Mutação aleatória. DNA shuffling Apresentação em Fagos (Phage Display) Exemplos de Aplicação. Error prone

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1 Objetivos FFI0776 Modelagem e Engenharia de Proteínas Prof. Rafael V. C. Guido rvcguido@ifsc.usp.br Aula 09 Mutação aleatória Error prone PCR Apresentação em Fagos (Phage Display) Exemplos de Aplicação Bacharelado em Ciências Físicas e Biomoleculares Instituto de Física de São Carlos USP Mutação aleatória Error prone PCR Reação em Cadeia da Polimerase PCR

2 Reação em Cadeia da Polimerase PCR Error prone PCR Condições alteradas da PCR para aumentar a taxa de erros durante a cópia do gene Taq polimerase apresenta uma taxa de erro de 1 nucleotídeo não complementar para cada bases Aumentando se a concentração de Mn +2 ou Mg +2 a taxa de erro da Taq polimerase aumenta para 2 15 erros para cada pares bases ( 1 3 ordens de magnitude) DNA polimerase Error prone PCR

3 Error prone PCR Mutações aleatórias produzidas por error prone PCR são tendenciadas a incluir alterações onde a probabilidade de incorporação é maior para aminoácidos codificados por vários códons (e.g., g leucina, arginina e serina) Recombinação gênica O método de (Embaralhamento de DNA) é empregado para recombinar sequências homólogas de DNA randomicamente fragmentadas, durante a evolução molecular in vitro; O procedimento original é constituído por diferentes etapas, incluindo a obtenção de substrato (genes parentais a serem recombinados), digestão enzimática dos genes parentais, recombinação e recuperação de novas sequências, através de ciclos de anelamento na presença da enzima DNA polimerase; A metodologia apresenta se promissora com perspectivas p de aplicação nos processos biotecnológicos

4 A tecnologia do é uma ferramenta atrativa para a construção de bibliotecas combinatórias de genes mutantes; Geração de grande variedade de novos genes e permite a seleção das proteínas com características desejadas, segundo critérios previamente estabelecidos; O processo de DNA Shuffling é dividido em quatro etapas: 1. Obtenção do substrato 2. Fragmentação do(s) gene(s) 3. Recombinação gênica 4. Amplificação dos genes recombinados Aplicação enzimas são as mais suscep veis, minimizando os problemas de incompatibilidade entre os processos industriais i i e a atividade id d enzimática em condições drásticas de valores de ph, altas temperaturas e força iônica 1. Obtenção do substrato O substrato da reação consiste de gene(s) apresentando variada taxa de identidade sequencial, isolados através de digestão com enzimas de restrição ou amplificação em Reação de Polimerase em Cadeia (PCR). Os oligonucleotídeos iniciadores, utilizados na obtenção do gene, devem conter sítios para enzimas de restrições a fim de permitir futuras subclonagens em vetores de expressão. 2. Fragmentação do(s) gene(s). O substrato bt t é fragmentado aleatoriamente, t utilizando principalmente a enzima DNAse I sob condições controladas. Alternativamente, utilizam se enzimas de restrição, podendonestecaso,seestimarotamanho d dos fragmentos gerados. Nessa etapa, é recomendável a obtenção de uma mistura de fragmentos contendo entre 50 a 300 pares de bases. 3. Recombinação gênica Uma PCR, sem adição de oligonucleotídeos iniciadores, é realizada utilizando como molde o produto da etapa (2). Os fragmentos isolados ao se anelarem formam homoduplexes (originados de anelamento de sequências do mesmo gene) ou heteroduplexes (anelamento de sequências de genes distintos) que funcionarão como iniciadores da reação. Uma taxa maior de heteroduplexes, em relação aos homoduplexes, é desejada com intuito de atingir maior diversidade na recombinação. Durante a etapa de extensão, os pequenos duplexes se sobrepõem, formando pontos de junção entre os diferentes segmentos de sequências homólogas. Identidade Sequencial

5 4. Amplificação dos genes recombinados Uma alíquota do produto da primeira PCR (etapa 3) é submetida à nova PCR, porém com adição de oligonucleotídeos iniciadores contendo sequências 5 e 3 dos genes originais. Os homo ou heteroduplexes estendidos atuam como moldes para amplificação dos genes recombinados com o mesmo tamanho do gene original. A população p de genes recombinados é inserida em vetores de expressão apropriados para a seleção de proteínas recombinantes com características desejadas. A combinação da metodologia de com a técnica de apresentação em Fagos (Phage Display) tem sido utilizada para explorar a grande diversidade de mutantes expressando proteínas funcionais. A progênie, proveniente do primeiro ciclo de DNA shuffling, poderá servir de genes parentais (substrato) para os ciclos subsequentes, de modo que o processo poderá serrepetido repetido até seatingir as propriedades desejadas. Genes parentais Biblioteca de genes mutantes Progênie melhorada Expressão e seleção Repetições se necessário Limitações O sucesso ou não da técnica de pode ser medido pelo número de moléculas heteroduplex encontradas na biblioteca de recombinantes obtida; Heteroduplex podem apresentar melhorias funcionais em relação aos genes parentais pelo fato de acumularem as mutações benéficas presentes emgenes parentaisdistintos; Family Shuffling é a denominação para o método original quando utiliza se dois ou mais genes homólogos como substrato; bt t A baixa diversidade de mutantes encontrada em alguns experimentos de é, muitas vezes, atribuída à alta formação de homoduplexes proveniente da sobreposição dos fragmentos durante a etapa de recombinação utilizando PCR; Estratégias utilizando DNA fita dupla e enzimas de restrição, em substituição a enzima DNase I, ou DNA fita simples como substrato são alternativas para amenizar este problema.

6 Family Shuffling Utilizando DNA fita simples A modificação no protocolo original consiste no preparo do substrato, cuja utilização de DNA fita simples reduz a formação de homoduplexes, permitindo o aumento da diversidade de mutantes; Os DNAs fita simples (ssdna) e complementares entre si são purificados, a partir de partículas de fagos, e usados como substratos para o shuffling. A utilização desse método favorece a formação de heteroduplexes e aumenta a diversidade de recombinantes. Family Shuffling Utilizando DNA fita dupla e enzimas de restrição Tendo em visa o aumento na taxa de recombinação utilizou se enzimas de restrições para a fragmentação de dois ou mais genes homólogos, em substituição a enzima DNase I. Embora este procedimento apresente vantagens quanto à previsão do número e tamanho dos fragmentos gênicos, a diversidade dos produtos recombinados pode ficar restrita à disponibilidade de sítios deligação para as enzimas de restrições. Dependendo da sequência gênica a digestão enzimática pode gerar fragmentos demasiadamente grandes, favorecendo à baixa taxa de recombinação; A utilização de várias enzimas pode minimizar este problema. Obje vo: a resistência aos an bió cos cefalosporinas Genes homólogos genes para cefalosporinase

7 A Apresentação ã em Fagos F (Phage Display Display)) Apresentação em Fagos (Phage Display) Display) Apresentação em fagos (Phage display), é um método para o estudo prático de evolução química artificial que utiliza a tecnologia de DNA recombinante. Nesta técnica as sequências codificantes de peptídeos ou proteínas são incorporadas ao sistema de replicação viral (bacteriófagos). Bacteriófagos são vírus que infectam células bacterianas. Os vetores usados em pesquisa de DNA recombinante são fagos que infectam o hospedeiro para DNA recombinante padrão, ou seja, a bactéria Escherichia coli.

8 Visão Geral Bacteriófago filamentoso piii pvi pviii ssdna pvii pix Fagos Vetores Fagos piii pvi pviii pvii pix

9 Fagos Fagos Apresentação de Fagos Exemplos aplicação Trypsin like serine proteases proteases Proteases envolvidas na cascata de coagulação sanguínea: plasmina kalicreína Resíduos de aa do sítio catalítico fator XIa 81% de identidade sequencial complexo fator VIIa

10 Inibidores de proteínas trypsin like Inibidores de proteínas trypsin like Inibidor de proteases Domínio Kunitz (~60 (60 aa; 33% de identidade sequencial) Domínio da proteína β precursora de fibra amilóide de Alzheimer (APPI) Inibidor D1 de coagulação associado à lipoproteína (LACI D1) Resíduos (alça 1ª de ligação) Resíduos (alça 2ª de ligação / estruturação da alça 1ª) Pontes dissulfeto (estabilização da estrutura) Minimização do esqueleto estrutural Minimização do esqueleto estrutural Minimização da estrutura e manutenção da função Domínio Z da proteína A bacteriana (59 aa) Estruturação do epítopo p epítopo 33 resíduos K d = 3400 nm K d = 300 nm K d = 40 nm K d = 20 nm