Métodos Físicos de Análise - ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA / VISÍVEL MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE

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1 Métodos Físicos de Análise - ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA / VISÍVEL Prof. Dr. Leonardo Lucchetti Mestre e Doutor em Ciências Química de Produtos Naturais NPPN/UFRJ Depto. de Química de Produtos Naturais Farmanguinhos Fiocruz Docente do Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde Fiocruz Docente do Curso de Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica Farmanguinhos Fiocruz Diagrama de Energia: a radiação compreendida no UV-vis está entre nm. Abaixo de 200nm praticamente todas as moléculas orgânicas absorvem. 1

2 Espectrofotometria de Absorção Molecular Região do visível/uv e IV Absorbância Transmitância Absortividade Absortividade molar Espectro de absorção 2

3 Espectrofotometria de Absorção Molecular Aquisição de espectros e/ou quantificação fotométrica curva-padrão (curva de calibração) comparação com absorção de solução-padrão Vantagens e desvantagens Devido à pobreza de informações, espectros de absorção UV-vis tem uso limitado na identificação positiva de substâncias Escolha do solvente (crítico no UV) Indicativo de grupos funcionais (proteínas, DNA, substâncias aromáticas, carbonilas etc.) Grande ferramenta se acoplada à cromatografia Análise quantitativa Ampla aplicação em sistemas orgânicos e inorgânicos Grande disponibilidade instrumental e acessível a vários laboratórios Sensibilidade típica em torno de 10-5 mol/l, podendo atingir até 10-7 mol/l Seletividade relativamente alta Boa exatidão: ~ 1 3% Facilidade na obtenção, tratamento e armazenamento dos dados 3

4 Determinação da concentração Curva de calibração Observação da lei de Beer Determinação experimental do ε Escolha e preparo do branco (referência) é fundamental Composição da amostra: teor e qualidade dos concomitantes Presença de equilíbrios secundários Em casos extremos, a reprodução da amostra é praticamente inviável A amostra passa a ser usada como referência! método da adição de padrão (analito) Guia simplificado para análise de espectros UV A) Banda única de intensidade média - baixa (ε = M -1 cm -1 ) a λ < 220nm É geralmente indicativa de uma transição n σ. Aminas, alcoóis, éteres e tióis contam-se entre as estruturas possíveis, desde que os eletrons não ligantes não façam parte de um sistema conjugado. Neste caso, será boa prática procurar bandas N-H, O-H, C-O e S-H no espectro de IV. Exceção: A transição n π em grupos CN aparece nesta região. No entanto, é fraca (ε < 100) e o grupo CN identifica-se facilmente no IV. B) Banda única de fraca intensidade (ε = M -1 cm -1 ) a 250 < λ < 360nm, sem absorção significativa a λ menor ( nm) É geralmente indicativa de uma transição n π. Como não há absorção a comprimentos de onda superiores trata-se de um cromóforo simples, tipicamente não conjugado, em geral contendo um átomo de O, N, ou S. Exemplos: C=O, C=N, N=N, -NO 2, -CO 2 R, -CO 2 H, CONH 2. O IV e o RMN são também neste caso excelentes meios de diagnóstico definitivo. Guia simplificado para análise de espectros UV C) Duas bandas de intensidade média (ε = M -1 cm -1 ), ambas com λ max > 200 nm Esta situação é geralmente indicativa da presença de um sistema aromático. Se for esse o caso, poderá ser observada uma estrutura mais fina na banda de maior comprimento de onda em solventes não polares. Quando os anéis aromáticos são substituídos, a absortividade molar é superior a , sobretudo se o substituinte aumentar a extensão do sistema conjugado. Nos compostos aromáticos polinucleares (PAHs) e heterocíclicos aparece uma terceira banda a cerca de 200nm. D) Bandas de intensidade elevada (ε = M -1 cm -1 ) a λmax > 210nm Podem corresponder a cetonas α,β-insaturadas, dienos ou polienos. Quanto mais extenso for o sistema conjugado, maior é o comprimento de onda do máximo de absorção. 4

5 Guia simplificado para análise de espectros UV E) Cetonas, ácidos, ésteres, amidas e outros compostos simples contendo sistemas π e eletrons não ligantes Surgem duas bandas de absorção: n π (λ max > 300nm, intensidade baixa) e π π (λ max < 250nm, intensidade elevada). Em sistemas conjugados (ex.enonas) a banda π π sofre um desvio batocrômico e aumenta de intensidade, podendo obscurecer a banda n π. F) Compostos fortemente corados (i.e., com absorção no visível) Nestes casos poderá existir um sistema conjugado longo ou um cromóforo policíclico aromático. Os compostos benzenoides podem ser corados se tiverem substituintes com conjugação ao sistema aromático. Os compostos não aromáticos requerem em geral pelo menos 4 5 cromóforos conjugados para ocorrer absorção na zona do visível. No entanto, alguns compostos simples com grupos nitro, azo, nitroso, α- diceto, polibromo e poliiodo podem ser corados. Procedimento prático Seleção do comprimento de onda máximo do pico máxima sensibilidade mínimo desvio da lei de Beer ε ~ constante Variáveis que influenciam a absorbância solvente ph da solução temperatura força iônica presença de interferentes Manuseio das cubetas (células) par casado de cubetas (calibração) limpeza com tecido embebido em metanol grau espectroscópico 5

6 Terminologia Deslocamento batocrômico: para maior λ (influência de solventes ou de um grupo cromóforo ou auxócromo que se junta ou retira à molécula de referência Deslocamento hipsocrômico: para menor λ Deslocamento hipercrômico: para maior absorção (função de concentração e espessura da solução) Deslocamento hipocrômico: para menor absorção (função de concentração e espessura da solução) Grupos cromóforos: Grupos funcionais que absorvem radiação na faixa de trabalho do UV-VIS. Grupos auxócromos: Grupos saturados que, quando ligados a um cromóforo, modificam o comprimento de onda e a intensidade da absorção 6

7 Alguns cromóforos Regras de Fieser-Woodward (dienos e polienos conjugados) Regras de Fieser-Woodward (dienos e polienos conjugados) 7

8 Regras de Fieser-Woodward (carbonilas conjugadas) Regras de Fieser-Woodward (cabonilas conjugadas) Espectrofotometria UV Produto da interação de matéria e energia Relação direta e proporcional com a concentração Estrutura molecular define a frequência de maior absorção 8

9 Espectrofotometria UV Energia incidente será sempre mais intensa que a emergente, e a atenuação pode ser atribuída a: - reflexões da interface entre o ar e a parede da cubeta e entre a solução e a parede da cubeta - dispersão por partículas presentes na solução - absorção da energia pelo meio Espectrofotometria UV Absortividade (a): quociente entre absorbância (A) e o produto entre concentração (c), expressa em g/l e caminho ótico (b), expresso em cm Absortividade molar (E): quociente entre absorbância (A) e produto entre concentração (c), expressa em mol/l e caminho ótico (b), expresso em cm Extinção específica (E 1% ): quociente entre absorbância e produto entre concentração (c), expressa em g/100ml e caminho ótico (b), expresso em cm 9

10 Leis da Fotometria Lei de Lambert: quando a energia radiante atravessa uma solução, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente em relação ao aumento da espessura atravessada Lei de Beer: quando a energia radiante atravessa uma solução, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com o aumento da concentração da solução Daí... Um pouquinho de fórmulas... 10

11 Requisitos para análises: amostragem - Soluções diluídas: 0,4mg/mL ou menos, dependendo do εmáx no λmáx - Solventes devem ser transparentes na faixa de comprimento de onda a ser analisada: não se pode obter o espectro de diferença de um solvente que absorve muito pois, nestas condições, a quantidade de luz que atravessa a amostra é mínima Aplicações do UV/vis em análises forenses 1- Como técnica acoplada ao CLAE (detecção); 2- Análise de tintas, corantes, explosivos, alimentos, bebidas etc; 3- Peritagens e análises in loco; 5- Análise de marcadores biológicos. Instrumentação UV-vis 11

12 Alguns cromóforos comuns Alguns cromóforos comuns: alquenos conjugados Alguns cromóforos comuns: carbonilas conjugadas 12

13 Alguns cromóforos comuns: benzenos monossubstituídos Exemplos de espectros de absorção Fatores que afetam as propriedades de absorção de um cromóforo ph O ph do solvente determina o estado de ionização de cromóforos ionizáveis (protonação e desprotonação pelo H + ) Polaridade (depende da estrutura do cromóforo e do tipo de transição) Para cromóforos polares, é frequente (especialmente se a molécula contém O, N, ou S) que λ máx ocorra para um comprimento de onda menor em solventes polares hidroxílicos (H 2 O, álcoois) que em solventes não polares. Efeitos da orientação Características geométricas (simetria, organização) frequentemente têm fortes efeitos sobre εmáx. O melhor exemplo é o hipocromismo de ácidos nucléicos. 13

14 QUESTÕES DE CONCURSOS 5- Com relação à espectroscopia de absorção no ultravioleta (UV), assinale as alternativas abaixo como CERTO ou ERRADO. (Perito Criminal/ PC/ ES 2007). a) A eficiência de absorção de energia da luz para cada cromóforo está relacionada com seu peso molecular. b) Ligações peptídicas absorvem no UV de 300 a 400 nm. c) Os métodos de espectroscopia em UV podem ser empregados na avaliação da estrutura de proteínas. d) A absorção molar de um substrato cromóforo raramente se altera na ligação com a proteína. e) O sistema éxciton está relacionado com a estabilidade de elétrons. (PERITO CRIMINAL ENG.QUÍMICA SSP PERITO CRIMINAL NÍVEL SUPERIOR SSP/PE

15 A espectrometria na região do visível é uma técnica bastante utilizada para análise quantitativa de diversos compostos orgânicos de interesse na área de toxicologia. Indique dentre as alternativas abaixo a que NÃO se refere a essa técnica: a) a espectrometria baseia-se na absorção da radiação pela amostra, absorção esta que é proporcional à concentração; b) para quantificação escolhemos a faixa linear, segundo a lei de Lambert-Beer; c) comprimento de onda selecionado entre 200 e 400nm; d) o comprimento de onda selecionado entre 400 e 750nm; e) no espectrofotômetro a leitura pode ser obtida sob a forma de transmitância ou absorbância. (PERITO LEGISTA TOXICOLOGIA PF) PERITO CRIMINAL NÍVEL SUPERIOR SSP/PE