EXTRAÇÃO DE DNA (3) A EXTRAÇÃO DE DNA A PRÁTICA NO LABORATÓRIO DE ENSINO BIBLIOGRAFIA

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1 EXTRAÇÃO DE DNA (3) A EXTRAÇÃO DE DNA Muitas pesquisas de Biologia Molecular começam com a extração de ácidos nucleicos. A lise celular libera as moléculas em uma fase aquosa que é separada dos restos celulares por centrifugação. As proteínas são removidas da fase aquosa por solventes orgânicos (fenol, clorofórmio). O DNA, que permanece na fase aquosa, é precipitado com etanol e, posteriormente, purificado e suspendido em um buffer adequado. A existência de kits comerciais tem mudado a rotina de muitos laboratórios. Nos kits, os solventes orgânicos são substituídos por filtros que retém o DNA, em condições de concentração salina elevada. A eluição do DNA retido no filtro ocorre em baixa concentração salina. A PRÁTICA NO LABORATÓRIO DE ENSINO Por alguma razão que nos escapa, a extração de DNA é uma atividade que entusiasma a alguns e decepciona a outros. Provavelmente, as diferenças de opinião tenham mais a ver com a personalidade dos alunos e suas fantasias que com a atividade em si. As etapas possíveis no laboratório de ensino são as seguintes: 1. Trituramento do tecido, para separar as células. 2. Lise das membranas celulares com detergente, em uma solução salina, para liberar os ácidos nucleicos e as proteínas. 3. Digestão das proteínas por ação enzimática de proteases (Opcional). 4. Precipitação com etanol gelado. O DNA é solúvel em álcool, mas torna-se insolúvel na presença de sal (NaCl), porque o sódio neutraliza a carga negativa dos grupos fosfatos. O etanol formará uma camada na superfície por ser menos denso que a solução aquosa. 5. Observação de agregados moleculares, de consistência mucoide, na interface entre a solução aquosa e o álcool. Os agregados moleculares obtidos são uma mistura em proporção variável de ácidos nucleicos, proteínas e pectina, um carboidrato presente na lamela intercelular e no vacúolo das células vegetais. BIBLIOGRAFIA MADDEN D. Discovering DNA. Science in School 1: Spring GENETIC SCIENCE LEARNING CENTER. How to extract DNA from anything living. learn.genetics.utah.edu

2 ATIVIDADE PRÁTICA OBJETIVO Extrair DNA a partir de diversas fontes vegetais. MATERIAIS Uma fonte vegetal de DNA, sal grosso, detergente neutro (lava louças), água fria, liquidificador ou processador de alimentos, coador, béquer, amaciante de carne com protease (papaína), etanol gelado, tubos de ensaio e grade (substituíveis por frascos pequenos ou copos), 1 pipeta ou proveta, vareta de madeira ou agulha de crochet. PROCEDIMENTO O etanol deve ser colocado no congelador, em frasco fechado, pelo menos um dia antes da realização da prática. As membranas celulares e nucleares das células são desagregadas com detergente, em solução salina, liberando os ácidos nucleicos que precipitam com a adição de etanol gelado. A. Preparação da amostra 1. Escolher a fonte de DNA (Folhas, frutos, flores ou sementes) 2. Triturar o tecido Bater no liquidificador (15-20 seg.), triturar no processador de alimentos (15 a 20 seg.) ou esmagar manualmente o tecido em uma sacola plástica, até obter um volume aproximado de 100 ml. A quantidade de água a ser acrescentada depende da fonte vegetal escolhida. 3. Coar a massa, de maneira a obter um suco espesso.

3 B. Teste de pectina (Controle) 1. Separar uma parte do suco e misturar com uma quantidade equivalente de etanol (95 0 ). 2. Agitar a mistura, deixar repousar e observar o precipitado formado. 3. Interpretar. Um coágulo transparente, bastante gelatinoso e firme indica alto teor de pectina; um coágulo frágil, mais ou menos gelatinoso, que se rompe e divide em 2 ou 3 pedaços quando é feita uma agitação leve indica um teor médio, moderado de pectina; um precipitado filamentoso granulado, que se rompe em vários pedaços com agitação bastante leve indica baixo teor de pectina. C. Extração do DNA 1. Lise das membranas celulares. No resto do suco, dissolver uma pitada de sal grosso antes de acrescentar duas colheres, das de sopa, de detergente. Misturar suavemente e deixar em repouso durante 5 a 10 minutos. 2. Digestão das proteínas. Colocar uma pitada de amaciante de carne nos recipientes (tubos de ensaio, frascos, copos) onde será realizada a extração. Distribuir suavemente o suco, sem ultrapassar 1/3 da capacidade do recipiente. 3. Precipitação do DNA com etanol gelado. Acrescentar um volume equivalente de etanol 95 0 gelado. Esta etapa é crítica, deve-se inclinar levemente o tubo e, muito devagar, deixar escorrer o etanol sobre o líquido de maneira a formar uma segunda camada por cima da solução. Aguardar 10 minutos sem misturar as camadas e observar os agregados moleculares que precipitam na interface das duas e sobe até a superfície. Etanol gelado 4. Observação dos agregados moleculares formados. 5. Comparar esses agregados com os formados no teste de pectina. 6. Retirar o DNA com uma vareta de madeira ou uma agulha de crochet

4 NOSSO COMENTÁRIO Por motivos de biossegurança, descartamos a extração de DNA de fontes animais e humanas no laboratório de ensino. De um modo geral, a fonte de DNA deve ser suficientemente barata como para permitir multiplicar as estações de trabalho. Tivemos muito bons resultados com o germe de trigo natural, mas nem sempre o encontramos no comércio. As frutas são interessantes, a condição de escolher as de baixo teor de pectina (abacaxi, acerola, maracujá, morango, pera, pêssego, caju etc.). O procedimento de extração de DNA foi aplicado a várias fontes vegetais, utilizando um lava louças (Limp) e um amaciante de carne como fonte de protease (Maggi). Paralelamente, repetiu-se o procedimento com um lava roupas que contém enzimas (Ariel). Aplicou-se o teste de pectina como controle. A escolha da cebola se justifica por ser um clássico dos protocolos disponíveis na Web, mas apresenta o inconveniente do cheiro forte e gera reclamações lacrimejantes. Além disso, a maior parte dos agregados formados parece ser de pectina (Figura 1). Figura 1: Extração de DNA de cebola roxa. 1: teste de pectina; 2: extração com lava louças e protease; 3: extração com um lava roupas líquido com enzimas.

5 A couve foi um sucesso totalmente inesperado (Figura 2). O aspecto dos aglomerados no teste de pectina e nos testes de extração é muito diferente, indicando que estaríamos em presença de DNA. No teste da pectina, na camada superior se observam restos de tecido que a coagem não elimina. Tal vez fosse conveniente substituir o coador por um filtro de pano ou de papel. Os experimentos realizados com kiwi e maracujá foram desapontadores (Figuras 3 e 4). Tal vez porque as frutas não estivessem suficientemente maduras. O resultado com o abacaxi é interessante, mas faltou o teste de pectina. Figura 2: Extração de DNA de couve 1: teste de pectina; 2: extração com lava louças e protease; 3: extração com um lava roupas líquido com enzimas.

6 Figura 3: Extração de DNA de maracujá 1: teste de pectina; 2: extração com um lava roupas líquido com enzimas; 3: extração com lava louças e protease. Figura 4: Extração de DNA de kiwi 1: teste de pectina; 2: extração com lava louças e protease; 3: extração com um lava roupas líquido com enzimas.

7 Figura 5: Extração de DNA de kiwi e abacaxi. Kiwi Abacaxi COMO MONTAR UM PROJETO Extrair o DNA de frutas com diferente grau de amadurecimento. Extrair o DNA de frutas tropicais.