Detecção e Quantificação Viral

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1 Detecção e Quantificação Viral Análise e Tratamento de Dados

2 Citomegalovirus i Carga Viral Vírus Epstein Barr Vírus a DNA Amplificação de fragmento de 74 pb Região BNRF1 (LMP2) Extracção do DNA Viral: Equipamento automático Amplificação e Detecção: ABI 7300 ABI º Curso de Virologia Molecular em

3 PCR em Tempo Real PCR Quantificação Absoluta: Uso de calibradores(4 diluições, em triplicado) Expresso em Cópias/ml Controlo Negativo: NTC (Non Template Control) Controlo Interno Extracção: Fluoróforo de normalização: ROX 3 1º Curso de Virologia Molecular em

4 Validação da corrida Calibrador: com amplificação especifica (valor de Ct em função da Concentração) NTC: sem amplificação especifica Controlo Interno Extracção: controla INIBIÇÃO Quantificação: Avaliar Regressão Linear 4 1º Curso de Virologia Molecular em

5 Validação da corrida 5 1º Curso de Virologia Molecular em

6 Validação da corrida 6 1º Curso de Virologia Molecular em

7 Validação da corrida 7 1º Curso de Virologia Molecular em

8 Validação da corrida 8 1º Curso de Virologia Molecular em

9 Quantificação Quantificação Absoluta: Recta com padrões (diluições logaritmicas em série) Dt Determinação da equação da recta através de Regressão Linear Cl Calcula-se l a quantidade tidd de cópias ói de DNA presente na amostra 9 1º Curso de Virologia Molecular em

10 Quantificação Absoluta Em condições ideiais, o número de moleculas é duplicado em cada ciclo. Se inicialmente, tivermos uma quantidade N 0 de DNA dupla cadeia, após x ciclos teremos: N = N 2 C 0 c 10 1º Curso de Virologia Molecular em

11 Eficiência iê i PCR Numa reacção de PCR, não há duplicação do nº de moléculas de DNA em todos os ciclos, uma vez que a Eficiência é inferior a 100% Eficiência: fracção de moléculas que são copiadas por ciclo: il 0 E 1. A Eficiência depende do gene-alvo (t) e do tipo de amostra (s): Após C ciclos, o nº de moléculas dupla cadeia é de: 0 E + c t ts N = N ( 1 ) C 11 1º Curso de Virologia Molecular em

12 Eficiência iê i PCR A quantidade N c depende de N 0, apos um determinado nº de ciclos de amplificação Rearranjando a equação: a quantificação de N C permite o calculo do N 0 caso se conheça a eficiência de amplificação 0 t N = N /( E +11 ) = C ts c 12 1º Curso de Virologia Molecular em

13 Eficiência iê i PCR Aplicando o método do Threshold, desenvolvido por Higuchi et al, temos a seguinte equação: 0 t N = N /( E + 1) T em que Ct corresponde a um ponto teórico em que cada ciclo il de ampliação (amostra) atinge um determinado d nível de fluorescência Threshold ts C t 13 1º Curso de Virologia Molecular em

14 14 1º Curso de Virologia Molecular em

15 Eficiência iê i PCR 15 1º Curso de Virologia Molecular em

16 Eficiência iê i PCR Quantificação Absoluta pode ser obtida através de uma curva padrão, construída através da amplificação de [DNA] conhecidas - valores de Ct em função da [DNA] Aplicando logaritmos, temos a seguinte equação: 0 Log ( N ) = Log ( E + 1)* C + Log ( N t ts t T ) Uma vez que E e N 0 são constantes, t esta equação tem a estrutura geral de uma recta: Y=mX+b 16 1º Curso de Virologia Molecular em

17 Eficiência iê i PCR Representando graficamente Log (N 0 ) em função do C t, temos uma equação com o declive: Declive = 1 1 l ( Declive log( E +1) E t =10 1 t 17 1º Curso de Virologia Molecular em

18 Eficiência iê i PCR 18 1º Curso de Virologia Molecular em

19 45,0 40,0 35,0 30,0 Eficiência iê i PCR EBV y = -3,256x + 40,661 R² = 0,998 Valor de Ct 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 EBV 19 1º Curso de Virologia Molecular em

20 Regressão Linear O objectivo da Regressão Linear consiste no ajuste do declive e da ordenada na origem de modo a encontrar uma linha que preveja o mais correctamente possivel os valores de Y (Ct) a partir de X (log[dna]): Minimiza a Soma dos Quadrados dos desvios verticais dos pontos à linha y = a + bx 20 1º Curso de Virologia Molecular em

21 Regressão Linear Assumimos que: O erro está associado aos valores de Ct medidos. Não há erro associado às concentrações A variação dos valores de Ct obedece a uma distribuição normal O erro nos valores de Ct é independente da concentração 21 1º Curso de Virologia Molecular em

22 Validação corrida Avaliar os seguintes elementos: NTC Controlo Interno de Extração (amostras) Representar graficamente valores de Ct das diluições seriadas do calibrador vs o logaritmo da concentração das diluições em série Parâmetros de Regressão Linear: Declive: eficiência de amplificação Ord. Origem: R 2 : 22 1º Curso de Virologia Molecular em

23 Eficiência iê i Amplificação Teoricamente, uma eficiência de 100% corresponde a um declive de -3,32 (FAM 1 cópia detectada ao ciclo ) Deve estar compreendida entre 90 e 105% Valores superiores a 100% revelam amplificações inespecificas 23 1º Curso de Virologia Molecular em

24 Declive: Parâmetros Regressão Linear Valores entre -3.1 e -3.6 Od Ordenada d Origem: Oi Variável de acordo com o ensaio Entre 36 e 40 R 2 : º Curso de Virologia Molecular em

25 Parâmetros Regressão Linear 25 1º Curso de Virologia Molecular em

26 Limite it Detecção/ Quantificação Limite Detecção: Quantidade mais baixa de um dado analito, numa amostra, que pode ser detectado mas não necessariamente quantificado Limite it Quantificação: É a menor concentração do analito que pode ser determinada com um nivel aceitavel de precisão e veracidade. 26 1º Curso de Virologia Molecular em

27 Limite it Detecção/ Quantificação Metodologia mais comum: LD: Regressão Logistica por software (MultiD) ou avaliação de amostras com baixa quantidade de DNA/ RNA LQ: Desvio Padrão da resposta σ LQ = 10x ( σ ) Slope σ= Residual Standard Deviation of the Regression (Excel) 27 1º Curso de Virologia Molecular em

28 Validação da corrida 28 1º Curso de Virologia Molecular em

29 Validação da corrida 29 1º Curso de Virologia Molecular em

30 Validação da corrida 30 1º Curso de Virologia Molecular em

31 Expressão de Resultados Não Detectado: Amostras sem cópias detectadas Controlo Interno detectado (Ct do CI Amostra Ct NTC ± 4) Inibido Amostras sem cópias detectadas Controlo Interno não detectado (Ct da Amostra Ct NTC ± 4) ) Detectado (> Limite Quantificação, nº de réplicas > 1): Amostras acelulares: Detectado (indicar o nº cópias/ml) Amostras celulares: Detectado (indicar o nº cópias/µg DNA) Detectado (> Limite Quantificação, nº de réplicas = 1): Detectado e colocar em observação: Por favor enviar nova amostra para confirmação da quantificação Detectado (< Limite Quantificação): Detectado com nº de cópias inferior ao Limite Quantificação 31 1º Curso de Virologia Molecular em

32 Quantificação Relativa Determina razão entre a quantidade de um dado DNA e uma amostra de referência Et Esta referência pode ser: Amostra ao tempo zero Amostra não tratada (vs amostra tratada) Linha celular normal Análise realizada por software 32 1º Curso de Virologia Molecular em