BacBio. Crescimento, Renovação Celular e Reprodução: da teoria à prática. Coimbra, 2012/2013. Sandra Gamboa Andreia Quaresma Fernando Delgado

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1 BacBio Crescimento, Renovação Celular e Reprodução: da teoria à prática Coimbra, 2012/2013 Sandra Gamboa Andreia Quaresma Fernando Delgado Escolher Ciência PEC282 ESCOLA SUPERIOR AGRÁRIA DE COIMBRA

2 BacBio Introdução Nesta actividade laboratorial realizar-se-á uma transformação genética, isto é, uma mudança causada por genes, envolvendo a inserção de um gene num organismo de forma a modificar uma característica desse organismo. A transformação genética é usada em inúmeras áreas da biotecnologia: na agricultura, os genes que codificam características como, resistência à geada, peste ou deterioração podem ser geneticamente transformados nas plantas; na bioremediação as bactérias podem ser transformadas com genes que permitem a digestão de derrames de petróleo; na medicina, doenças causadas por mutações genéticas estão a começar a ser tratadas através da terapia génica, transformando geneticamente as células de uma pessoa doente com cópias saudáveis desse gene. Nesta actividade, será usado um gene que codifica a proteína de fluorescência verde (GFP Green Fluorescent Protein) para transformar bactérias E. coli. Este gene é proveniente da medusa bioluminescente Aequorea victoria que confere fluorescência verde a este organismo. O gene para a GFP será inserido no genoma bacteriano e a bactéria irá expressar o seu mais recente gene e produzir a proteína fluorescente que originará bactérias brilhantes, de cor verde, quando colocadas sob a luz ultravioleta. Para a inserção do gene em questão no genoma da bactéria vamos utilizar um plasmídeo. Um plasmídeo é um segmento circular de DNA, mais pequeno que o cromossoma bacteriano, que se encontra nas bactérias. Um plasmídeo contém genes para uma ou mais características que podem beneficiar a sobrevivência das bactérias. Como exemplo temos os genes que conferem resistência aos antibióticos. As bactérias podem transferir os plasmídeos entre si de forma a partilhar esses genes. Este mecanismo permite-lhes adaptarem-se a novos ambientes, sendo que a existência de bactérias resistentes a antibióticos é um exemplo de transmissão de plasmídeos. Esta actividade permite, assim, estudar o processo de movimento de genes de um organismo para outro através de um plasmídeo. A empresa Bio-Rad construiu o plasmídeo pglo que codifica o gene para a GFP e outro para a resistência ao antibiótico ampicilina. O plasmídeo incorpora, ainda, um sistema de regulação de genes que pode ser usado para controlar a expressão da proteína de fluorescência nas células transformadas. Este sistema de regulação funciona como um interruptor que é acionado pelo açúcar arabinose. Sendo assim, o gene GFP pode ser ligado adicionando ao meio de nutrição das bactérias o açúcar arabionose. A selecção das células transformadas pelo pglo é concluída com o seu crescimento nas placas que contêm o antibiótico. As células transformadas aparecerão brancas nas placas que não contêm arabinose e fluorescentes nas que incluem este açúcar.

3 BacBio Protocolo 1ª Aula: Preparação das placas de Petri iniciais 1. Inserir uma ansa de inoculação estéril na cultura bacteriana rehidratada. Com a ansa plaquear as placas de Petri (1/grupo). O plaqueamento é feito em quatro quadrantes (ver figura abaixo) Ao finalizar, tapar rapidamente a placa para evitar contaminações. 2. Colocar as placas, com a tampa para baixo, a incubar durante a noite, a 37ºC durante 2-3 dias. 2ª Aula: Transformação 1- Etiquetar um eppendorff com +pglo e outro com pglo e também com o nome/número do grupo;

4 BacBio 2- Com uma micropipeta transferir 250 µl da solução de transformação (CaCl 2 ) para cada tubo; Solução de transformação 3- Colocar os tubos em gelo; Gelo 4- Com uma ansa de inoculação, pegar numa única colónia de bactérias provenientes da placa inicial e colocá-la no tubo +pglo; agitar até que toda a colónia fique dispersa na solução de transformação. Colocar, novamente, o tubo no gelo e repetir o processo para o tubo pglo.

5 BacBio 5- Mergulhar uma ansa de inoculação esterilizada no tubo com o plasmídeo pglo. Misturar o plasmídeo da ansa na suspensão de células do tubo +pglo. Fechar o tubo e voltar a colocá-lo no gelo. (Não adicionar o plasmídeo no tubo pglo) Plasmideo pglo 6- Incubar os tubos no gelo durante 10 minutos. Gelo 7- Enquanto os tubos estão no gelo, marca as placas de Petri com agar (marcar as placas por baixo) da seguinte forma: a. Placa 1: (+pglo) LB/amp b. Placa 2: (+pglo) LB/amp/ara c. Placa 3: (-pglo) LB/amp d. Placa 4: (-pglo) LB

6 BacBio 8- Choque térmico. Usando um suporte de espuma, transferir os tubos +pglo e pglo para um banho-maria a 42ºC, durante 50 segundos exactos. Passados os 50 segundos volta a colocar os tubos no gelo. Incubar os tubos no gelo durante 2 minutos. (Para que os resultados da transformação sejam bons a transferência do gelo para os 42ºC e novamente para o gelo deve ser rápida.) Banho-Maria Gelo 42ºC, 50 segundos Gelo 9- Remover o suporte com os tubos do gelo e coloca-los na bancada. Usando uma pipeta esterilizada, adiciona 250 µl do caldo de nutrientes LB. Repetir o mesmo para o outro tubo com uma nova pipeta. Incubar os tubos durante 10 minutos à temperatura ambiente. Nutrientes LB

7 BacBio 10- Dar pancadinhas no tubo com os dedos para misturar a solução. Usando uma pipeta esterilizada, colocar 100 µl das suspensões de transformação e controlo nas placas apropriadas. Placas transformadas Placas controlo 11- Espalhar as suspensões pela superfície do meio, usando uma ansa de inoculação esterilizada para cada placa. (não fazer muito pressão para não furar o meio) 12- Colocar as placas numa estufa a 37ºC.

8 BacBio 3ª Aula: Recolha e análise de dados Observar os resultados obtidos da transformação laboratorial sob luz normal. A seguir, desligar as luzes e segurar uma luz ultravioleta por baixo das placas. +pglo LB/amp 1. Observar e desenhar o que se vê em cada placa. Colocar os desenhos na coluna da direita da tabela de dados. Registar os dados para permitir a comparação entre as observações feitas às células +pglo e às células não transformadas (- pglo). 2. Qual o crescimento bacteriano observado em cada placa? 3. Qual a cor das bactérias? 4. Quantas colónias bacterianas existem em cada placa. Observações +pglo LB/amp/ara -pglo LB/amp Observações -pglo LB Bibliografia Biotechnology Explorer, pglo Bacterial Transformation Kit, Catalog Number EDU, Bio-Rad laboratories Inc., explorer.bio-rad.com