Hospedeiros e vetores de clonagem

Transcrição

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO PÓLO AVANÇADO DE XERÉM GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA CURSO MELH. GEN. E OGMs (XBT353) TURMA 2015/2 Hospedeiros e vetores de clonagem Prof. Dr. Silas Pessini Rodrigues Rio de Janeiro, 17 de novembro de 2015

2 Vetores: molécula carreadora que propaga a sequência de interesse Célula hospedeira: recebe e multiplica o vetor contendo a sequência de interesse.

3 Tipos de hospedeiros utilizados na clonagem de genes (Chlamydomonas) (CHO, células do hovário de hamsters chineses)

4 Um vetor deve conter: 1) Uma origem de replicação O DNA é copiado à se mantém e se multiplica junto com a célula hospedeira 2) Um marcador selecionável Permite que o vetor seja detectado 3) Sítio de restrição para endonuclease (ao menos um) Permite que DNA seja inserido no vetor

5 Tipos de vetores: 1) Plasmídeos 2) Fagos 3) Cosmídeos 4) Fagemídeos 5) Cromossomos artificiais de leveduras 6) Vírus

6 Características dos Plasmídeos ü Encontrados em bactérias e algumas leveduras ü São pequenas e circulares ü Normalmente não se inserem no genoma hospedeiro ü Geralmente não codificam genes fundamentais à mas conferem resistência a antibióticos

7 Exemplos de plasmídeos de ocorrência natural Siglas para an=bió=cos Controlam a própria transferência para a bactéria à dependem das regiões plasmidiais trans e mod Os menores são estringentes à geralmente se replicam com o genoma celular Os maiores são relaxados à não têm este controle

8 Estrutura geral de um plasmídeo: exemplo do pbr32 pati53 à variação do pbr32 à em que a área em cinza foi removida à conferiu: ~3x mais cópias por célula Sai menos da célula

9 Plasmídeos mais sofisticados: exemplo da família puc Plasmídeos mais complexos podem conter: Síteos de restrição múl=plos (ou mul$ple cloning sites, MCS) Promotores de genes Genes para seleção direta (Ex.: LacZ à b- galactosidase)

10 Plasmídeos comerciais disponíveis

11 Principal desvantagem dos plasmídeos à aceitam insertos de DNA de até 5 kb à mais que isso afetam a eficiência e estabilidade da clonagem à limitação para a o uso na contrução de bibliotecas de DNA à alternativa são vetores baseados no bacteriófago.

12 Lambda e M13 são exemplos de vetores para uso em E. coli (Lambda) Importante na absorção e extrusão do vetor

13 Componentes do genoma do fago lambda Apresentam extremidades coesivas em ambas as extremidades à permite circularização quando dentro da célula A área em que duas extremidades se juntam = síteo cos

14 Os fagos podem ser virulentos ou temperados Fagos virulentos à causam a lise da célula Fagos temperados à podem ou não causar a lise celular P: pró- fago

15 Experimento da placa, utilizado para se estimar a quantidade de fagos liberada Cada ponto cinza = um fago Conta- se os pontos x fator de diluição / volume u=lizado = concentração de fagos

16 Os vetores baseados em fagos lambda podem ser de insersão ou substituição Insersão à DNA de interesse é inserido diretamente no sí=o de restrição Subs=tuição à parte do DNA é removida, dando lugar ao DNA de interesse

17 Exemplos de dois vetores bacteriófagos lambda baseados em insersão Acomoda até 7,6 kb Acomoda até 9,0 kb O rompimento dos genes cl (repressor de lambda) e lacz à usado na etapa de seleção

18 Exemplos de dois vetores bacteriófagos lambda baseados em substituição Acomoda de 9-22 kb Tem que ser >38<51kb Acomoda de 9-22 kb

19 Vetores baseados no bateriófago M13 Caracterís=cas importantes: 1. Similares aos plasmídeos à são manipulados e isolados com as mesmas técnicas 2. Produzem DNA em fita simples (single- strand DNA, ssdna) Replicação de DNA MCS: mul=ple cloning sites à que recebem o inserto Desvantagens: reduzem o crescimento celular Não insuzem a lise celular à tem que extrair os ácidos nucléicos Não funcionam bem com DNAs lingos (>1.5 kb) capsídeo Morfogênese

20 Alguns vetores são híbridos de fago + plasmídeos Cosmídeos à vetores com sequências plasmidiais, ligadas aos sítios cos de fago lambda O síteo cos permite que o plasmídeo seja empacotado in vitro, como um fago são pequenos (4-6 kb) e podem acomodar até 47 kb se comportam como plasmídeos à depois de inseridos na célula como um fago aumentam a capacidade de clonagem em pelo menos 2x mas são difíceis de usar requerem processamento adicional dos fragmentos após clonagem Fagemídeos à a mesma idéia do cosmídeo, mas alguma característica de fago é também expressa Ex.: família λzap à capaz de excisar sozinho o DNA como parte de um plasmídeo à que pode ser usado depois em um plasmídeo

21 Vetores para células de animais e plantas

22 O plasmídeo Ti de Agrobactéria é utilizado na transformação de plantas nopalina

23 Cromossomos artificial de leveduras (YACs) à aceitam fragmentos na escala de megabases à possuem regiões centroméricas e teloméricas à são mantidos como um cromossomo da levedura à apresentam instabilidade Cromossomos artificiais de bactérias (BACs) à foram desenvolvidos à partir de plasmídeos F, que são muito maiores que os demais plasmídeos à aceitam insertos de ~300 kb à são muito mais estáveis que os YACs

24 Mapa de um vetor tipo YAC Componentes: Origem de replicação (ori) Gene de resistência à ampicilina (Ap r ) Gene de replicação de DNA (ARS1) Regiões de estrutura cromossômica (TEL e CEN4)

25 Como o vetor contendo o inserto de DNA é inserido na célula do hospedeiro? Os sistemas bacterianos são os mais simples, envolvem: Transformação à internalização de um plasmídeo por uma célula bacteriana ( ou de qualquer outra molécula de DNA por uma célula) Transfecção à internalização de DNA de fago por uma célula bacteriana

26 Transformação de bactérias com plasmídeos

27 Os vetores de fagos lambda são encapsulados in vitro, com o genoma contendo o inserto de DNA selvagem recombinante

28 Outras estratégias de transformação genética ü microinjeção ü biolística ü uso de agrobactéria

29 Microinjeção em protoplasto de batata Faz uma leve sucção que segura a célula Microagulha que injeta DNA

30 Biolística

31 Mecanismo de transformação de células vegetais por agrobactéria 1) A bactéria percebe um fenol liberados pela planta 2) O produto de genes Vir atuam tanto percebendo o fenol, como atuando na transferência do T- DNA 3) VIP- 1 é fosforilada e a=va a expressão de genes de defesa, que são reprimidos por VirF 4) VirF também remove proteínas associadas ao T- DNA, permi=ndo a sua inserão no genoma.

32 Tumor vegetal induzido por agrobactéria

33 Sequência de usa de agrobactéria para transformação de plantas

34 Resumo vetores e hospedeiros