Preparo, Identificação e Armazenamento de amostras biológicas

Transcrição

1 Curso de Boas Práticas Laboratoriais Preparo, Identificação e Armazenamento de amostras biológicas Silene Peres Keusseyan Maio/2011

2 Centrifugas Poucos experimentos são realizados sem pelo menos uma passagem pela centrífuga Usadas para separar partículas de uma solução Em laboratórios de pesquisa biológica: Sangue Células Separação de fases Organelas Isolamento de macromoléculas (DNA, RNA, vírus, proteínas)

3 Centrifugação Qual velocidade? rpm x rfc (g)? Qual o tipo de separação desejado? Qual centrífuga usar? Que temperatura? Qual o tubo apropriado? Qual o rotor? Como centrifugar

4 Força centrífuga A força centrífuga relativa (Rcf) cuja unidade é o g é gerada quando uma partícula ou conjunto de partículas é sujeito a um movimento circular de aceleração Rcf (g) = 1,12 x 10-5 x R x N 2 R = raio em centímetros R = raio em centímetros N = velocidade de centrifugação em rpm 1 g equivalente à aceleração da gravidade na superfície da Terra

5 Força centrífuga

6 Tipos de centrifugação Centrifugação diferencial (separação de fases) Amostras centrifugadas a certa velocidade resultam em sobrenadante e pélete (baseada no tamanho das partículas) Tamanho maior sedimenta mais rápido Ex: separação do sangue em elementos figurados e plasma / soro,

7 Tipos de centrifugação Centrifugação por gradiente de densidade Centrifugação de escala zonal Separação de partículas com diferentes densidades Ex: separação de mononucleares por Ficoll-Hypaque Hemácias:1095 densidade, mononucleares 1065 e Ficoll 1077 Utiliza gradiente de meio viscoso Sangue diluído Ficoll- Hypaque soro plaquetas Mononucleares nuvem Ficoll-Hypaque eritrócitos granulócitos

8 Centrífugas Centrífuga de bancada Centrífuga de bancada refrigerada Centrífuga de alta velocidade Ultracentrífuga Microcentrífuga Citocentrífuga

9 Centrífuga de bancada Múltiplos fins: peletizar células e bactérias, sedimentação de soro, urina, células e sangue Suporte oscilante: até 3.800g ou rpm Capacidade: normalmente 32 x 5mL ou 16 x 10mL Com ou sem tacometro Controle de tempo Sem freio Fanem Excelsa Baby mod 206

10 Centrífuga de bancada refrigerada Múltiplos fins: peletizar células e bactérias, sedimentação de soro, urina,células e sangue Ângulo fixo 2 tipos de rotores: 28 x 2 ml máx 14500rpm 17400rcf (g) 10 x 10 ml máx 13500rpm 16900rcf (g) Refrigeração : -8 C até +40 C Controle de aceleração/desaceleração (alta para peletização, baixa para gradientes) Memória para programas Sensor tampa fechada Jouan MR 18.22

11 Centrífuga de alta velocidade refrigerada Precipitações de grandes volumes 2 tipos de rotor (R24A e R12A3) Ângulo fixo R24A: 8 x 50mL máx 24000rpm 68900rcf (g) R12A3: 6 x 300mL máx 12000rpm 23800rcf (g) Refrigeração: -20 C até +40 C Controle de aceleração/desaceleração Controle de tempo Sensor tampa fechada Hitachi Himac CR21

12 Ultracentrífuga Sedimentação de macromoléculas, ribossomos, vírus... Ângulo fixo ou suporte oscilante Até rpm rcf (g) Tubos tamanhos variáveis, Chão ou bancada Programável Sempre refrigerada Câmara fechada à vácuo (atrito com ar eleva temperatura e diminui velocidade) Programável Sorvall WX

13 Microcentrífuga Volumes pequenos, precipitação de células (baixa velocidade), retirada de debris, extrações com etanol e minifenol Ângulo fixo: máx 14000rpm Capacidade :tubos eppendorf 20 x 2mL Sensor tampa Sem refrigeração Jouan A14

14 Citocentrífuga Produção de monocamada de células em área definida Ex: lâminas para detecção de Anca Cytofunnel saída única ou dupla Programável Capacidade até 12 câmaras Suporte oscilante:200 a 2000rpm Sensor tampa fechada + tampa de segurança Cytospin 2 Shandon

15 Rotor

16 Tubos Seleção do tubo adequado: De acordo com o tipo de rotor Evitar vazamento ou perda da amostra (mecanismo de lacre) Assegura compatibilidade química (resistência) Permite fácil recuperação da amostra (transparência)

17 Como centrifugar Conheça as limitações de velocidade da centrífuga e dos rotores Equilibre todos os tubos com seus suportes, tampas, proteção e pinos Se usar um tubo para equilibrar, encha-o com material similar ao que vai centrifugar - água = contrabalancear fora do meio Utilize tubos, tampas e suportes apropriados (filme plástico) Preencha os tubos até 1 ou 2 cm da borda Tubos íntegros ( sem rachaduras)

18 Como centrifugar Suportes não utilizados podem desequilibrar a centrífuga Materiais infecciosos SOMENTE EM TUBO FECHADO Retire as amostras da centrífuga assim que terminar - amostras paradas = pélete disperso Centrífugas refrigeradas: feche a tampa no intervalo das centrifugações (evitar queda de temperatura e condensação) e deixe aberta quando terminar (secar) Limpe com pano macio e hipoclorito/álcool 70% quando acabar de usar

19 Como equilibrar os tubos Tubos frente a frente = mesmo peso Microcentrífuga ajuste por volume, não por peso Alta velocidade ou ultra centrífuga pesar tubos em duplas com balança de pratos Suportes de 4 tubos ou mais equilibrar dois conjuntos em balança de pratos e colocá-los frente a frente Suportes não completos = equilibre na diagonal Amostras estéreis equilibre o volume dos pares a olho, se necessário ajustar suportes use álcool 70% fora do tubo Use o mesmo meio que sua amostra para ajustar tubos sem par

20 Armazenamento de amostras Tubos e caixas apropriados e identificados

21 Identificação Canetas permanentes e durex sobre o escrito para tubos e caixas NUNCA identifique amostras de pacientes pelas iniciais Ex: MCO = Maria Cristina Oliveira quantas? Todo material coletado pela disciplina, pertence à disciplina, não ao pós-graduando Material devidamente identificado pode ser utilizado no futuro 001 LESa SPK 03/05/11 Caixa 1 De 001 a xxx LESa ou protocolo YY NPS ano 2011

22 Banco de dados 001 LESa SPK 20/07/2004 data coleta Nº ENSAIO RG HSP Nome SEXO Idade Sledai ETNIA ACR FAN DNAifi DNA EIA CH100/C2 20/07/ Bruna Suzuki Donoso F 14 6 NC 4 PF 1:320 NEG U/>100% 27/09/ Helen Micaela A Aguiar F 6 6 C 9 PF>1:320 NEG U/67 17/08/ Fernando de Souza M 16 8 C 5 NEG NEG /09/ Liliam Bruna O Magalhães F 17a 11m 8 C 6 PF 1:80 NEG /88% 28/09/ Juliane B de Oliveira F 18a 11m 12 C 7 PF 1:80 NEG />100% 19/10/ Paula Ferreira F C 6 PF1:640 NEG 74 <30/43% 15/07/ Thiago L de Oliveira M C 9 PF 1:320 NEG /100 16/08/ Isabela C de Souza F NC 6 HO >1:640 1/ />100% 19/04/ Jaqueline R S Albuquerque F 11 8 C 5 PG >1:640 NEG />100% Entregue ao orientador ao final da tese

23 Conservação de amostras

24 Conservação de amostras Geladeira: material biológico temporariamente, reagentes e soluções pelo prazo de validade dos mesmos Sangue total: utilização imediata para ensaios hemodinâmicos e dosagens bioquímicas, geladeira por 1 semana* ou -20ºC somente para futura extração de DNA Soro ou plasma: -20ºC por tempo indeterminado (selado) Células sempre em solução de tamponamento para morte celular -70ºC por tempo limitado, nitrogênio líquido (-196 C ) por tempo indeterminado Tecidos ou orgãos: -70ºC

25 Conservação de amostras Alíquotas Por que fazer? Prevenir decomposição por congelamentos e descongelamentos repetidos Prevenir contaminação por múltiplos usos Por conveniência física Para economizar tempo no preparo de uma solução ou tempo de descongelamento

26 Freezers -20º e -70ºC Só abra a porta quando necessário e por pouco tempo Se precisar manipular alguns tubos, retire a caixa do freezer e coloque no gelo enquanto procura Todas caixas ou recipientes colocados no freezer devem estar devidamente ROTULADOS e TAMPADOS Periodicamente descarte material que não for mais utilizar Mantenha um registro da localização de seus materiais Respeite os espaços Não altere localização de material alheio Providencie descongelamento quando necessário (só -20ºC)

27 UNIFESP Disciplina de Reumatologia Na Bancada - Manual de iniciação científica em laboratório de pesquisas biomédicas, Kathy Baker, Editora Artmed, 2002 Boas Práticas de Laboratório, Maria de Fátima da Costa Almeida, Editora Difusão, 2008 Centrifugation: Essential Data, by David Rickwood et al, 1994