém outros componentes na matriz que interferem com a análise Muito diluída analitos não estão concentrados suficientemente para perimitir a detecção Matriz não compatível ou perigosa para a coluna/sistema cromatográfico, ou outras metodologias analíticas Amostragem Preparo de amostra Identificação e/ou quantificação HPLC; GC; CE; MS Análise dos dados 1
2 Amostragem Coleta de representativas do material a ser analisado Fontes de erro em cromatografia Preparo das Identificação e/ou quantificação Análise dos dados Eliminação de interferentes e isolamento dos analitos de interesse Separação, identificação e quantificação dos analitos Métodos algébricos/ estatísticos para estimar quantidades e incertezas Contaminação (4%) Colunas (11%) Operador (19%) Introdução da amostra (6%) Cromatografia (7%) Integração (6%) Instrumento (8%) Calibração (9%) Avaliação dos resultados Decisão sobre ações a serem tomadas em face aos resultados Processamento da amostra (30%) Erros X Equívocos Erros sempre existem e são tratados estatísticamente Equívocos provem da falta de conhecimento de analistas destreinados, devem ser banidos.... em laboratórios de química analítica, o preparo de amostra não é reconhecido como uma etapa importante em todo o esquema analítico e freqüentemente é dado para os analistas menos treinados... Tempo gasto na análise Processamento da amostra (61%) Tratamento dos dados (27%) Coleta (6%) Análise (6%) Método idealizado de preparo de amostra Analitos orgânicos PREPARO DE AMOSTRAS: FUNDAMENTOS analito interferente matriz Volume da amostra V am contendo n gramas de analito Concentração = C am Separar analitos quantitativamente dos interferentes da matriz Processo suave n g de analito concentrados em um volume V final V final << V am C final >> C am Identificar/ quantificar 2
3 Método idealizado de preparo de amostra Analitos inorgânicos (metais) analito interferente matriz Volume da amostra V am contendo n gramas de analito Concentração = C am Queimar a matéria orgânica (matriz) Processo drástico n g de analito concentrados em um volume V final V final << V am C final >> C am A M OS T R A Identificar/ quantificar Finalidades do preparo de 1. Purificação (clean up) da amostra - eliminação a matriz e interferentes que possam danificar o sistema cromatográfico ou que possam interferir na identificação e/ou quantificação dos analitos. 2. Pré concentração dos analitos Benefícios do preparo de 1. Tornar a matriz compatível com a técnica de análise. 2. Proteger o sistema e coluna cromatográfica de contaminação por partículas e material de elevado peso molecular: - aumento da vida útil da coluna; - menor gasto com manutenção; - menos problemas operacionais. Benefícios do preparo de 3. Remover interferências: - simplificando a extração; - diminuindo o tempo de análise; - aumentando a sensibilidade. 4. Concentrar componentes de interesse: - aumentando a sensibilidade (detectabilidade); - aumentando a reprodutibilidade. Preparo de biológicas Materiais biológicos são complexos: contêm proteínas, sais, bases, lipídeos, carboidratos e compostos orgânicos, às vezes similares quimicamente aos analitos. Analitos: presentes em quantidades muito pequenas na amostra e ainda ligados às proteínas. COMO SEPARAR ANALITOS, MATRIZ E INTERFERENTES? 1. Propriedades físico-químicas dos constituintes da amostra - analitos, interferentes e matriz são voláteis? - polares? apolares? - amostra: sólida? líquida? gasosa? - analitos são quimicamente e/ou termicamente estáveis? 2. Concentração de analitos e interferentes na amostra - Quais as concentrações esperadas de analitos e de interferentes na amostra? 3
4 COMO SEPARAR ANALITOS, MATRIZ E INTERFERENTES? Preparo de 3. Características da instrumentação disponível -O detector é sensível? seletivo? específico? para o analito - Algum componente do sistema é incompatível com constituintes da amostra ou reagentes usados? 4. Requisitos técnico-gerenciais - Existe metodologia oficial a ser seguida? - Quantas serão analisadas por dia? - Existe pessoal capacitado para cumprir estas demandas? Quesitos para um eficiente preparo da amostra: a) Perda mínima da amostra e boa recuperação do analito; b) Interferentes da amostra devem ser removidos eficientemente; c) O procedimento deve ser feito de forma conveniente e rápida; d) O custo da análise deve ser baixo. 1) Exaustivas Preparo de : tipos de técnicas O objetivo é a remoção completa dos analitos da matriz e sua transferência para a fase extratora. - técnicas flow trough (SPE), extração em fluido supercrítico (SFE), Soxhlet Trabalho aqui Extração de 100% Na fase extratora Na amostra Preparo de : tipos de técnicas 2) Não-exaustivas baseadas em princípios de equilíbrio? 2.1 Pequeno volume da fase extratora: SPME, LPME 2.2 Baixa constante de distribuição amostra/fase extratora: headspace Precisa mesmo ser no equilíbrio? Técnicas de preparo on-line Trabalho aqui Na amostra Na fase extratora Preparo de x calibração???? Calibração para análise de biológicas? Padrão interno!? O que fazer??? plasma bco padrão de fármaco plasma de paciente Como calibrar?? Orgânicos x Inorgânicos = ou? 4
5 Curva ideal Preparo de amostra Análise química Desproteinização requer: (a) temperaturas elevadas (b) alteração da força iônica ou osmótica ou do ph; (c) agentes orgânicos de precipitação; (d) enzimas proteolíticas. VANTAGENS (a) Simplicidade (b) Baixo custo (c) Facilidade de automação PROBLEMAS - precipitação incompleta das proteínas (e algumas globulinas podem permanecer no sobrenadante e passarem para o sistema de detecção); - diluição da amostra (mais usado para concentrações mais elevadas de analitos); - geração de picos no CLAE ou interferência na leitura espectrofotométrica devido ao agente precipitante usado. Teoria de precipitação Análise de fármacos em biológicas: Leite, soro, plasma, urina,... Proteoma: precipitação seletiva de proteínas de cereais trangênicos,. Estruturas primária, secundária, terciária e quaternária Interação com íons, solventes, compostos orgânicos,... Principais aplicações Análise de toxicantes em alimentos: MP, micotoxinas, inceticidas,... Análise de proteínas em biológicas: Leite, soro, plasma, urina,... As interações podem ocorrer na superfície ou no interior. Qualquer modificação na estabilidade da proteína no meio pode causar precipitação 5
6 Teoria de precipitação Teoria de precipitação Complexidade na estrutura + Complexidade da amostra Dificuldade em explicar mecanismos de precipitação Fatores que estabilizam as proteínas Ligações íon-íon Ligações íon-dipolo Ligações de hidrogênio Ligações dipolo-dipolo Interações hidrofóbicas Natureza do meio Processos de precipitação Modificação do ph Modificação da força iônica Modificação da temperatura Adição de sais Adição de solventes (acetona, metanol, acetonitrila,..) Adição de cátions (Zn 2+, Cd 2+, Ba 2+ ) Adição de ânions (picrato, tungstato, molibidato,...) Alguns processos causam desnaturação das proteínas Plasma Agente precipitante Método Agentes precipitantes mais comuns empregados em biológicas Agitação Centrifugação Coletar Sobrenadante Análise Acetona, metanol, etanol, acetonitrila, ácido trifluoracático, ácido tricloroacético, acido tricloroacético, dentre outros Principal mecanismo de precipitação Mudança na camada de solvatação (água) das proteinas 6
7 Tratamento prévio de HIDRÓLISE DE CONJUGADOS (a) Específica ou enzimática, onde são utilizadas enzimas como as β-glicuronidases e as aril-sulfatases Tratamento prévio de HIDRÓLISE DE CONJUGADOS (a) Específica ou enzimática, onde são utilizadas enzimas como as β-glicuronidases e as aril-sulfatases Fontes: Helix pomatia (tbém sulfatases) e a Patella vulgata, Helix aspersa e a Escherichia coli. - mais lenta, porém, menos vigorosa e mais seletiva, e não degrada os analitos; - exige que a atividade da enzima seja avaliada periodicamente, através do estudo de sua eficiência no processo de hidrólise; além disto, a atividade da enzima pode ser inibida por componentes da matriz. Tratamento prévio de HIDRÓLISE DE CONJUGADOS b) Não-específicos, utilizando-se a hidrólise ácida ou alcalina. - utiliza condições extremas de ph e de temperatura; - formação de produtos que interferem na extração e derivatização, ou no perfil cromatográfico dos analitos. 7
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