Cromatografia Líquida

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1 Analítica V: Aula 10 Cromatografia Líquida ATENÇÃO À SEQUENCIA DAS PRÁTICAS: Para a Prática de 08/11 cada grupo deverá trazer: - um pacote de M&M (embalagem marrom, de 104 g) - um par de luvas de procedimento Prof. Rafael Sousa Departamento de Química - ICE rafael.arromba@ufjf.edu.br Notas de aula:

2 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (CL) em Inglês Grego Kroma = cor Graphia = escrever : M Tsweet coloriu uma coluna de CaCO 3 com uma mistura de pigmentos vegetais

3 Início da cromatografia Éter de petróleo (solvente) CaCO 3 (s) (adsorvente) Mistura de substâncias (amostra) Tempo Diferentes interações Adsorvente / solvente Mistura de substâncias coloridas foi separada (caroteno, clorofila e xantofila)

4 Princípio Interação diferenciada dos componentes da amostra com uma FASE ESTACIONÁRIA e uma FASE MÓVEL sólido ou líquido líquido ou gás Crom. líquida (CL) Crom. gasosa (CG) FASE ESTACIONÁRIA Sólido líquido sobre um sólido CONFIGURAÇÃO EXPERIMENTAL PLANAR COLUNA

5 Ex de interação analito - FE Equilíbrio FE FM (partição na crom. Líquido-líquido) Diferente para as substâncias diferentes Polaridade Tamanho

6 Cromatografia planar Suporte da FE: papel especial OU sólido finamente dividido FM (capilaridade) separação Fácil realização Análises quali e quantitativas Baixo custo Baixas - Resolução e - Repetibilidade - Reprodutibilidade

7 Cromatografia em coluna Convencional (Clássica) Líquida de alta eficiência (CLAE) Solvente Fase estacionária Suporte inerte - Colunas verticais (FM - gravidade) - Análises quali e quantitativas - Baixo custo - Baixa frequência - Desempenho regular - Colunas e FM altas pressões - Análises quali e quantitativas - Desempenho analítico satisfatório - Rapidez analítica, automação - Custo elevado...

8 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) - Amplamente utilizada - Dentre as modalidade mais importantes - Vem se desenvolvendo desde a década de 70 NÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTA Necessidade de calibração RESULTADO : Amostras x Padrões (cromatograma)

9 Subdivisões da CLAE Tipo de FE (MECANISMO de separação) Cromatografia líquido-sólido: CLS FE é um sólido o (adsorção) Cromatografia líquido-líquido: líquido: CLL FE é um líquido que recobre um sólido (partição) CLFL Cromatografia líquida de fase ligada: CL FE é um líquido ligado quimicamente a um suporte sólido (partição)

10 Cromatografia por exclusão: CE FE é um gel que recobre um sólido com porosidade controlada Aplicação importante: análise de polímeros (GPC) Cromatografia de troca iônica: CTI FE sólida contém grupos NR 3+ (para troca aniônica) ou grupos SO 3- (para troca catiônica) Determinação de compostos de caráter iônico (aminoácidos, ânions inorgânicos, íons metálicos, etc)

11 Cromatografia por afinidade: CA FE possui substâncias como enzimas e antígenos: interação seletiva com proteínas s e anticorpos Cromatografia quiral: CQ FE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagir seletivamente com compostos quirais PARA CASA: Pesquisar duas substâncias que são determinadas por CA e duas que o são por CQ

12 Separação e Sinal analítico FM FM FM FM FM FM + componente separado Sinal Tempo de retenção Cromatograma

13 Entendendo o cromatograma Diferentes espécies SAEM DA COLUNA em tempos diferentes: tr (tr= tempo de retenção medida em função do tempo) Resposta do detector sacarina aspartame benzaldeído Informações quali e quantitativas Pouca interação Tempo de retenção Muita interação

14 Análise quantitativa Quantidades iguais de substâncias diferentes geram picos cromatográficos com áreas diferentes Necessidade de calibração: Relaciona-se as áreas dos picos com as concentrações Análise de PADRÕES e AMOSTRAS nas MESMAS CONDIÇÕES

15 Configuração instrumental Componentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta eficiência: Detector Coluna cromatográfica Reservatório de FM Registrador Válvula de amostragem Sistema de bombeamento Cada componente: função no processo analítico

16 Reservatório de FM Sistema de bombeamento Válvula de amostragem Coluna cromatográfica Detector Registrador frasco de plástico ou vidro FM Água + Solvente(s) orgânico(s) n-hexano Acetonitrila Metanol Metil-t-butil-éter Clorofórmio Diclorometano Tetrahidrofurano 2-propanol CUIDADOS eliminação de partículas maiores que 5 µm retirada de gases Dissolvidos Ultrasom ou Borbulhamento gases inertes USO (preparação diária)

17 Reservatório de FM Sistema de bombeamento Válvula de amostragem Coluna cromatográfica Detector Registrador Impulsionar a FM para dentro da coluna com vazão constante e reprodutível BOMBAS DE ALTA PRESSÃO Composição constante (eluição ISOCRÁTICA) Composição variável (eluição por GRADIENTE) Amostras complexas Compostos de polaridade muito diferente Bomba de seringa Bomba recíproca Bomba pneumática Proporção do Solvente mais polar

18 Reservatório de FM Sistema de bombeamento Válvula de amostragem Coluna cromatográfica Detector Registrador Ex: : Bomba recíproca (uma das mais usadas) Para coluna Desvantagens: Vazão pulsada amortecedor Cavitação (bolhas) devido à compressão Vantagem: Mudança da fase móvel

19 Reservatório de FM Sistema de bombeamento Válvula de amostragem Coluna cromatográfica Detector Registrador Dispositivo de aço inoxidável com uma alça de amostragem que permite introduzir volumes exatos e precisos na coluna ALÇA TROCÁVEL Volumes de 2 a 1000 µl

20 Reservatório de FM Sistema de bombeamento Válvula de amostragem Coluna cromatográfica Detector Registrador Coluna tubo de aço inoxidável separação Capacidade: dimensões Фi= 1 20 mm L= 3 25 cm FE Partículas com Ф na faixa de µm Uso de partículas pequenas melhor separação (aumenta N) + DUAS COMBINAÇÕES Fase reversa FE apolar (baixa polaridade) FM polar FM Fase normal FE polar FM apolar (baixa polaridade)

21 EFICIÊNCIA DA COLUNA RESOLUÇÃO Determinada pelo n o de etapas de equilíbrio entre o soluto na FE e o soluto na FM REPRESENTAÇÃO: N Número de pratos teóricos N = 16 tr W 2 Sinal do detector Tempo de retenção Quanto maior o número de etapas, mais eficiente é a separação Não implica em rapidez! (Altura do prato (H): H= L / N)

22 Reservatório de FM Sistema de bombeamento Válvula de amostragem Coluna cromatográfica Detector Registrador Detecção dos componentes conforme saem da coluna UM PICO no cromatograma para CADA SUBSTÂNCIA Diferentes tipos de detectores podem ser usados (não existem detectores universais para CLAE) - Que respondem à concentração sinal proporcional à concentração Ex: Absorção no UV-Vis, infravermelho e de fluorescência MAIS GERAIS PORÉM MENOS SENSÍVEIS - Que respondem à massa sinal proporcional a um fluxo de massa por unidade de tempo Ex: Detectores eletroquímicos e de condutividade elétrica MAIS SENSÍVEIS MAS NÃO PERMITEM ELUIÇÃO COM GRADIENTE

23 Considerações práticas Várias configurações instrumentais podem ser empregadas determinação de vários tipos de substâncias (mesmo em amostras complexas) sistema à alta pressão: checar vazamentos As condições instrumentais e de preparo de amostra influenciam no resultado para minimizar os erros experimentais pode-se utilizar padrões internos (substância com características físico-químicas semelhantes às do analito e que é adicionada em quantidade fixa e conhecida)

24 Questões 1- Descreva os componentes básicos de um equipamento para cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e explique, brevemente, a função de cada um deles. 2- Os cromatogramas X, Y e Z referem-se a uma mistura de compostos presentes em analgésicos e foram obtidos em uma mesma coluna, mas utilizando fases móveis diferentes e em modo isocrático (X: 70% MeOH/ 30% HAc; Y: 60% MeOH/ 40% HAc; Z: 40% MeOH/ 60% HAc). Considerando essas informações, responda qual é o composto mais polar e qual das fases móveis você utilizaria para fazer essa mesma separação. X Y Z

25 Referências Skoog, D. A., Holler, F. J.; Nieman, T. A. Principles of Instrumental Analysis 5 th ed., Saunders College Publishing: Philadelphia, 1998 Harris, D. C. Análise Química Quantitativa 7 a ed., LTC Livros Técnicos e Científicos Editora, 2008 Collins, C. H., Braga, G. L., Bonato, P. S. Fundamentos de Cromatografia 1 a ed., Editora UNICAMP: Campinas, 2006

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