Estrutura. Estrutura 29/10/2010. Visão Geral Existem 4 níveis de estrutura de proteínas:

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1 Definições importantes: - Por serem conceitos didáticos, frequentemente é difícil distinguir em uma proteína os níveis secundário e terciário de organização estrutural. - Para evitar tais ambiguidades utiliza-se o termo conformação proteica, que se refere aos aspectos da estrutura tridimensional de uma proteína acima de sua sequência de aminoácidos. Nádia Fátima Gibrim - Os termos conformação e configuração não são sinônimos. Configuração refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula determinada por ligações covalentes, como por exemplo, emplo as formas L- e D- de um aminoácido. Conformação refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula decorrente da somatória de ligações fracas, não covalentes. Conformação nativa de uma proteína refere-se à estrutura tridimensional em que a molécula apresenta suas propriedades biológicas naturais. Desnaturação refere-se a alterações da conformação nativa de uma proteína, podendo resultar em perda parcial ou total, reversível ou irreversível, de sua atividade biológica.. aminoácido Estrutura primária: é a sequência dos aminoácidos na cadeia polipeptídica; mantida por ligações peptídicas É o esqueleto covalente (fio do colar), formado pela seqüência dos átomos (-N-C-Cα-)n na proteína. Visão Geral Existem 4 níveis de estrutura de proteínas: Primário é a sequência de a.a. Secundário é o arranjo da espinha dorsal da cadeia Terciário é como a proteína se enrola Quaternário devido a mais de uma cadeia polipeptídica x 4 Estrutura secundária: Enovelamento de partes da cadeia polipeptídica Formada somente pelos átomos da ligação peptídica, através de pontes de H. Ex: alfa-hélices e folhas beta. Estrutura terciária: Enovelamento de uma cadeia polipeptídica como um todo. Ocorrem ligações entre os átomos dos radicais R de todos os aminoácidos da molécula Estrutura quaternária: Associação de mais de uma cadeia polipeptídica No modelo, um tetrâmero composto de 4 cadeias polipeptídicas Estrutura Estrutura a) Primária ou nível primário b) Secundária ou nível secundário ou helicoidal c) Terciária ou nível terciário d) Quaternária ou nível quaternário a) Estrutura Primária ou Nível Primário É a seqüência em número de aminoácidos (cadeia peptídica). A ligação estabilizante é a ligação peptídica (covalente). Se imaginarmos os aminoácidos representados por letras: A, B, C, D,... teremos uma esquematização da estrutura primária de uma proteína: A B C D A D A É importante salientar que o número de...a B C D A D A -... É importante salientar que o número de aminoácidos determina o número de proteínas. [Fatorial (!) do nº de aa]. Uma variação na seqüência conduz a uma proteína diferente e com ação bioquímica diferente. Ex: a ocitocina e a vasopressina diferem entre si na seqüência de apenas dois aa; a ocitocina provoca as contrações uterinas e a vasopressina provoca aumento da pressão sangüínea. 1

2 Estrutura b) Estrutura secundária ou nível secundário (helicoidal) É o enrolamento da estrutura primária em torno de um eixo imaginário, originando uma hélice chamada de α hélice. Assim, esta estrutura está relacionada com a disposição espacial das estruturas primárias, e pode ser em forma de um α hélice ou uma folha pregueada. A α-hélice e a folha β são os tipos de estrutura secundária mais comum entre as proteínas, por que não dependem da composição e sequência de aminoácidos, sendo estabilizadas apenas por pontes de H dos átomos da ligação peptídica. Entre os 20 aminoácidos, apenas a prolina não pode fazer nenhuma das duas estruturas, por formar uma ligação peptídica mais rígida em torno do Cα. Existem outros tipos de estruturas secundárias conhecidas, como a dobra β ou alças (domínios) de ligação a íons, como Ca 2+ ou Zn 2+. tipo 1 tipo 2 Dobra β hélice-dobra-hélice Zinc-finger As ligações estabilizantes dessa estrutura secundária são: 1. Ligação ou Ponte de Hidrogênio: formada pela interação ou atração entre: - oxigênio da carboxila de um aa e hidrogênio do grupo amino de outro/ - oxigênio da carboxila de um aa e hidrogênio do grupo carboxila de outro. 2. Ligação Iônica: formada pela atração entre as cadeias laterais dos aa ácidos e aa básicos. Estrutura c) Estrutura terciária ou nível terciário É a sua forma tridimensional ocasionada pelo enrolamento da espiral sobre si mesma (novelo). As ligações estabilizantes são as mesmas da estrutura secundária. 3. Ligação hidrófoba ou apolar: formada pela interação de radicais apolares como: metil, etil, metileno, etc; dos aa constituintes da molécula. 4. Ligação ou ponte dissulfeto: formada pela união de grupos SH dos aa chamados de cisteína. OBS: - As ligações estabilizantes em maior número são as pontes de H. - A ligação estabilizante mais forte é a ligação dissulfeto. Estrutura d) Estrutura Quaternária ou Nível Quaternário É a que resulta da reunião de várias estruturas terciárias que, em conjunto, assumem formas espaciais bem definidas. As ligações estabilizantes são as mesmas da estrutura secundária. OBS: nem todas as proteínas apresentam esta estrutura, mas de uma maneira geral, todas as enzimas as apresentam. Visão Geral 4 níveis de estrutura de proteínas: Primário é a sequência de a.a. Secundário é o arranjo da espinha dorsal da cadeia Terciário é como a proteína se enrola Quaternário devido a mais de uma cadeia polipeptídica 2

3 Os 4 níveis de estrutura de proteínas: aminoácidos Estrutura primária sequência de a.a. folha beta alfa-hélice Estrutura terciária - interações entre os radicais dos aminoácidos - arranjo espacial de alfa-hélices e folhas beta folha beta alfa-hélice Estrutura secundária pontes de H entre grupos amídicos (espinha dorsal) Estrutura quaternária presença de mais de uma cadeia polipeptídica Estrutura Primária É a seqüência de aminoácidos existentes na molécula de uma proteína esqueleto covalente da molécula É o nível de estrutura mais simples, mas a partir do qual todos os outros derivam. Estrutura Secundária A espinha dorsal possui grupos polares (amina e carbonil): grande potencial para formação de pontes de H Estrutura Secundária É o arranjo espacial da espinha dorsal da cadeia polipeptídica Deriva da interação (pontes de hidrogênio) entre aminoácidos relativamente próximos entre si. Tendência de formação de pontes de H na mesma cadeia ou em cadeias adjacentes Estrutura 2a apenas interações entre a espinha dorsal não envolve grupo R (cadeias laterais) Estrutura secundária O arranjo secundário de um polipeptídeo pode ocorrer de forma regular: Repetitiva (regular): Principais são α-hélice e folha-β α-hélice A α-hélice é mantida pelas pontes de H que se formam entre átomos de duas ligações peptídicas próximas. Não repetitiva (ordenada, mas irregular) Desordenada (ao acaso) - Folha β pregueada α-hélice É a forma mais comum de estrutura secundária regular Caracteriza-se por uma hélice em espiral formada por 3,6 resíduos de aminoácidos por volta As cadeias laterais dos aminoácidos se distribuem para fora da hélice, evitando assim o impedimento estérico 3

4 Folha β pregueada A folha β pregueada é mantida por pontes de H que se dispõem perpendicularmente à espinha dorsal (entre cadeias adjacentes) Estrutura Secundária Não Repetitiva: Maioria da estrutura de uma proteína globular está em α - hélice ou em folha - β O restante da molécula assume uma estrutura secundária não repetitiva, menos regular que as acima citadas (mas não ao acaso) Ao contrário da α-hélice, a folha-β envolve 2 ou mais segmentos polipeptídicos da mesma molécula ou de moléculas diferentes. Os segmentos em folha-β da proteína adquirem um aspecto de uma folha de papel dobrada em pregas. Estrutura Terciária Resulta de dobras na estrutura da proteína provocadas por interações entre os radicais dos aminoácidos Estrutura Terciária: Dada pelo arranjo espacial de aminoácidos distantes entre si na seqüência polipeptídica Envolve os grupos R Ocorre nas proteínas globulares, mais complexas em estrutura e função É o arranjo espacial de alfahélices e folhas beta Interações responsáveis pela estrutura terciária Interações iônicas Pontes de hidrogênio Interações hidrofóbicas Forças de Van der Waals Ligações covalentes (pontes dissulfeto) Proteinas (dois grandes grupos): - fibrosas (geralmente sem estrutura terciária) - globulares s globulares: Geralmente solúveis em água Grupos polares do lado externo Grupos hidrofóbicos no interior Porções significativas constituídas por α-hélice e folha-β 4

5 Regras gerais que governam a determinação da estrutura terciária: Estruturas secundárias formam sempre que possível (maximização de pontes de H da cadeia principal/espinha dorsal) Resíduos hidrofóbicos (mas nem todos) são enterrados no interior da proteína Hélices e folhas se apresentam bem empacotados - o interior hidrofóbico se apresenta bem empacotado Maioria dos residuos polares estão na superfície da proteína Resíduos polares no interior formam pontes de H com parceiros Todos (quase) os residuos carregados estão na superfície da proteína Outros fatores importantes que determinam e estabilizam a estrutura terciária de uma proteína: Impedimento estérico restrições conferidas por cadeias laterais muito grandes Resíduos de prolina - tendem a causar dobras na cadeia Pontes de hidrogênio Interações Iônicas Pontes dissulfeto - ligações covalentes entre radicais sulfidrila de resíduos de cisteína. Estrutura Quaternária Refere-se ao modo pelo qual duas ou mais cadeias polipeptídicas interagem. É mantida por ligações iônicas, pontes de hidrogênio e por interações do tipo hidrofóbico subunidades dimérica o o o Estrutura Quaternária: Surge apenas nas proteínas oligoméricas Dada pela distribuição espacial de mais de uma cadeia polipeptídica no espaço, as subunidades da molécula. Estas subunidades d se mantém unidas por forças covalentes, como pontes dissulfeto, e ligações não covalentes, como pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, etc. As subunidades podem atuar de forma independente ou cooperativamente no desempenho da função bioquímica da proteína Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína? NH2 CH 2 OH... O C CH 2 CH 2 Ponte de Hidrogênio CH + 2 CH 2 NH 3 O Ligação Iônica C CH 2 CH 2 O CH2 CH CH 3 CH 3 CH CH 2 CH CH 3 H 3 C CH Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals FORÇAS NÃO COVALENTES Pontes de H -Aminoácidos polares Ligações iônicas - Aminoácidos carregados Interações hidrofóbicas -Aminoácidos apolares Forças de Van der Waals -Qualquer aminoácido NH2 CH 2 OH... O C CH 2 CH 2 Ponte de Hidrogênio Pontes de H : - entre os átomos da ligação peptídica (αhélice e a folha β); + - entre cadeias laterais de aminoácidos CH 2 CH 2 NH 3 O polares, carregados ou não; Ligação Ponte de Iônica Hidrogênio C CH 2 CH 2 O - para os grupos NH 3+ e COO - dos CH aminoácidos (N- e C-terminal, 2 CH CH 3 respectivamente). Ligações iônicas: CH 3 CH CH 2 - ocorrem entre as cadeias laterais de CH CH 3 H 3 C CH aminoácidos com cargas contrárias; Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals - dependem do estado de ionização dos aminoácidos e do ph do meio; - são menos frequentes do que as pontes de H. 5

6 NH2 CH 2 OH... O C CH 2 CH 2 Ponte de Hidrogênio CH + 2 CH 2 NH 3 O Ligação Iônica C CH 2 CH 2 O CH2 CH CH 3 CH 3 CH CH 2 CH CH 3 H 3 C CH Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals -Interações hidrofóbicas: - ocorrem entre as cadeias laterais de aminoácidos apolares; - radicais apolares são repelidos pela água, aproximando-se uns dos outros; - não é uma força de atração real, resultando da repulsão pela água; - como consequência, em meio aquoso o interior de proteínas globulares é hidrofóbico. NH2 CH 2 OH... O C CH 2 CH 2 Ponte de Hidrogênio CH + 2 CH 2 NH 3 O Ligação Iônica C CH 2 CH 2 O CH2 CH CH 3 CH 3 CH CH 2 CH CH 3 H 3 C CH Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals e Forças de van der Waals Forças de Van der Waals - é uma força eletrostática que ocorre entre dipolos temporários; - dipolos temporários (duração de nanosegundos) são criados devido à órbita dos elétrons; - podem envolver qualquer tipo de aminoácido; -geralmente coincidem com as regiões da proteína onde ocorrem as interações hidrofóbicas (a aproximação dos radicais apolares facilita a interação entre os dipolos). Interações hidrofóbicas: - ocorrem entre as cadeias laterais de aminoácidos apolares; - radicais apolares são repelidos pela água, aproximando-se uns dos outros; - não é uma força de atração real, resultando da repulsão pela água; - como consequência, em meio aquoso o interior de proteínas globulares é hidrofóbico. Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína? Além dos laços não covelentes, uma proteína pode ter pontes dissulfeto formada a partir de dois resíduos do aminoácido Cys (cisteína). Pontes dissulfeto são covalentes e só podem ser rompidas por agentes redutores, como 2-mercapto-etanol. Desnaturação de s É a alteração da estrutura da proteína sem ruptura das ligações peptídicas B A O hormônio insulina é composto por duas subunidades, A e B, unidas por duas pontes dissulfeto intercadeia. Além disso, a cadeia B possui uma ponte dissulfeto intracadeia nativa desnaturada Desnaturação de proteínas É a perda da estrutura nativa de uma proteína, com consequente perda de função Pode ser reversível ou irreversível Coagulação de proteínas globulares com aquecimento. Desnaturação por temperatura ou por via química: ph, certos solventes orgânicos tais como álcool e acetona, solutos como urea, detergentes - Solventes orgânicos e detergentes agem principalmente sobre interações hidrofóbicas. - Alterações de ph alteram as cargas da proteina Desnaturação A desnaturação é um processo que consiste na quebra das estruturas secundária e terciária de uma proteína. Nas suas ligações (Pontes de hidrogênio, ligação disulfeto...). Quando as proteínas são submetidas à elevação de temperatura, a variações de ph ou a certos solutos como a uréia, sofrem alterações na sua configuração espacial, e sua atividade biológica é perdida. Ao romper as ligações originais, a proteína sofre novas dobras ao acaso. 6

7 Agentes desnaturantes Físicos Desnaturação de proteínas por alteração do ph do meio Alterações de temperatura Raio X Ultra-som Químicos Ácidos e bases fortes Detergentes Uréia Mercaptoetanol HS-CH 2 -CH 2 -OH Consequências da desnaturação Perda da atividade biológica (enzimas, hormônios, anticorpos, etc...) Redução da solubilidade Aumento da digestibilidade Desnaturação A proteína desnaturada apresenta as seguintes alterações: a) Físicas: aumento da viscosidade; não podem ser cristalizadas ou autoorganizadas. b) Químicas: maior reatividade devido a exposição de grupos químicos que estavam encobertos por estruturas; diminuição da solubilidade e, conseqüente precipitação. c) Biológicas: perda de suas propriedades enzimáticas, antigênicas e hormonais; facilmente digeridas por enzimas hidrolíticas. Na desnaturação, a seqüência de aminoácidos não se altera e nenhuma ligação peptídica é rompida. A atividade biológica de uma proteína não depende apenas da sua estrutura primária, embora esta seja o determinante da sua configuração espacial. Algumas proteínas desnaturadas, ao serem devolvidas ao seu meio original, podem recobrar sua configuração espacial natural. Na maioria dos casos, nos processos de desnaturação por altas temperaturas ou por variações extremas de ph, as modificações são irreversíveis. A clara do ovo se solidifica, ao ser cozida, mas não se liquefaz quando esfria. Desnaturação A desnaturação por calor é algumas vezes desejável. s da clara do ovo são desnaturadas por calor ou interações superficiais quando formam espuma. s da carne são desnaturadas entre 57 e 75C, causando efeitos na textura, cor e sabor. A desnaturação pode levar à floculação de proteínas globulares e à formação de gel. 7

8 Influência do calor nas proteínas s globulares terão mudanças: Solubilidade Viscosidade Reatividade química As proteínas fibrilares perderão: Elasticidade Flexibilidade Tamanho das fibras Influência do calor nas proteínas A perda do valor nutricional dos alimento é um preço a se pagar pela reação de Maillard. Entretanto, a mesma é imprescinvel no desenvolvimento de cor e sabor dos alimentos. A reação ocorre durante: Armazenamento Aquecimento A velocidade da reação é baixa em temperatura ambiente Solubilidade Propriedade físico-química fundamental das proteínas; Depende de: PM e conformação das moléculas; Densidade e distribuição das cargas elétricas que por sua vez é influenciada pelo ph; Natureza e concentração de íons ou força iônica; Temperatura. Solubilidade A solubilidade é influenciada pelo maior ou menor afinidade das moléculas de proteínas pelo solvente, que para alimentos é a ÁGUA. A solubilidade das proteínas é particularmente importante em alimentos. Depende do número e do arranjo de cargas na molécula, que por sua vez depende da composição em aminoácidos. Partes não protéicas da molécula, como lipídeos, CHOS, fosfatos, etc., também afetam a solubilidade. A solubilidade da proteína pode ser modificada por fatores como: ph ph < pi < ph aumenta a solubilidade da proteína; ph = pi diminui a solubilidade da proteína tendendo a precipitação. - Força iônica Em baixas concentrações de sais (baixa força iônica), a solubilidade em geral aumenta. 8

9 Força iônica A solubilidade em s concentrações pois os íons salinos tendem a se associar às proteínas contribuindo para uma hidratação e/ou repulsão entre as moléculas, aumentando a solubilidade salting in. Em s concentrações salinas, os íons competem com a proteína pela água, ocasionando perda de água de hidratação, atração mútua entre as moléculas e formação de precipitado salting out. Constante t dielétrica i do solvente Constantes dielétricas elevadas aumentam a solubilidade das proteínas. Temperatura A maioria das proteínas é solúvel a temperatura ambiente e a solubilidade tende a aumentar à medida que se eleva a temperatura até 40 a 50 o C. Além destas temperaturas a proteína começa a desnaturar e a solubilidade diminui. Hidratação e capacidade de retenção de água (CRA) Envolve uma interação entre a proteína ou alimento protéico com a água; > ou < afinidade da proteína com a água também se relaciona com outras propriedades funcionais como textura, viscosidade, geleificação e emulsificação. A atração hidrofílica relaciona-se com: Grau de hidratação (conteúdo de água/g de proteína); Habilidade do produto reter água do ambiente (esponjamento); Quantidade de água que permanece na proteína ou alimento protéico após exposição a um excesso de água; Aplicação de uma força de centrifugação ou pressão (capacidade de retenção de água) Hidratação e capacidade de retenção de água (CRA) Determinadas propriedades são particularmente importantes em certos tipos de produtos alimentíceos. Ex: a solubilidade das proteínas e a capacidade de retenção de água são muito importantes nas carnes pois dessa propriedade dependem os atributos de textura, suculência e maciez dos produtos. Hidratação e capacidade de retenção de água (CRA) A desnaturação de proteínas, seja pelo calor, pelo frio ou por efeito do ph altera, igualmente, os espaços interfibrilares provocando uma diminuição no CRA pelo tecido muscular. A temperatura também exerce influência negativa: pode provocar o encurtamento das fibras musculares, diminuindo, novamente os espaços interfibrilares e a capacidade de retenção de água Emulsificação É uma mistura de dois líquidos imiscíveis, um dos quais é disperso na forma de glóbulos no outro líquido. Dois tipos: Quando a água é contínua (externa) e o óleo ou gordura a fase interna (descontínua) = emulsão de óleo em água; Quando a água é a fase interna e o óleo a fase externa = emulsão de água em óleo. O que torna uma emulsão estável é a presença de um agente emulsificante - a tensão superficial existente entre duas fases e permite a formação de emulsão com um nível mais baixo de energia. 9

10 Emulsificação Principal característica de um emulsificante é a de possuir na mesma molécula partes hidrofílicas e hidrofóbicas. Emulsificantes mais polares são mais úteis na formação e estabilidade de emulsões do tipo óleo em água; os menos polares são mais aplicáveis em emulsões de água e óleo (ex. emulsões cárneas como as salsichas). É um sistema de dispersão grosseira de um sólido (gordura) em um líquido que constitui a fase contínua, no qual as proteínas da carne atuam como emulsificante; Aqui a fase contínua não é simplesmente a água e sim um sistema coloidal complexo cujas propriedades são determinadas por macromoléculas de proteínas, além de sais e outras substâncias dissociadas na fase aquosa. Emulsificação Dois aspectos interessam em uma emulsificação: A capacidade de emulsificação (a quantidade de lipídios que as proteínas são capazes de emulsificar); Estabilidade da emulsão mede a capacidade que tem as proteínas de manter a mistura em uma força homogênea quando submetida à ação de uma força ou calor. Fatores que afetam a formação e estabilidade de uma emulsão: Temperatura, tamanho da partícula de gordura, ph, quantidade e tipo de proteína e viscosidade da emulsão. Quanto maior a viscosidade maior mais estável se apresenta a emulsão. Emulsificação A temperatura, quanto mais alta, diminui a viscosidade do óleo fazendo com que aumente a área superficial e facilite a coalescência das partículas de lipídio. A temperatura ideal para manutenção da emulsão parece estar em torno de 20 o C Capacidade de emulsificação e estabilidade de emulsões Consiste na medida da capacidade que tem uma solução de proteína ou uma suspensão de alimento protéico de formar uma mistura homogênea e estável com óleo ou gordura líquida. A capacidade máxima de emulsificação da proteína é determinada d no ponto em que se verifica o colapso ou quebra da emulsão (saturação). Pode ser verificada quando: Visualmente, pela separação de fases; Por um som deferente produzido como conseqüência da separação das fases; Pela queda de condutividade lida por um ampèrímetro. Formação de espuma e estabilidade da espuma A capacidade de uma proteína formar espuma refere-se à expansão de volume da dispersão proteica com a incorporação de ar por batimento, agitação ou aeração. Depende: da natureza da proteína; da presença de sais e de outros aditivos utilizados no processamento dos alimentos. A estabilidade de espuma diz respeito à retenção do volume máximo de espuma formada em função do tempo de repouso sendo geralmente medida pela liberação de fluido da espuma. 10