Superexpressão de genes-candidatos em sistemas-modelo

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1 Superexpressão de genes-candidatos em sistemas-modelo Ana Cristina Miranda Brasileiro Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia CURSO - PESQUISA BIOLÓGICA NA ERA PÓS-GENÔMICA: INTEGRAÇÃO E VALIDAÇÃO DE DADOS ÔMICOS - Brasília, 02 de maio de

2 Validação de genes-candidatos na era pós-genômica Perfil global da expressão - transcritoma (banco de dados) (Perfil da expressão de todos os transcritos em uma determinada condição) Bibliotecas de cdna + sequenciamento [SSH, Super-SAGE, NGS (454 e HiSeq), etc.] Milhares de genes-candidatos Estudo da expressão gênica (Perfil de expressão de um grupo de transcritos em uma determinada condição) Arranjos de DNA (macro e micro) Centenas de genes-candidatos Validação da expressão gênica (Perfil de expressão de alguns transcritos em uma determinada condição) (northern, semi-quantitativo, RT-qPCR, etc.) Dezenas de genes-candidatos Validação e estudo da função gênica (Expressão dos candidatos em sistemas heterólogos) Silenciamento ou superexpressão do transgene em plantas-modelo Um a dois genes-candidatos Prova de conceito (Expressão dos candidatos em sistemas homólogos) Silenciamento ou superexpressão do transgene na planta-alvo

3 Genes diferencialmente expressos Tratamento Controle mrna (genes expressos) Detecção dos homólogos (in vitro ou in silico) Subtração (in vitro ou in silico)

4 In silico analysis of HiSeq libraries Guimarães et al. PlosOne, 2015

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6 In silico analysis of HiSeq libraries Guimarães et al. PlosOne, 2015

7 In silico analysis of HiSeq libraries Cluster analysis using only the reads that were differentially expressed in one of the three points (P< and log2 (fold change) >2.0 or < -2.0) Guimarães et al. PlosOne, 2015

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9 Genes candidatos prospectados a partir de análises ômicas 1. Seleção dos genes-candidatos Brasileiro et al. Plant Mol Biol Rep, 2015

10 Genes candidatos prospectados a partir de análises ômicas 2. Validação da expressão por RT-qPCR Morgante et al. Functional Plant Biology 2013

11 Genes candidatos prospectados a partir de análises ômicas 2. Validação da expressão por RT-qPCR (in silico vs RT-qPCR) Guimarães et al. PlosOne, 2015

12 Genes candidatos prospectados a partir de análises ômicas 3. Revisão de literatura

13 Genes candidatos prospectados a partir de análises ômicas 4. Conflitos patentários

14 Validação de genes-candidatos na era pós-genômica Perfil global da expressão - transcritoma (banco de dados) (Perfil da expressão de todos os transcritos em uma determinada condição) Bibliotecas de cdna + sequenciamento [SSH, Super-SAGE, NGS (454 e HiSeq), etc.] Milhares de genes-candidatos Estudo da expressão gênica (Perfil de expressão de um grupo de transcritos em uma determinada condição) Arranjos de DNA (macro e micro) Centenas de genes-candidatos Validação da expressão gênica (Perfil de expressão de alguns transcritos em uma determinada condição) (northern, semi-quantitativo, RT-qPCR, etc.) Dezenas de genes-candidatos Validação e estudo da função gênica (Expressão dos candidatos em sistemas heterólogos) Silenciamento ou superexpressão do transgene em plantas-modelo Um a dois genes-candidatos Prova de conceito (Expressão dos candidatos em sistemas homólogos) Silenciamento ou superexpressão do transgene na planta-alvo

15 Cloning selected candidate genes in a binary vector Candidate gene (ACT promoter) Agrobacterium rhizogenes linhagem K599 (selvagem) Gene repórter egfp (35SCaMV promoter) Agente de seleção Resistência a higromicina (UBI promoter) Agrobacterium tumefaciens linhagem GV3101 (desarmada) Chu et al. 2014

16 Sistemas-modelo para estudos genes-candidatos Método simples, rápido, reprodutível e eficiente! Modelos (dicots): Tabaco; Álamo; Micro- Tom; Medicago; N. benthamiana; etc. (estável) Arabidopsis (estável) Modelos: Arroz; Setaria; etc. (estável) VIGS (transiente) Bombardeamento de tecidos (transiente) Raízes em cabeleira in vitro ou plantas compostas (transiente)

17 Validação de genes-candidatos na era pós-genômica Perfil global da expressão - transcritoma (banco de dados) (Perfil da expressão de todos os transcritos em uma determinada condição) Bibliotecas de cdna + sequenciamento [SSH, Super-SAGE, NGS (454 e HiSeq), etc.] Milhares de genes-candidatos Estudo da expressão gênica (Perfil de expressão de um grupo de transcritos em uma determinada condição) Arranjos de DNA (macro e micro) Centenas de genes-candidatos Validação da expressão gênica (Perfil de expressão de alguns transcritos em uma determinada condição) (northern, semi-quantitativo, RT-qPCR, etc.) Dezenas de genes-candidatos Validação e estudo da função gênica (Expressão dos candidatos em sistemas heterólogos) Silenciamento ou superexpressão do transgene em plantas-modelo Um a dois genes-candidatos Prova de conceito (Expressão dos candidatos em sistemas homólogos) Silenciamento ou superexpressão do transgene na planta-alvo

18 Etapas da Transformação de Plantas Identificação do Gene Produção de Plantas Transgênicas Análise, Negociações e Monitoramento Análises Moleculares Engenharia Genética Transferência para Célula Análise da progênie Testes em biossegurança Negociações Produção e Comercialização Seleção Regeneração Monitoramento Contínuo B r a s i l e i r o e C a r n e i r o ( ) M a n u a l d e T r a n s f o r m a ç ã o G e n é t i c a d e P l a n t a s

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20 A maioria das plantas transgênicas produzidas até o momento possuem, em geral, promotores constitutivos, como o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor, o promotor da síntese de opinas (nopalina e octopina) de Agrobacterium tumefaciens e o promotor da poliubiquitina ou actina de plantas.

21 A expressão constitutiva do gene, além de levar a uma perda energética para a planta, também está associada a possíveis efeitos deletérios da proteína no vegetal ou, no caso de proteínas tóxicas para pragas, a impactos em organismos não-alvo.

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23 - Existe um consenso na comunidade científica que as novas gerações de plantas transgênicas devam conter promotores tecido-específicos, ou induzíveis sob condições específicas, com objetivo de minimizar os efeitos causados pela expressão conspícua em todos os tecidos da planta.. Expressão em resposta a um estímulo Expressão espacial Expressão temporal

24 - 28 autores - 21 capítulos páginas exemplares - ebook

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29 Muito Obrigada!

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