Marcadores Moleculares. Profa. Monalisa S. Carneiro

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1 Marcadores Moleculares Profa. Monalisa S. Carneiro

2 Genoma Como estudar Localização Física Marcadores Genéticos Seqüenciamento do DNA Estoques Cromossômicos Análise de Segregação Banco de seqüências Mapa Físico Mapa Genético Genoma Funcional Cromossomos específicos Mapeamento de QTL Expressão Gênica Sintenia (Mapeamento Comparativo entre Genomas)

3 Monge austríaco Gregor Mendel ( ) Jardim do monastério agostiniano de Santo Tomás de Brunn, atual república Checa, onde Mendel realizou seus experimentos

4 Exemplo: Caráter: cor da semente, Fenotipo: amarelo ou verde P Sementes X F 1 Todas F 2 Autofecundação Autofecundação 3/4 ;1/4 (3:1) F 3 3/4 e ; 1/4 Todas (= parental verde) (3:1, amarelas:verdes) Então: de F2 1/3 = parental amarelo 2/3 = F

5 Sementes lisa ou rugosa Sementes amarela ou verde Vagem verde ou amarela Pétalas púrpuras ou brancas Vagem inflada ou murcha Flores axiais ou terminais Caule longo ou curto Sete caracteristicas estudados por Mendel

6 Marcadores Genéticos Morfológicos Bioquímicos DNA (anôminos) DNA (seqüência) Fácil identificação Número limitado Marcador molecular Codom. Dom. RAPD CoDom. RFLP EST SNPs Número limitado AFLP SSR Princípios características dos marcadores genéticos: Padrão de Herança Mendeliana Neutro (ausência seleção, deriva)

7 Comparação entre os marcadores moleculares Característica RFLP RAPD SSR AFLP Nível de Polimorfismo médio médio alto médio Abundância alta m.alta média m.alta Dominância codom dom codom dom [DNA] 10 mg 25 ng 50 ng 500 ng Seqüência não não sim não Marcação sim/não não não sim/não Repetibilidade alta baixa alta média Investimento alto baixo alto médio Custo médio baixo alto médio

8 RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

9 RAPD Método para produzir cópias c de uma segmento de DNA específico Um sistema de clonagem in vitro Polimerização de DNA em Cadeia Polimerização é feita por uma DNA polimerase termoestável Utiliza-se de um primers - Isso delimita o segmento amplificado e determina o crescimento exponencial do número n de moléculas de DNA Primers: 10 nucleotidoes

10 RAPD 1- Desnaturação do DNA Aquecimento a 94 o C rompe as pontes de H tempo de desnaturação depende da complexidade do DNA usado como template (30sec a 5 min)

11 RAPD 2- annealing dos primers Resfriamento a poucos graus abaixo do melting point dos primers favorece o estabelecimento de pontes de H entre esses e os curtos trechos da molécula de DNA que lhe são complementares - Tempo para annealing : 30 sec a 1 min

12 RAPD 3- extensão das fitas 72 o C Tempo de extensão depende do comprimento do fragmento A DNA-polimerase sintetiza as novas fitas.

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14 Seleção dos primers 30ng de DNA Primer OPH 08 15ng de DNA M12306 M12306 Kits: OPA, OPAA, OPAB, OPAC, OPAD,OPAE, OPAF, OPB, OPC, OPD, OPE, OPH, OPI, OPJ, OPM, OPN, OPR e OPT.

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23 P1P2 Figura 6. Perfil do primer SSR PvBR35 em feijoeiro comum, detectado em gel de poliacrilamida 6% corado com prata. Estão representados os genitores CNFC 7812 (P1) e CNFC 8056 (P2), respectivamente, e 40 indivíduos da população F2.

24 Interpretação do gel para a construção das planilhas: MICROSSATÉLITES: P1 P2 1 RAPD: P1 P2 1 A B H C A C P1 P2 1 B D B

25 Aplicação dos marcadores moleculares em estudos de genética e melhoramento de plantas

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28 GEL A B C D E

29 Matriz de dados A B C D E

30 Marcadores Dominantes: variável dicotômica Exemplo Material A Material B B 1 0 A 1 0 (a) (c) (b) (d)

31 Indices de Similaridade Coincidência simples: a+d/a+b+c+d Jaccard: a/a+b+c Dice: 2a/ 2a+b+c

32 Construção do mapa Escolha dos Genitores/Cruzamento Obtenção da população segregante Genotipagem da população Hipótese de segregação Análise dos dados Análise de ligação Grupos de ligação Ordenação dos locos