Engenharia Genética; Transgênicos e OGM s

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1 Dogma Central da Biologia Molecular Engenharia Genética; Transgênicos e OGM s Prof. Msc. Lucas Silva de Faria Engenharia Genética Conjunto de tecnologias que permitem a manipulação (modificação) do material genético in vitro. Conhecida como Tecnologia do DNA recombinante; Aplicações da Engenharia Genética Análise estrutural e funcional de genes Produção de proteínas de interesse industrial e terapêutico Engenharia proteica Criação de Organismos Transgênicos Terapia Gênica Diagnóstico molecular de doenças Teste de paternidade Arqueologia molecular 1

2 OGM X Transgênico OGM Organismo Geneticamente Modificado Sofreu mudança artificial no seu genoma mediante engenharia genética. A mudança pode ser apenas estrutural ou na função do próprio material genético do próprio indivíduo. Transgênico: É um OGM que recebeu parte de material genético de outro indivíduo. Genoma modificado com genes de outra espécie de ser vivo. Etapas de uma transformação genética 1) Identificação do gene de interesse 2) Isolamento do gene de interesse (enzimas de restrição) 3) Clonagem do gene de interesse (vetores) 4) Transformação genética (inserção dos genes) 5) Comprovação da modificação genética (análises genéticas) Métodos para obtenção de Transgênicos Transformação de Plantas Métodos de Transformação: Agrobacterium Biobalística Eletroporação Microinjeção 2

3 Etapas da Transformação Isolamento e Clonagem do gene de interesse Enzimas de restrição Vetor (Bactéria ou vírus) Métodos de Transformação Agrobacterium spp. DNA recombinante inserção do gene de interesse em outra espécie Transgenia Galha da Coroa Junção entre tronco e raíz ou nas raízes 3

4 Agrobacterium spp. Plasmídeo Ti T-DNA genes que produzem opinas e hormônios Opinas aminoácidos usados como fonte de nitrogênio e carbono Hormônios indução de tumores vegetais Material genético que é transferido para as células vegetais Vir. Síntese de enzimas da transferência e integração do T-DNA. Transformação indireta - Agrobacterium Transformação indireta - Agrobacterium Para usar a Agrobacterium em processos biotecnológicos: Deleção de genes oncogênicos (causadores de tumores) do T-DNA Produção de bactéria desarmada virulenta mas não patogênica Sem a região do T-DNA Manutenção dos genes relacionados à transferência e à replicação do plasmídeo Vetores binários transferir o T-DNA recombinante do vetor para o plasmídeo Ti da Agrobacterium. Limitações: Hospedeiro poucas monocotiledôneas Capacidade de regeneração do tecido transformado Tamanho do plasmídeo Sanidade do explante Condições de cultura Cepa e genótipo da bactéria utilizada 4

5 Transformação indireta - Agrobacterium Transformação direta Métodos físicos ou químicos diretos Biolística (Biobalística) Eletroporação Biobalística (Biolística) Bombardeamento com micropartículas de ouro ou tungstênio com DNA exógeno Penetração da parede celular e membrana plasmática Condição de vácuo Biobalística (Biolística) 5

6 Biobalística (Biolística) Eletroporação DNA é inserido na célula e é dissociado pelo líquido celular Onda de choque para acelerar as partículas Explosão química, descarga de hélio ou vaporização de água Bombardeio de embriões, cotilédones, discos foliares, calos ou suspensões celulares Pulsos elétricos curtos de alta voltagem que alteram a estrutura da membrana plasmática poros Permeabilização da membrana Protoplastos Formação de poros pode ser irreversível Rápido Transformantes estáveis 1 a 5% Explante criteriosamente examinado gene repórter Eletroporação Eletroporação Pulsos elétricos e intensidade deve inviabilizar 50% dos protoplastos condição máxima de absorção do DNA exógeno Dificuldades: Obtenção do protoplasto Regeneração do material transformado Tampão de transferência Sobrevivência do protoplasto 6

7 Microinjeção Introdução de macromoléculas específica dentro de uma célula Micro manipulador acoplado a um microscópio Injeção através de uma micropipeta de vidro Alta frequência de transformação Transformação de células animais Análises Finais e Aclimatação Comprovação da obtenção de linhagens modificadas Transgênicos Transformação genética de animais Estudo de doenças Desenvolvimento de órgãos para transplante (xenotransplantes) Produção de proteínas e hormônios de interesse (Animais Biorreatores) Animais ornamentais Melhoria da qualidade nutricional Alterações fisiológicas diversas 7

8 Transformação genética de animais 1) Microinjeção pronuclear de genes em óvulos fertilizados 2) Injeção de células embrionárias modificadas em blastoceles Espermatotransgênese Transferência gênica em massa espermatozoides Aplicações da transformação genética Animais Biorreatores Primeiro animal transgênico Camundongo com gene promotor de crescimento de ratos 2001 macaco Rhesus com gene fluorescente de medusa Muitas vezes a produção de proteínas não é possível em bactérias devido a necessidade de modificações póstraducionais. Ex: glicosilação (hormônios gonadotróficos, anticorpos, fatores de coagulação) Vacas leite Peixes ovas Aves ovos Urina, soro, sangue, plasma seminal, fluidos de insetos Ex: Proteína C; Fatores de coagulação (FVII, FVIII, FIX), hemoglobina, transferrina, antitrombina, albumina, hormônio de crescimento humano 8

9 Animais Biorreatores Produção de insulina - O gene da insulina humana é isolado utilizando-se enzimas de restrição para cortar o DNA humano; - O gene humano é inserido em um plasmídeo bacteriano que também foi submetido a enzima de restrição; - Ativa-se o plasmídeo, para a transcrição do gene e produção da proteína (insulina); - Retira-se a insulina da bactéria. Aplicações Aplicações 9

10 Aplicações Aplicações Aplicações 10