Profª Eleonora Slide de aula

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1 Proteínas Profª Eleonora Slide de aula

2 Estruturas conformacionais Proteínas São resultantes das forças de ligação entre os diferentes segmentos da cadeia polipeptídica e freqüentemente envolvem grupamentos funcionais das cadeias laterais. Estrutura secundária As rotações em torno das ligações adjacentes à ligação peptídica originam essencialmente dois tipos de estrutura: as hélices e as folhas pregueadas. Estabilização das conformações Tanto as hélices como as folhas pregueadas são estabilizadas por pontes de hidrogênio que se estabelecem entre o oxigênio do grupo carbonila (>C=O) de determinados aminoácidos e o hidrogênio do grupo amina (>N-H) de outros aminoácidos. Nas hélices, estes grupos pertencem à mesma cadeia polipeptídica (segmentos peptídicos adjacentes); nas folhas pregueadas estes grupos pertencem a cadeias diferentes (ou à mesma cadeia depois da cadeia ter se dobrado). As estruturas dos diferentes aminoácidos influenciam a adoção, pela cadeia, de um determinado tipo de estrutura secundária, isto é, existe uma correlação entre seqüência e conformação.

3 O ácido glutâmico, a alanina e a leucina dão principalmente origem à α hélices, enquanto a valina e a isoleucina originam folhas β pregueadas. Prolina, glicina e asparagina causam reversões na cadeia, através das qual a cadeia polipeptídica dobra 180º. Para a formação de α hélices (a mais freqüente, com 3,6 resíduos de aminoácidos) a rotação ocorre no mesmo sentido; para a formação de folhas β pregueadas, os ângulos de torção têm sinal contrário. Ligações por pontes As folhas β pregueadas são: paralelas quando as cadeias polipeptídicas estão dispostas paralelamente no mesmo sentido; antiparalelas quando estão em sentidos opostos. de hidrogênio entre resíduos da mesma cadeia Ligações por pontes de hidrogênio entre cadeias ou segmentos polipeptídicos diferentes α hélice Folha β pregueada

4 Estrutura terciária Este nível de estrutura corresponde à conformação tridimensional das cadeias polipeptídicas e é fundamental para a atividade biológica. Enquanto a estrutura secundária é determinada por interações de grupos R próximos entre si, a estrutura terciária é conferida pela interação a longa distância na seqüência de aminoácidos da cadeia. Resíduos de aminoácidos muito distanciados uns dos outros, na seqüência, podem se encontrar próximos devido aos enrolamentos e formar, desse modo, regiões indispensáveis ao funcionamento da proteína - por exemplo, o centro ativo das enzimas. Forças que estabilizam a estrutura terciária Pontes de hidrogênio entre grupos R de resíduos pertencentes a alças adjacentes Atração iônica entre grupos R com cargas elétricas opostas Interações hidrofóbicas Ligações dissulfeto

5 Estrutura quaternária Corresponde a associações, quase sempre reversíveis, mantidas por ligações fracas (não covalente) entre várias cadeias polipeptídicas idênticas ou diferentes. A estrutura quaternária designa o arranjo de subunidades polipeptídicas (monômeros). A proteína é, portanto oligomérica sendo, por exemplo, um dímero se for constituída por duas subunidades ou um tetrâmero se for constituída por quatro subunidades. Observação: O número de cadeias polipeptídicas de uma proteína oligomérica pode ser avaliado pela determinação do número de resíduos N-terminal existente na molécula de proteína.

6 Estrutura da toxina diftérica Apresenta segmentos em α-hélice, em folha β pregueada e sem estrutura regular. Desnaturação As proteínas sofrem desnaturação em decorrência de alterações na sua estrutura conformacional. Na desnaturação não ocorre o rompimento das ligações covalentes do esqueleto da cadeia polipeptídica, ou seja, a estrutura primária da proteína é mantida. Entretanto, as alterações no seu arranjo espacial resultam na perda da atividade biológica. A desnaturação pode ser provocada por: Calor Solutos (ex: uréia, etc.) Valores extremos de ph Detergentes Solventes orgânicos (ex: etanol, acetona, etc.) Agitação vigorosa

7 Classificação das proteínas de acordo com a função biológica Classe Enzimas Proteínas transportadoras Proteínas nutritivas e de reserva Proteínas contráteis ou de movimento Proteínas estruturais Proteínas de defesa Proteínas reguladoras Exemplo Ribonucleases Tripsina Hemoglobina Lipoproteínas Ovoalbumina (ovo) Caseína (leite) Actina Miosina Tubulina Colágeno Elastina Queratina Fibroína Fibrinogênio Trombina Veneno de serpente Toxinas bacterianas Insulina Hormônio de crescimento Repressores

8 Classificação das proteínas de acordo com a forma Proteínas globulares Com cadeia(s) polipeptídica(s) fortemente enrolada em forma globular ou esférica. Usualmente solúvel em sistemas aquosos e se difundem facilmente. Proteínas globulares são quase todas as enzimas, as proteínas de transporte, os anticorpos e as proteínas de reserva nutritiva. Proteínas fibrosas Com cadeia(s) polipeptídica(s) estendida ao longo de um eixo. São insolúveis em água, compridas e filamentosas. A maioria tem função estrutural. Proteínas fibrosas típicas são: a queratina, o colágeno e a fibroína. Incluem, também, as proteínas que participam de processos contráteis como a actina e miosina.

9 Aminoácido Citocromo Quimotripsinogênio Composição em humano aminoácidos de duas bovino ** Ala 6 22 proteínas Arg 2 4 Asn 5 15 Asp 3 8 Os números representam Cys 2 10 resíduos de cada aminoácido, Gln 2 10 por molécula de proteína Glu 8 5 Gly His 3 2 Ile 8 10 Leu 6 19 Lys Met 3 2 Phe 3 6 Pro 4 9 Ser 2 28 Thr 7 23 Trp 1 8 * proteína mitocondrial transportadora de elétrons. Tyr 5 4 ** precursor inativo da enzima Val 3 23 Total

10 Proteínas Conjugadas Classe Lipoproteínas Glicoproteínas Fosfoproteínas Hemoproteínas Flavoproteínas Metaloproteínas Grupo prostético* Lipídeos Carboidratos Grupos fosfato Heme (ferroporfirina) Nucleotídeos de flavina Ferro Zinco Exemplo Lipoproteína do sangue γ-globulina do sangue Caseína do leite Hemoglobina Desidrogenase succínica Ferritina Desidrogenase alcoólica * porção de uma proteína conjugada não constituída por aminoácidos.

11 Características moleculares de algumas proteínas Peso Molecular Nº. de Resíduos Nº. de Cadeias Insulina (bovina) * Ribonuclease (pâncreas bovino) Lisozima (clara de ovo) Mioglobina (coração eqüino) Quimotripsina (pâncreas bovino) * Hemoglobina (humana) * Albumina do soro (humana) Hexoquinase (levedura) * γ - globulina (cavalo) * Desidrogenase glutâmica (fígado bovino) * * proteínas oligoméricas (duas ou mais cadeias polipeptídicas). Observação: Peso molecular (proteínas simples) 110 = Número de resíduos de aminoácidos

12 Separação e purificação de proteínas Diálise Filtração em gel Eletroforese Cromatografia de troca iônica Diálise Uma membrana (ex: papel celofane) contendo a solução de proteína e outros solutos permite que a água e solutos pequenos, como o NaCl e a glicose, passem livremente através dela. Não permite, porém, a passagem de solutos grandes como as proteínas O tubo de diálise contendo a mistura de moléculas de proteína (azul) e de moléculas pequenas (vermelhas) é imerso em um volume grande de solução tampão (a). Como a membrana semipermeável permite a passagem apenas das moléculas pequenas, sua concentração dentro e fora do saco tende a se igualar (b). Após várias trocas de tampão (c), restam apenas as moléculas de proteína dentro do saco de diálise (d).

13 Filtração em gel Separação de proteínas com base no tamanho por filtração em gel. A mistura de proteínas em solução é passada pela coluna de esferas muito pequenas e porosas de um polímero hidrofílico. Derivados de dextrana são amplamente empregados. As proteínas com molécula pequena podem penetrar no interior das esferas, porém as proteínas maiores não o fazem. O peso molecular de uma proteína pode ser determinado por comparação da velocidade com que atravessa a coluna com a velocidade de outras proteínas de peso molecular conhecido. Uma mistura de proteínas grandes e pequenas é aplicada em uma coluna de esferas de dextrana. À medida que o solvente flui pela coluna as moléculas pequenas de proteína penetram nas esferas e são retardadas. As moléculas grandes de proteína emergem primeiro da coluna.

14 Eletroforese As várias formas de eletroforese são muito eficiente para separar moléculas carregadas. 1) Eletroforese em tira de acetato de celulose (umedecida com um tampão de ph conhecido) Uma mistura de três proteínas (A, B e C) é aplicada sobre uma tira de papel ou acetato de celulose, umedecida com tampão. A tira é colocada em um equipamento apropriado e um campo elétrico é aplicado ao sistema (a). As proteínas migram de sua posição inicial (b) para os pólos, de acordo com a carga que apresentam no ph do tampão utilizado. Depois de algum tempo, a eletroforese é interrompida e a posição das proteínas é revelada (c).

15 Pontos isoelétricos de algumas proteínas Proteínas pi Proteínas pi Pepsina < 1,0 Hemoglobina 6,8 Ovoalbumina 4,6 Mioglobina 7,0 Soroalbumina 4,9 Quimotripsinogênio 9,5 Urease 5,0 Citocromo C 10,7 β-lactoglobulina 5,2 Lisozima 11,0 γ-globulina 6,6

16 2) Eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida Uma molécula desloca-se em uma velocidade proporcional à sua densidade de carga total, tamanho e forma. As amostras são aplicadas em poços na parte superior do gel. Moléculas carregadas negativamente migram através da matriz do gel em direção ao ânodo, em resposta ao campo elétrico aplicado. A mobilidade das moléculas pequenas é maior do que a das grandes com a mesma densidade de carga. Após a eletroforese, as moléculas separadas são visualizadas por meio de técnicas de coloração, de fluorescência ou por técnicas radiográficas. O ph no gel deve ser alto o suficiente de forma que praticamente todas as proteínas possuam carga líquida negativa e se movam em direção ao ânodo quando a voltagem é aplicada.

17 Cromatografia de troca iônica Explora as diferenças no comportamento ácido-base dos aminoácidos e das proteínas. Resinas: Com grupos aniônicos (-) trocadoras de cátions Com grupos catiônicos (+) trocadoras de ânions Exemplo: Resina de troca catiônica (grupos sulfônicos) A mistura de proteínas (ou de aminoácidos) deve estar em solução ácida. Portanto, são cátions com carga líquida positiva, porém, com diferentes graus de ionização. Aminoácidos com carga positiva (lisina, arginina e histidina) deslocam, com mais facilidade, o Na + da resina e são ligados mais fortemente Aminoácidos com menor quantidade de carga positiva (ácidos glutâmico e aspártico) se ligam com a menor intensidade sítios aniônicos SO 3 Na + SO 3 Na NH 3 -CHR 1 -COOH + NH 3 -CHR 2 -COOH troca de cátions Todos os demais aminoácidos têm quantidade intermediária de carga positiva partícula de resina SO + 3 NH 3 -CHR 1 -COOH SO NH 3 -CHR 2 -COOH 2 Na +

18 A eluição é feita com diferentes tampões com valores de ph sucessivamente mais elevados