UNIFESO Engenharia Ambiental Prof.: Edson R. Fernandes dos Santos Aminoácidos

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Aurélio Salvado Viveiros
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2 α-aminoácidos Variações possíveis Estrutura básica Amina Ácido Carboxílico

3 Glicina Alanina Metionina Prolina Fenil-Alanina

9 Titulação com NaOH 0,1M

10 Ponto ou ph isoelétrico

11 Pepitídeos Ligação peptídica covalente

12 Serina-Glicina-Tirosina-Alanina-Leucina Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu SGYA

13 Proteínas Basicamente formadas pelos 20 aminoácidos excenciais

14 Proteínas simples possuem somente Amino-ácidos Proteínas conjugadas - proteínas com grupos químicos diferentes de Amino-ácidos Grupos prostéticos parte não aminoacídica.

para romper as células e dispersar seu conteúdo em

15 Purificação de Proteínas Geralmente ligadas ao tecido ou células microbianas O tecido é macerado para romper as células e dispersar seu conteúdo em um tampão aquoso contendo sacarose Tecido homogenizado

Tecido homogeneizado Centrifugação a baixa velocidade (1.000 g/10 min.) Sobrenadante centrifugado a velocidade média(20.000 g/20 min.) Sobren. centrifugado a velocidade alta (80.

16 Tecido homogeneizado Centrifugação a baixa velocidade (1.000 g/10 min.) Sobrenadante centrifugado a velocidade média( g/20 min.) Sobren. centrifugado a velocidade alta ( g/ 1 hora.) Sobren. Centrif. a veloc. muito alta g/ 1 hora.) Proteínas solúveis Sedimentos contendo ribossomos e macromoléculas

17 Salting out Geralmente utiliza-se sulfato de amônio para diminuir a solubilidade das proteínas (forçando precipitação) para facilitar a separação

18 Separação por Cromatografia em Coluna Reservatório Amostra Protéica (em fase móvel) Matriz sólida (fase estacionária) Suporte poroso Efluente

19 Cromatografia por troca iônica Carga positiva elevada Carga líquida positiva Carga líquida negativa Carga líq. negat. elevada Grânulos de polímero com grupos funcionais carregados negativamente A mistura protéica é adicionada à coluna contendo trocadores de cátions

20 Cromatografia por exclusão de tamanho A mistura protéica é adicionada à coluna que contém um polímero com ligações cruzadas Grânulos de polímero poroso A mistura de proteínas separam-se por tamanho; moléculas maiores passam mais livremente, aparecendo nas frações iniciais.

Cromatografia por Afinidade Proteína de interesse Ligante Mistura de Proteínas Solução de Ligante A mistura protéica é adicionada à coluna contendo um ligante

21 Cromatografia por Afinidade Proteína de interesse Ligante Mistura de Proteínas Solução de Ligante A mistura protéica é adicionada à coluna contendo um ligante covalente ligado ao polímero, específico para a proteína de interesse. Proteínas não desejadas permeiam através da coluna A proteína de interesse é eluída pela solução ligante

22 Marcadores Células não induzidas Células induzidas Extrato bruto solúvel Precipitação por salting out Troca aniônica Troca catiônica Proteína purificada Eletroforese

24 Aminoácidos sequenciados Interações entre os Peptídeos Estruturas tridimensionais dos polipeptídeos Rearranjos entre os Peptídeos α-helice Resíduo de Aminoácidos Cadeia Polipeptídica Subunidades reunídas

25 Exemplo de interações de dissulfeto Formas nativas Proteínas dobradas em qualquer conformação funcional

26 Diferença entre forma nativa (dobrada) e não dobrada Diferença = KJ/mol

27 Estrutura não dobrada Alta entropia Ligações de Hidrogênio (água e peptídeo) Estrutura dobrada Ligação de dissulfeto Interações não covalentes (fracas) Ligação de Hidrogênio Interações hidrofóbicas Interações Iônicas O alto número de interações fracas aumenta a estabilidade das formas dobradas. O que acaba facilitando a forma dobrada, mesmo que, inicialmente, apresentem forças relativamente fracas (4 30 KJ/mol) contra as ligações covalentes ( KJ/mol) de energia de quebra.

28 Rotação das ligações peptídicas Ângulos de torção Φ (phi), ψ (psi) e ω (ômega)

29 Estruturas Secundárias Rearranjos espacial dos átomos das cadeias do polipeptídeos com a própria cadeia. Não há consideração das cadeias laterais ou com outros seguimentos. Ocorre entre os diedros phi e psi.

30 Estruturas Secundárias α-helices

33 Folha β-pregueada

$de uma proteína Ligações covalentes ou interações fracas entre as cadeias$

34 Estruturas Terciárias Rearranjos tridimensionais total de todos os átomos de uma proteína Ligações covalentes ou interações fracas entre as cadeias

35 α-hélice de queratina Duas cadeias enroladas em espiral Protofilamento Protofibrila Células Filamento intermediário Protofibrila Protofilamento Duas cadeias enroladas em espiral α-hélice

36 A Colágeno (estrutura secundária) B- Modelo atômico de A C- Rearranjo de três estruturas de colágeno D- Super estrutura de α-hécice formada pelas estruturas C

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