Técnicas de isolamento de organelos

Transcrição

1 Técnicas de isolamento de organelos Estudo de processos metabólicos Fraccionamento celular e isolamento de organelos ou partículas Estrutura duma célula animal 1

2 Estrutura duma célula vegetal Organelos duma célula eucariótica Lisossomas Peroxissomas Mitocôndrias Cloroplastos Retículo endoplásmico (ER) Complexo de Golgi Núcleo (Citosol) Lisossomas Responsáveis pela degradação de: alguns componentes celulares material captado do meio extracelular membrana única ph do lumen 5 hidrolases ácidas catalisam reacções de degradação 2

3 Peroxissomas Responsáveis pela degradação de: ácidos gordos compostos tóxicos membrana única contém oxidases e catalase Mitocôndrias Local da produção aeróbica de ATP membrana externa espaço intermembranar membrana interna matriz Cloroplastos Local da fotossíntese nas plantas e algas verdes membrana externa espaço intermembranar membrana interna estroma membranas tilacóides lumen dos tilacóides 3

4 Retículo endoplásmico (ER) Responsável por: parte da síntese lipídica maioria da síntese proteica armazenamento do ião Ca ++ destoxificação rede de túbulos e vesículas membranares fechadas e interligadas composto por regiões lisas e rugosas Complexo de Golgi Modifica e exporta muitos produtos do ER compartimentos e vesículas achatadas composto por 3 regiões: cis (entrada), media, trans (saída) cada região contem um conjunto de enzimas diferente Núcleo Separa: o DNA do citosol a transcrição e a tradução membrana externa membrana interna poros nucleares nucléolo 4

5 Citosol Porção da célula envolvida pela membrana plasmática mas que não é parte de nenhum organelo citoesqueleto polirribossomas diversidade de enzimas do metabolismo Fraccionamento celular 1.Disrupção/homogenização - dispersão do tecido - ruptura controlada das células - libertação dos organelos Fraccionamento celular 1.Disrupção/homogenização 2. Fraccionamento - separação do homogenato em partículas - recorre, p.ex., a diferenças de tamanho/forma, densidade, carga superficial 5

6 Fraccionamento celular 1.Disrupção/homogenização 2. Fraccionamento 3. Análise - microscopia - enzimas marcadores - pigmentos ou proteínas específicas 1.Disrupção/homogenização - dispersão do tecido e ruptura controlada das células - método e dimensões do aparelho adaptadas a cada caso (eficiência da ruptura vs. minimizar danos mecânicos) osmóticos (lise hipotónica) métodos digestão enzimática (ex. lipases, proteases) mecânicos ex. métodos mecânicos: homogenizador tipo Potter homogenizador de lâminas misturador comercial almofariz homogenizador para eppendorfs 6

7 Organelos retirados do meio envolvente utilização de meio de extracção isoosmótico p.ex., com sacarose ou sorbitol RUPTURA DO TECIDO/CÉLULAS: libertação de ácidos e outras substâncias acumuladas nalguns organelos Solução tampão mantém ph oxidações (>O2, oxidases) desnaturação proteica libertação de proteases, lipases, (ex.dos lisossomas) Substâncias antioxidantes (ex.c/sh) realizar todo o processo a baixa temperatura ( 4ºC) 2. Fraccionamento - separação dos homogenato em partículas com base essencialmente em diferenças nas suas propriedades físicas centrifugação ( tamanho/forma e/ou densidade) alguns métodos electroforese ( carga eléctrica) cromatografia ( solubilidade, dimensão, etc) partição ( solubilidade) -podem usar-se vários métodos em sequência - separação de organelos quase sempre recorre à centrifugação CENTRÍFUGA (ou CENTRIFUGADORA): Geralmente tem um motor, que faz rodar um rotor que contém tubos com as amostras experimentais. Pode ser refrigerada. 7

8 CENTRIFUGAÇÃO Utilização da força centrífuga para separar componentes biológicos com base nas suas propriedades de sedimentação. UTILIZAÇÕES PRINCIPAIS: separar estruturas ou macromoléculas de diferente massa ou densidade, presentes numa solução. separar matéria sólida (resíduo) dos solutos dissolvidos (no sobrenadante) Rotor basculante - mais fácil retirar o sobrenadante sem deslocar o resíduo do fundo do tubo - MAS não permite velocidades de rotação tão elevadas como rotores de ângulo fixo. Rotor de ângulo fixo sobrenadante resíduo resíduo - permite velocidades de aceleração mais elevadas. 8

9 PRINCÍPIOS DA CENTRIFUGAÇÃO F c =mω 2 r força de sedimentação duma partícula de massa m; ω-velocidade angular do rotor; r-distância da partícula ao eixo de rotação OU SEJA, QUANTO MAIOR FOR A MASSA DE UMA PARTÍCULA E MAIOR A FORÇA CENTRÍFUGA, MAIS RAPIDAMENTE ELA SE DESLOCA NUM CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA. - Forças que se opõem à centrifugação: 1. força de impulsão ou flutuação 2. Resistência da fricção (atrito) 1. força de impulsão ou flutuação: F i =mω 2 rνρ ν volume parcial específico da partícula; ρ densidade da solução Fc= mω 2 r mω 2 rνρ = mω 2 r(1-νρ) OU SEJA: - QUANTO MAIS DENSA FOR UMA PARTÍCULA (i.e., menor for ν), MAIS RAPIDAMENTE SE DESLOCA NUM CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA - QUANTO MAIS DENSA FOR A SOLUÇÃO, MAIS LENTAMENTE UMA PARTÍCULA SE DESLOCA NUM CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA. 9

10 2. força de atrito - depende de factores como a viscosidade do meio, a forma da partícula, etc ex: mais atrito menos atrito QUANTO MAIOR FOR O COEFICIENTE DE ATRITO, MAIS LENTAMENTE SE DESLOCA UMA PARTÍCULA NUM CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA. TIPOS DE CENTRIFUGAÇÃO - Centrifugação diferencial - Centrifugação em gradientes de densidade - Centrifugação diferencial: - centrifugações sequenciais, a velocidades cada vez mais elevadas 10

11 Fraccionamento celular por centrifugação diferencial - Centrifugação em gradientes de densidade inicial força centrífuga final aumento da densidade do meio partículas menos densas partículas de densidade intermédia partículas mais densas - a densidade da solução aumenta ao longo do tubo - as partículas distribuem-se de acordo com as densidades - melhor separação, mas: - mais demorado - mais caro - menor capacidade Separação de organelos por centrifugação em gradientes de densidade 11

12 CONVERSÃO RCF/r.p.m - Aceleração duma centrífuga expressa normalmente em RCF (força centrífuga relativa à aceleração da gravidade) - RCF expresso em xg - centrífugas regulam-se em rotações por minuto (r.p.m.) para obter a mesma força centrífuga em rotores de diferentes raios r, e centrífugas diferentes: RCF=1,19x10 5 (r.p.m.) 2 r (r expresso em cm) 3. Análise microscopia (c/ corantes específicos) alguns métodos actividade de enzimas marcadores (específicos dum determinado organelo) pigmentos ou proteínas específicas concentração de proteína Alguns marcadores: Componente celular Marcador Núcleo Mitocôndrias Lisossomas Peroxissomas Citosol DNA Succinato desidrogenase citocromo oxidase fosfatase ácida catalase lactato desidrogenase 12