Marcadores Moleculares

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO AF 060- Biotecnologia Vegetal Marcadores Moleculares Prof a. Renata FaierCalegario

2 INTRODUÇÃO Marcadores Características que permitem a distinção de indivíduos geneticamente diferentes Morfológicas, Bioquímicas ou Moleculares (BORÉM, 1997).

3 Aplicações: diversas áreas do conhecimento Melhoramento Genética mendeliana Genética de populações Marcadores Genéticos Genética molecular Organização do genoma Sequenciamento Transferência gênica

4 Fenótipo Características visíveis de um indivíduo Sofre influência: ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Genótipo Fatores ambientais Genótipo Constituição genética de um organismo => o conjunto de genes

5 ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Haplóide: Constituído por uma cópia de cada cromossomo Diplóide: Constituído por duas cópias de cada cromossomo Alelo: Genes que ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos Local ocupado pelo gene no cromossomo Haplóide Diplóide

6 ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Homozigotos: Célula diplóide com alelos idênticos de um gene em ambos os cromossomos homólogos Heterozigotos: Célula diplóide com alelos diferentes de um gene em ambos os cromossomos homólogos

7 DOMINÂNCIA Gene Recessivo (a) Só manifesta o fenótipo quando em homozigose (aa) Presente em dose dupla (dois alelos iguais) Gene Dominante (A) Manifesta o mesmo fenótipo em homozigose (AA) e heterozigose (Aa)

8 MARCADORES DOMINANTES A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 A1= alelo dominante Presença de bandas 2 alelos recessivos no mesmo loco: Ausência de banda só amplifica locus com alelos dominantes Mesmo padrão de bandas: Homozigose e Heterozigose => exclusão de um dos alelos na expressão gênica do heterozigoto

9 MARCADORES CO-DOMINANTES A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 Genes no mesmo locus Padrão de bandas diferentes: Homozigose e Heterozigose => Expressão de ambos os alelos no heterozigoto

10 TIPOS DE MARCADORES Marcadores Morfológicos Características fenotípicas do organismo Ex. Nanismo, deficiência de clorofila, cor de pétala Marcadores Bioquímicos Presença ou ausência de compostos Ex. isoenzimas e proteínas Marcadores Moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA Ex. alteração em bases nitrogenadas - Várias técnicas

11 CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE UM MARCADOR Reprodutibilidade Amplamente distribuído através do genoma Poder de discriminação Ausência de influências ambientais Barato Fácil de mensurar

12 MARCADORES MOLECULARES Marcadores genéticos que exploram a variabilidade do DNA Características polimórficas herdáveis que refletem diferenças na sequência de DNA ao nível de nucleotídeos Qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene expresso ou de um segmento específico de DNA Polimorfismo detectado na sequência de DNA => Variabilidade

13 APLICAÇÕES Diversidade genética de organismos Proteção de cultivares - demonstrar que a cultivar é diferente de qualquer outra variedade da mesma espécie Análise da pureza genética de semente Mapeamento de genes e características (associação do marcador com os genes de interesse) Seleção de genitores Retrocruzamento assistido...

14 MARCADORES MOLECULARES Vantagens Não sofre influência do ambiente Neutros em relação a efeitos fenotípicos N ilimitado de marcadores e de polimorfismo Identificação de genótipos em estágios iniciais da planta Acelera o processo de seleção e recombinação desejáveis Desvantagens Necessidade de técnicas e equipamentos mais complexos

15 TÉCNICAS E FERRAMENTAS DE BIOMOL Levou à descrição de várias classes de marcadores moleculares Enzimas de Restrição Eletroforese PCR DNA ligase DNA ligase CAS COLAR CAS COLAR

16 CLASSES DE MARCADORES MOLECULARES A partir => Varia de acordo com a técnica usada para identifica-lo RFLP Restrição e Hibridização de sequências DNA RAPD, Microssatélites PCR AFLP PCR + restrição...

17 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Polimorfirmo no tamanho do fragmentos de restrição Utiliza o DNA genômico digerido com enzima de restrição Examina diferenças no tamanho dos fragmentos de DNA Polimorfismo: é resultado de mutação pontual, inserção, deleção Requer conhecimento sequência

18 RFLP Planta, fungo, organismos... Hibridização Southern Blot

19 RFLP - METODOLOGIA 1. DNA tratado com enzimas de restrição = Gera fragmentos pequenos 2. Separação dos fragmentos: Eletroforese (gel agarose) 3. Transferência DNA para a membrana e Hibridização com sonda 4. Visualização dos fragmentos na membrana Southern blot sondas marcadas ( 32 P) ou Fluorescência 5. Análise dos resultados presença/ausência de bandas diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas A escolha de sonda/enzima de restrição = direcionada

20 ANÁLISE DOS RESULTADOS

21 RFLP: Identificação de Fitoplasma em Tomate + T + T + T + T + T + T pb Fragmentos que hibridizarem com a sonda + Grupo 16 SrIII 118 Fonte: Mello et al., 2007.

22 Brássica: diferentes padrões de bandas em F2 = diferença genética => representam um loco RFLP = pode ser usado como marcador genético Eletroforese do DNA cortado com enzima de restrição Homozigotos p/ os alelos A1: 3, 5, 6, 7, 8, 9 Homozigotos p/ os alelos A2: 1, 2,4 Gel revelado com EtBr => UV Visualização de arraste contínuo de fragmentos de DNA

23 RFLP Vantagens Reprodutibilidade Marcadores co-dominantes Simples Desvantagens Trabalhoso Caro Uso de sondas radioativas

24 RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA Fragmentos de DNA amplificados por PCR Método mais rápido para detecção de polimorfismos DNA genômico amplificado por PCR Uso de um único primer aleatório (8-10 bases): função de R e F Não requer conhecimento da sequência Marcador dominante

25 RAPD - METODOLOGIA 1. DNA é amplificado via PCR com primer aleatório => Gera fragmentos pequenos 2. Separação dos fragmentos por eletroforese 5. Análise dos resultados presença/ausência de bandas diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas

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27 RAPD - METODOLOGIA A B A B

28 PRIMERS ALEATÓRIOS DNA Primer se anela em vários pontos do DNA (desconhecidos) Quando se anela em direções opostas = Amplificação Anelamento em pequenas distâncias Vários Fragmentos

29 RAPD - Feijoeiro Resistentes à raça pb 1000 pb 550 pb marcador ligado à Co-1 Co-1 = gene que confere resistência à raça 65 de C. lindemuthianum Fonte: Moura, 2005

30 RAPD Vantagens Rápido e simples - não envolve hibridização Baixo custo Sem uso de radioisótopos Não precisa conhecimento prévio da sequência de DNA Desvantagens Marcador dominante Problemas de reprodutibilidade: produtos amplificados não são conhecidos Problemas de interpretação: co-migração - mesma banda: mesmo fragmento? Pode ser outro! - uma banda: um fragmento? Pode ser dois! Fonte: IPGRI

31 MICROSSATÉLITES Pequenas sequências com 1 a 4 nucleotídeos, repetidas em tandem (em sequência) presentes no genoma eucarioto Mononucleotídeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC Dinucleotídeos TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC Trinucleotídeos TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC Tetranucleotídeos TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC Amplificadas por PCR Marcador Co-dominante Classe de marcador com maior grau de polimorfismo Requer conhecimento prévio da sequência

32 MICROSSATÉLITES Sinonímias SSR (Simple Sequence Repeats); STMS (Sequence Tagged Microsatellites); SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms); Onde são encontrados??? Mamíferos: (CA)n ( a vezes no genoma) Plantas: (AT)n Mitocôndrias Cloroplastos

33 MICROSSATÉLITES: METODOLOGIA 1. Digestão DNA Enzimas de Restrição 2. Seleção dos Fragmentos (tamanho) e clonagem em vetor 3. Transformação da bactéria e seleção das colônias por hibridização (sondas marcadas com sequências repetidas) 4. Sequenciamento dos clones 5. Desenho dos primers

34 MICROSSATÉLITES Marcador Co-dominante M homozigoto heterozigoto Gel de poliacrilamida => Perceber diferenças de nucleotídeos

35 DETECÇÃO DE LOCUS SSR Simple Sequence Repeats = Microssatélites Homozigoto Heterozigoto Homozigoto CACACA GTGTGT CACACA GTGTGT (CA) 3 (CA) 3 Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3

36 MICROSSATÉLITES cada ilha microssatélite constitui um locus, multialélico Cada fragmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo locus

37 MICROSSATÉLITES Marcador multialélico Alelos diferentes da mesma repetição (mesmo locus) Marcador Molecular com maior conteúdo de informação de polimorfismo

38 MICROSSATÉLITES Vantagens Reprodutibilidade Requer pequena quantidade de DNA Baixo custo Grande poder de resolução Alto nível polimorfismo útil para germoplasmas aparentados e de baixa variabilidade Desvantagens Necessidade de serem desenvolvidos para cada espécie (primers aleatórios) Trabalhoso Porém: uma vez desenvolvido é fácil Caro

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40 Atributos Isoenzimas Proteínas de sementes RFLPs RAPDs Microssatélites AFLPs Nível de baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto Polimorfismo Estabilidade moderada alta alta alta alta alta ambiental Número de locos moderado (<50) baixo (<10) alto alto alto alto Expressão genética co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante Número de alelos por 2-5 multialélico multialélico 2 multialélico 2 loco Distribuição no regiões de cópia regiões de cópia várias ao acaso ao acaso ao acaso genoma única única Acessibilidade muito alta muito alta média muito alta muito baixa média tecnológica Aplicabilidade no melhoramento rápido, baixo custo rápido, baixo custo lento, custo médio rápido, baixo custo lento, custo alto rápido, custo baixo Identificação de baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta genótipos Avaliação de média baixa alta alta alta muito alta germoplasma Mapeamento baixa muito baixa alta alta muito alta alta genético Mapeamento de baixa inadequado média muito alta média muito alta regiões específicas Mapeamento baixa inadequado muito alta baixa alta baixa comparativo Genética de baixa baixa média alta muito alta muito alta Autógamas Genética de média baixa média alta muito alta muito alta Alógamas Análise Filogenética média baixa muito alta média alta média Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995).

41 Técnicas sorológicas: ELISA e Western Blot

42 TÉCNICAS DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO Metodologia: baseada em propriedades Ácido nucleicos Métodos Moleculares Proteicas Métodos Sorológicos

43 MÉTODOS SOROLÓGICOS Detecta => proteína Baseado na reação antígeno-anticorpo de animais de sangue quente Antígeno: substâncias estranhas ao organismo Anticorpos: são proteínas produzidas pelos glóbulos brancos (linfócitos B) Vírus: atua como antígeno quando inoculado num animal Substância formada em reação ao vírus funciona como anticorpo

44 Portanto: Como se produz anticorpo? O antígeno é a proteína viral (Capa Proteica) Anticorpo reconhece esta proteína viral Separação dos glóbulos brancos - soro Conservado a -4ºC

45 Sítio de reconhecimento da proteína viral Sítio de reconhecimento da proteína viral Região variável Região constante Anticorpo IgG

46 MÉTODOS SOROLÓGICOS 1. ELISA 2. Western Blot Aplicações: Ferramentas para diagnósticos de doenças Indexação de material vegetal propagativo P. ex. plantas livres de vírus

47 ELISA: Enzime linked imunosorbent assay Indireto Vírus adsorvido Anticorpo 1 imobilizado pelo vírus Y O anticorpo 2 ligado a enzima reconhece Ac 1 O substrato é adicionado Reação Colorimétrica Adaptado de Zerb ini, 2002

48 ELISA: Enzime linked imunosorbent assay Resultado Leitor de Elisa: Mede absorbância (405nm) Absorbância Concentração viral Cor Amarela + -

49 ELISA: Enzime linked imunosorbent assay Vantagens Desvantagens Sensível (1 ng/ml) Rápido Baixo custo Seguro Teste de várias amostras Quantitativo Muito útil para testes de rotina Não mede infectividade e reação inespecífica

50 Western blot

51 Western blot - Enzima: fosfatase alcalina - Quimioluminescente: CSPD ou CDP-star - Colorimétrico: NBT/BCIP

52 Calegario et al., 2013 Western blot

53 Calegario et al., 2013 Tissue blot

54 Western blot e Tissue blot Vantagens: - Membranas podem ser transportadas - Pode ser iniciada em campo pelo agricultor - Custo moderado - Várias amostras podem ser analisadas concomitantemente Desvantagens: - Não mede a infectividade do vírus - Apresenta alguns falsos positivos

55 BIBLIOGRAFIA 1. Aluízio Borém e Eveline Teixeira Caixeta - Marcadores Moleculares Viçosa, MG, Fábio Gelape Faleiro - Marcadores Genético-Moleculares aplicados a programas de conservação e uso de recursos genéticos. EMBRAPA Cerrados, Planaltina, DF,