Técnicas de isolamento de organelos

Transcrição

1 Técnicas de isolamento de organelos Estudo de processos metabólicos Fraccionamento celular e isolamento de organelos ou partículas 1

2 Estrutura duma célula animal Estrutura duma célula vegetal 2

3 Organelos duma célula eucariótica Lisossomas Peroxissomas Mitocôndrias Cloroplastos Retículo endoplásmico (ER) Complexo de Golgi Núcleo (Citosol) Lisossomas Responsáveis pela degradação de: alguns componentes celulares material captado do meio extracelular Características: membrana única ph do lumen 5 hidrolases ácidas catalisam reacções de degradação 3

4 Peroxissomas Responsáveis pela degradação de: ácidos gordos compostos tóxicos Características: membrana única contém oxidases e catalase Mitocôndrias Local da produção aeróbica de ATP Características: membrana externa espaço intermembranar membrana interna matriz 4

5 Cloroplastos Local da fotossíntese nas plantas e algas verdes Características: membrana externa espaço intermembranar membrana interna estroma membranas tilacóides lumen dos tilacóides Retículo endoplásmico (ER) Responsável por: parte da síntese lipídica maioria da síntese proteica armazenamento do ião Ca ++ destoxificação Características: rede de túbulos e vesículas membranares fechadas e interligadas composto por regiões lisas e rugosas 5

6 Complexo de Golgi Modifica e exporta muitos produtos do ER Características: compartimentos e vesículas achatadas composto por 3 regiões: cis (entrada), media, trans (saída) cada região contem um conjunto de enzimas diferente Núcleo Separa: o DNA do citosol a transcrição e a tradução Características: membrana externa membrana interna poros nucleares nucléolo 6

7 Citosol Porção da célula envolvida pela membrana plasmática mas que não é parte de nenhum organelo Características: citoesqueleto polirribossomas diversidade de enzimas do metabolismo Fraccionamento celular 1.Disrupção/homogenização - dispersão do tecido - ruptura controlada das células - libertação dos organelos 7

8 Fraccionamento celular 1.Disrupção/homogenização 2. Fraccionamento - separação do homogenato em partículas - recorre, p.ex., a diferenças de tamanho/forma, densidade, carga superficial Fraccionamento celular 1.Disrupção/homogenização 2. Fraccionamento 3. Análise - microscopia - enzimas marcadores - pigmentos ou proteínas específicas 8

9 1.Disrupção/homogenização - dispersão do tecido e ruptura controlada das células - método e dimensões do aparelho adaptadas a cada caso (eficiência da ruptura vs. minimizar danos mecânicos) osmóticos (lise hipotónica) métodos digestão enzimática (ex. lipases, proteases) mecânicos ex. métodos mecânicos: homogenizador tipo Potter homogenizador de lâminas misturador comercial almofariz homogenizador para eppendorfs 9

10 RUPTURA DO TECIDO/CÉLULAS: Organelos retirados do meio envolvente utilização de meio de extracção iso- osmótico p.ex.,., com sacarose ou sorbitol libertação de ácidos e outras substâncias acumuladas nalguns organelos Solução tampão mantém m ph oxidações (>O2, oxidases) Substâncias antioxidantes (ex.c ex.c/sh) desnaturação proteica libertação de proteases, lipases, (ex.dos lisossomas) realizar todo o processo a baixa temperatura ( 4ºC) 2. Fraccionamento - separação dos homogenato em partículas com base essencialmente em diferenças nas suas propriedades físicas centrifugação ( tamanho/forma e/ou densidade) alguns métodos electroforese ( carga eléctrica) cromatografia ( solubilidade, dimensão, etc) partição ( solubilidade) 10

11 -podem usar-se vários métodos em sequência - separação de organelos quase sempre recorre à centrifugação CENTRÍFUGA (ou CENTRIFUGADORA): Geralmente tem um motor, que faz rodar um rotor que contém tubos com as amostras experimentais. Pode ser refrigerada. CENTRIFUGAÇÃO Utilização da força centrífuga para separar componentes biológicos com base nas suas propriedades de sedimentação. UTILIZAÇÕES PRINCIPAIS: separar estruturas ou macromoléculas de diferente massa ou densidade, presentes numa solução. separar matéria sólida (resíduo) dos solutos dissolvidos (no sobrenadante) 11

12 Rotor basculante - mais fácil retirar o sobrenadante sem deslocar o resíduo do fundo do tubo - MAS não permite velocidades de rotação tão elevadas como rotores de ângulo fixo. Rotor de ângulo fixo sobrenadante resíduo resíduo - permite velocidades de aceleração mais elevadas. 12

13 PRINCÍPIOS DA CENTRIFUGAÇÃO F c =mω 2 r força de sedimentação duma partícula de massa m; ω-velocidade angular do rotor; r-distância da partícula ao eixo de rotação OU SEJA, QUANTO MAIOR FOR A MASSA DE UMA PARTÍCULA E MAIOR A FORÇA CENTRÍFUGA, MAIS RAPIDAMENTE ELA SE DESLOCA NUM CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA. - Forças que se opõem à centrifugação: 1. força de impulsão ou flutuação 2. Resistência da fricção (atrito) 13

14 1. força de impulsão ou flutuação: F i =mω 2 rνρ ν volume parcial específico da partícula; ρ densidade da solução Fc= mω 2 r mω 2 rνρ = mω 2 r(1-νρ) OU SEJA: - QUANTO MAIS DENSA FOR UMA PARTÍCULA (i.e., menor for ν), MAIS RAPIDAMENTE SE DESLOCA NUM CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA - QUANTO MAIS DENSA FOR A SOLUÇÃO, MAIS LENTAMENTE UMA PARTÍCULA SE DESLOCA NUM CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA. 2. força de atrito - depende de factores como a viscosidade do meio, a forma da partícula, etc ex: mais atrito menos atrito QUANTO MAIOR FOR O COEFICIENTE DE ATRITO, MAIS LENTAMENTE SE DESLOCA UMA PARTÍCULA NUM CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA. 14

15 TIPOS DE CENTRIFUGAÇÃO - Centrifugação diferencial - Centrifugação em gradientes de densidade - Centrifugação diferencial: - centrifugações sequenciais, a velocidades cada vez mais elevadas 15

16 Fraccionamento celular por centrifugação diferencial - Centrifugação em gradientes de densidade inicial força centrífuga final aumento da densidade do meio partículas menos densas partículas de densidade intermédia partículas mais densas - a densidade da solução aumenta ao longo do tubo - as partículas distribuem-se de acordo com as densidades - melhor separação, mas: - mais demorado - mais caro - menor capacidade 16

17 Separação de organelos por centrifugação em gradientes de densidade CONVERSÃO RCF/r.p.m - Aceleração duma centrífuga expressa normalmente em RCF (força centrífuga relativa à aceleração da gravidade) - RCF expresso em xg - centrífugas regulam-se em rotações por minuto (r.p.m.) para obter a mesma força centrífuga em rotores de diferentes raios r, e centrífugas diferentes: RCF=1,19x10-5 (r.p.m.) 2 r (r expresso em cm) 17

18 3. Análise microscopia (c/ corantes específicos) alguns métodos actividade de enzimas marcadores (específicos dum determinado organelo) pigmentos ou proteínas específicas concentração de proteína Alguns marcadores: Componente celular Marcador Núcleo Mitocôndrias Lisossomas Peroxissomas Citosol DNA Succinato desidrogenase citocromo oxidase fosfatase ácida catalase lactato desidrogenase 18

19 Próximo trabalho: 1. Homogenizar num meio isotónico (MI) disrupção ão/homogeniza homogenização (almofariz + areia de quartzo) atenção aos componentes do meio de homogenização ão! 2. Filtrar através de gaze para um tubo de centrífuga sobrenadante 3. Centrifugar pos - nuclear 1000x g, 5 min fracção nuclear 4. Deitar sobrenadante num tubo limpo sobrenadante pos - mitocondrial 5. Centrifugar x g, 5 min fracção mitocondrial 6. decantar sobrenadante e ressuspender fracção mitocondrial 1. Homogenizar num meio isotónico (MI) fraccionamento (centrifugação diferencial) 2. Filtrar através de gaze para um tubo de centrífuga sobrenadante 3. Centrifugar pos - nuclear 1000x g, 5 min fracção nuclear 4. Deitar sobrenadante num tubo limpo sobrenadante pos - mitocondrial 5. Centrifugar x g, 5 min fracção mitocondrial 6. decantar sobrenadante e ressuspender fracção mitocondrial 19

20 análise de: Consumo de oxigénio Proteína Actividade da succinato desidrogenase 20