MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
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- Ana Sofia Rocha Almada
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1 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Aula 7 Cromatografia Liquida de Alta Eficiência CLAE Profa. Daniele Adão
2 Cromatografia a líquido clássica
3 O que é Cromatografia a líquido de alta eficiência - CLAE? Emprego de altas pressões, diferente da CL clássica que opera à pressão ambiente. A CLAE é uma técnica de ultra-microanálise podendo, dependendo da substância e do detector empregado, quantificar massas de componentes inferiores a g. Na cromatografia a líquido as espécies que estão sendo analisadas sofrem influência enorme da FE, e ao mesmo tempo as propriedades destas estão continuamente influenciadas pela FM (fato que não ocorre na CG).
4 Cromatografia a líquido de alta eficiência Quais misturas podem ser separadas por CLAE? para uma substância qualquer poder ser arrastada por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido. Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica.
5 Cromatografia a líquido de alta eficiência VANTAGENS: Não necessita que a amostra seja volátil (requisito da CG); Tempo reduzido de análise; Alta resolução; Boa detectabilidade e bons resultados quali e quantitativos. DESVANTAGENS: Alto custo do equipamento; Não existe um detector universal com boa detectabilidade e baixo custo.
6 HPLC, CLAE OU CLAD? HIGH PRESSURE (OR PEFORMANCE) LIQUID CHROMATOGRAPHY - HPLC CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO DE ALTA EFICIÊNCIA CLAE CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO DE ALTO DESEMPENHO CLAD
7 DIFERENÇAS ENTRE CG E CLAE Parâmetros CG CLAE Fase móvel Gás inerte Líquida Fase estacionária Líquida ou sólida Líquida ou sólida Tamanho da coluna 1,0 a 100,0m Menor que 30,0cm Fase do composto - Injetado Gás ou líquido Líquido - Detectado Gás Líquido Temperatura da coluna 100 a 300 C Ambiente a 65 C Identificação dos picos Tempo de retenção Tempo de retenção Quantidade mínima detectável g 10-9 g Detectores mais usados Ionização em chama ou Absorbância do UV captura de elétrons Pratos teóricos por coluna a a
8 Massa molecular Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência Aplicabilidade Insolúvel em água Apolar Adsorção Aumento de polaridade\ Polar não iônico Partição em fase reversa Partição Solúvel em água Partição em fase normal Iônico Troca iônica Para solutos com MM > a CE é usada com frequência. Espécies iônicas com MM mais baixas CTI é amplamente usada. Espécies pequenas e polares, mas não-iônicas, são mais indicadas para os métodos de partição (CLL) Permeação em gel Exclusão Filtração em gel A cromatografia por adsorção (CLS) é escolhida para separar espécies não polares, de isômeros estruturais e de classes de compostos (p.e.: HC alifáticos de alcoóis alifáticos)
9 Coletor de solvente Reservatório do solvente Coluna Sistema computadorizado de coletor de dados Microsseringa Câmara de mistura Injetor loop Bomba de alta pressão Detector Registrador
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11
12 INJETOR PURGA COLUNA FM DETECTOR BOMBA
13 Um cromatógrafo a líquido é composto de: Reservatório e sistema de bombeamento da FM; A bomba é o dispositivo que bombeia e controla o fluxo e a pressão da FM (solvente). Sistema de injeção da amostra: Injetor é o dispositivo que tem a função de introduzir a amostra na FM; Sistema analítico - Coluna cromatografia e termostato: É o dispositivo que tem a função de separar os componentes da amostra; Sistema de detecção: Detector é o dispositivo que tem a função de detectar os componentes eluídos da coluna cromatográficas. Sistema de registro e tratamento de dados.
14 Reservatórios para FM A linha do solvente possui em sua extremidade um filtro de aço inoxidável que permite reter as partículas sólidas.
15 Bombas de alta pressão As bombas empregadas devem apresentar: Devem operar a pressões de até 500 atm com a mesma precisão e exatidão de operações a pressão quase ambiente; Resistentes a alta pressão; Devem ser constituídas de material inerte; As vazões normalmente empregadas vão de 0,005 até no máximo 4 ou 5 ml/min. Os controles eletrônicos devem permitir programação da vazão
16 Componentes auxiliares Válvula de purga: É o dispositivo que permite a troca rápida de solvente desviando o fluxo de solvente para o dreno. Misturador: É o dispositivo que homogeneíza a mistura de solventes quando operando com gradiente de eluição.
17 Sistema de Injeção Existem basicamente 3 tipos de injetores: seringa, válvula e automáticos. 1. INJETORES TIPO SERINGA: VANTAGENS: são baratos DESVANTAGENS: - Aplica a amostra diretamente na coluna; - Dificuldade de injetar volumes precisos; - Deve-se vencer a pressão da bomba.
18 Sistema de Injeção 2. INJETORES TIPO VÁLVULA: Introdução da amostra é efetuada com um loop externo. VANTAGENS: - injeta volumes precisos; - loop de diferentes tamanhos (mais utilizados: 20 e 100 μl).
19 Sistema de Injeção Posição para injetar Posição para carregar
20 Sistema de Injeção 3. INJETORES AUTOMÁTICO: São injetores de válvula controlados por microprocessador; - Permite Injetar diferentes volumes das amostras que são colocadas em um carrossel, conforme programação prévia; -A pressão da seringa é suficiente para a amostra passar a válvula de controle. VANTAGENS: - todas as do injetor tipo válvula; - injeta amostras automaticamente. DESVANTAGENS: - preço.
21 Colunas cromatográficas Na CLAE podem ser usados três tipos de colunas: a coluna de saturação, a coluna de guarda e a coluna de separação.
22 Colunas cromatográficas COLUNA DE SATURAÇÃO: é colocada entre a bomba e o injetor sendo usada pra condicionar a fase estacionária. Muito empregada no passado quando se utilizava a CLL com a finalidade de saturar a FM com o líquido da FE, não sendo tão necessária atualmente.
23 Colunas cromatográficas COLUNA DE GUARDA: é colocada entre o injetor e a coluna analítica, esta possui normalmente de 2 a 5cm e tem o mesmo diâmetro interno e FE da coluna analítica. É utilizada para prevenir que impurezas e compostos fortemente retidos, contaminem a coluna de separação. Satura rapidamente. Aumenta o tempo de vida útil da coluna analítica. O custo das diversas trocas desta coluna ainda é menor do que uma nova coluna analítica.
24 Colunas cromatográficas COLUNA DE SEPARAÇÃO: responsável pela separação dos componentes da amostra. Podem ser separadas em colunas analíticas e colunas preparativas.
25 Colunas cromatográficas COLUNA PREPARATIVA: Cromatografia de filtração em gel separação, isolamento e purificação de proteínas.
26 Colunas cromatográficas COLUNA PREPARATIVA
27 Colunas cromatográficas COLUNAS ANALÍTICAS: Permitem a separação de pequenas quantidades do material a ser analisado. São constituídas de um tubo de algum material inerte. O aço inoxidável é o material mais frequentemente utilizado; Tem diâmetro interno uniforme, capaz de resistir às pressões em que será usada e a possíveis sobrepressões Ocasionais. São normalmente retas, pois apresentam uma perda na eficiência quando são dobradas.
28 Colunas cromatográficas DESVANTAGEM das colunas de vidro e plástico BAIXA RESISTÊNCIA A PRESSÃO
29 Colunas cromatográficas
30 Colunas cromatográficas
31 Colunas cromatográficas CONDICIONAMENTO DA COLUNA: necessário para que haja um perfeito equilíbrio da FM e da FE. Coluna nova 4 a 8 horas Coluna para a alguns dias 2 horas Coluna de uso diário 15 minutos A COLUNA DEVE SER GUARDADA EM SOLVENTE ORGÂNICO OU FM
32 Fase estacionária Basicamente são dois tipos de FE: PELICULAR: Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 mm, recoberto com uma camada fina e porosa de: Sílica Alumina Resina de poliestireno-divinil-benzeno Resina trocadora de íons PARTÍCULA POROSA: Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 mm. As partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular.
33 Fase estacionária TAMANHO DAS PARTÍCULAS: Macropartículas, quando apresentam diâmetro entre 20 e 40μm; Intermediárias, quando tem entre 20 e 10μm; e Micropartículas, de 3 a 10μm. Quanto menor for a partícula, maior será a eficiência da separação. Porque isso ocorre? Partículas menores reduzem a distância de contato do soluto com as FE e FM, facilitando o equilíbrio e, consequentemente, melhorando a eficiência da coluna.
34 Fase estacionária TAMANHO DAS PARTÍCULAS:
35 Fase estacionária A fase estacionária mais utilizada é composta de partículas microporosas de sílica. São permeáveis ao solvente e possuem uma área superficial de varias centenas de metros por gramas. Não deve ser utilizada em sistemas com ph acima de 8,0.
36 Fase estacionária Superfície de sílica tem cerca de 8μmol de grupos silanol (Si-OH) por metro quadrado, em ph entre 2,0 e 3,0. Acima de ph 3,0, os grupos Si-OH se dissociam em Si-O -, podem reter fortemente bases protonadas (como RNH 3+ ), provocando a formação de caudas nos picos.
37 Fase estacionária A sílica sozinha pode ser usada como FE para a cromatografia de adsorção, e o desenvolvimento cromatográfico é dito fase normal. Mecanismo de separação: ADSORÇÃO - FE: + POLAR que a fase móvel - FM: mistura de solventes orgânicos Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino
38 Fase estacionária quimicamente ligada Para utilização da sílica na cromatografia de partição, esta deve estar quimicamente ligada. Dependendo do radical R ligado, o método cromatográfico pode ser desenvolvido como fase normal ou fase reversa. A FE de octadecil (C 18 ) é a mais utilizada na CLAE, sendo representada por ODS (octadecilsilano). C-18 C8 C1 Oxy-Phenyl PFP
39 Fase estacionária
40 Fase estacionária quimicamente ligada
41 Fase estacionária quimicamente ligada Como classificamos o método cromatográfico de acordo com a polaridade? C8 C18 (ODS) forte Amostra apolar C4 média Amostra apolar fraca Amostra apolar
42 Fase estacionária quimicamente ligada Mecanismo de separação: PARTIÇÃO INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DO SOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA FE: APOLAR FM: H 2 O, MeOH, CH 3 CN ÁREA DE C SOLUTO RETENÇÃO
43 Fase estacionária quimicamente ligada Tempo de Retenção e Hidrofobicidade OH C18 (ODS) forte OH Interação fraca
44 Fase estacionária quimicamente ligada Se a amostra possui CH 3 CH 2 CH : cadeia carbônica : grupo aromático A hidrofobicidade será forte Se a amostra possui -COOH : grupo carboxílico -NH2 : grupo amino -OH : grupo hidróxi A hidrofobicidade será fraca
45 Fase estacionária quimicamente ligada
46 Fase estacionária quimicamente ligada VANTAGENS: Alta estabilidade química; Liberdade de escolha da FM, vazão e temperatura; Eluição por gradiente. DESVANTAGENS: Preparo é trabalhoso; Menor recobrimento da superfície (apenas 50% dos silanóis); Restrição ao ph 2 < ph < 8.
47 Fase estacionária polimérica Alternativa a FE quimicamente ligada combinam a resistência mecânica do suporte inorgânico com a seletividade e inércia química dos polímeros orgânicos. VANTAGENS: Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte; Possibilidade de maior seletividade da FE (escolha do polímero apropriado); Grande variedade de polímeros orgânicos disponíveis.
48 Fase estacionária polimérica PRINCIPAIS SUPORTES: Sílica Zircônia Titânia Alumina PRINCIPAIS POLÍMEROS: Poli(etileno) Poli(butadieno) Poli(estireno) Poli(dimetilsiloxano) Poli(metiloctilsiloxano) Poli(metiloctadecilsiloxano) Poliéteres Polissacarídeos Poliaminas Polinucleotídeos Poliamidas Proteínas
49 Fase estacionária polimérica Pré-hidrólise do agente silanizante - Rede tridimensional mais espessa - Maior estabilidade - Dificuldade de controlar reações entrecruzamento
50 Fase estacionária iônica Mecanismo de separação: ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA FE: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas) FM: Tampão (ph, força iônica, temperatura) Aniônicas: amônio quaternário, aminas Catiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico
51 Fluxo da FM Instrumentação para CLAE Fase estacionária iônica Resinas Catiônicas e Aniônicas FE altamente carregada Maior Interação: Íons de alta carga Íons de menor tamanho A diferença de afinidade entre os íons da FM pode ser controlada por ph e força iônica.
52 Fase estacionária iônica O ajuste do ph proporciona a separação das duas proteínas
53 - FE Descrição Polaridade/ interação Octadecil (C 18 ) Altamente apolar Octil (C 8 ) Moderadamente apolar Etil (C 2 ) Fracamente apolar Metil (C 1 ) Fracamente apolar Fenil (PH) Moderadamente apolar Cicloexano (CH) Moderadamente apolar Cianopropil (CN) Moderadamente apolar/polar Diol ( 2 OH) Polar Sílica (Si) Polar Ácido Carboxílico (CBA) Troca catiônica fraca Ácido Propilsulfônico (PRS) Troca catiônica forte Ácido Benzenossulfônico (SCX) Troca catiônica forte Aminopropil (NH 2 ) Troca aniônica fraca/polar Amina Primária/Secundária (PSA) Troca aniônica fraca/polar Dietilaminopropil (DEA) Troca aniônica fraca/polar Amina Quaternária (SAX) Troca aniônica forte Ácido Fenilborônico (PBA) Covalente
54 Escolha da FE mais adequada
55 C18 Instrumentação para CLAE Fase estacionária Fenil Polar Figure 1: Comparison of chromatograms from same manufacturer.
56 Fase estacionária Figure 2: Comparison of separations obtained using (a) a C18 column from one manufacturer with (b) an embedded-polar-group column from a second manufacturer
57 Fase estacionária reversa - Otimização
58 Exercícios 1) Em uma coluna de C18 encontra-se um composto com tempo de retenção igual a 14 min quando a FM é metanol. Qual solvente, água ou éter etílico, aparentemente reduziria o tempo de retenção? Justifique. R: Éter de petróleo por apresentar menor polaridade que o metanol. A água é mais polar que o metanol, e pode elevar o t R do composto. Como esse método cromatográfico pode ser classificado? Fase normal ou reversa? Justifique. R: Fase reversa, pois a FE (C18) é apolar e a FM (metanol) é polar.
59 Exercícios 2) Uma mistura contendo 7 compostos foi separada em três colunas diferentes (contendo grupos quimicamente ligados: C 1, C 6 e C 14 ). Justifique o tempo de retenção do composto fenilfenol nos cromatogramas.
60 Exercícios 3) A FE foi preparada através da reação da sílica Kromasil 5 um com agente sililante contendo um organossilano monofuncional e grupo C8 para obtenção de uma fase com grupo polar embutido. As colunas cromatográficas de 60 x 3,9 mm foram recheadas com 0,7 g da fase (10 %, v/v em clorofórmio) a uma pressão de 38 MPa. O cromatograma dos compostos paracetamol e cafeína utilizando a FM água:metanol:ácido acético (68:28:3 v/v/v); vazão 0,7 ml/min; temperatura 40 C; detecção UV a 275 nm; volume de injeção 5uL. Qual a ordem de eluição?
61 R: Exercícios
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