Estratégias de clonagem

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO PÓLO AVANÇADO DE XERÉM GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA CURSO MELH. GEN. E OGMs (XBT353) TURMA 2015/2 Estratégias de clonagem Prof. Dr. Silas Pessini Rodrigues Rio de Janeiro, 24 de novembro de 2015

2 Pontos de partida para clonagem: 1)mRNA cdna 2)DNA genômico 3)DNA sintetizado quimicamente

3 A abundância de mrnas varia entre células House keeping genes = produto é requerido para o metabolismo celular básico Expressão tecido-dependente = alguns genes são espressos em células/tecidos específicos

4 Síntese de DNA à partir do mrna = DNA complementar (cdna) Problemas: 1. O 3 -OH do cdna pode não ser acessível para a DNA pol 2. Síntese ineficiente mrna longos a região codificante pode não ser sintetizada ou prevalecem regiões 3 -OH 3. Nuclease S1 pode retirar trechos importantes na extremidade 5

5 A utilização de um primer adaptador aumenta a eficiência de síntese de DNA em dupla fita (dsdna) Utilizada para a síntese do oligo dc em extremidades 3 -OH Oligo dc Oligo dg Também requer tratamento com S1 nuclease a região dos oligos reduz a chance de degradação de área importante

6 De que forma o DNA é inserido no vetor? 1. dsdna tem extremidades cegas ligados no vetor por uma ligase processo ineficiente se aumentar a concentração, aumenta-se a chances de auto-circularização do vetor 2. Likers são adicionados ao cdna eles contêm extremidades coesivas permitem melhor controle na formação do constructo, vetor + DNA de interesse 3. Adaptadores 4. Caldas de homopolímeros

7 A adição de linkers fornece extremidades coesivas para o dsdna linker Extremidade coesiva = aumenta a eficiência na formação de DNA recombinante

8 Os adaptadores têm o mesmo papel dos linkers, mas não requerem tratamento com endonuclease Adaptador = já leva a extremidade coesiva pronta extremidade coesiva

9 As caldas de homopolímeros são alternativas aos linkers e adaptadores mais frequentemente utilizados em fragmentos contendo o sítio de restrição para PstI caldas longas de um mesmo nucleotídeo são inseridas são diferentes, mas complementares no vetor e no inserto o recombinante é estável para ser inserido na célula sem ligação previa a ligação ocorre in vivo (depois que já esta inserido no hospedeiro) já os adaptadores e linkers requerem o tratamento posterior com uma ligase de DNA.

10 Bibliotecas genômicas: conjunto de clones que representa todo o genoma de um organismo Quantos subclones são necessários para representar todo o genoma? depende do tamanho do genoma os fragmentos devem ser gerados de forma independente da sequência (randômica) o número mínimo é previsto utilizando-se:

11 Estimativa do tamanho de bibliotecas genômicas para diferentes organismos

12 Como os fragmentos de DNA genômico são gerados? Situação ideal, DNA genômico extraído na maioria com 100 kb se vetores fagos forem utilizados (17-23 kb subfrag.) ou >>300kb se BACs/YACs forem utilizados (300 kb subfrag.) o método de fragmentação tem que ser independente de sequência e aleatóreo

13 Geração de fragmentos de DNA genômico para clonagem: a pressão hidrostática aplicada ao DNA induz quebras aleatóreas na molécula Sistema automatizado de clivagem de DNA genômico

14 Digestão parcial com endonucleases pode gerar os gragmentos no tamanho médio desejado Variando-se a concentração e o tempo de incubação populações de fragmentos de tamanhos diferentes são gerados Determinada a condição de digestão ou fragmentos por pressão hidrostática os fragmentos podem ser isolados por eletroforse ou ultra-centrifugação

15 Os fragmentos de DNA genômico de interesse gerados são inseridos no vetor Se BamHI foi utilizada na digestão parcial do DNA genômico pode ser utilizada em um vetor contendo o sítio para Sau3A (mesma seq.) ex.: fago EMBL4

16 De que forma o DNA é inserido no vetor? 1. dsdna tem extremidades cegas ligados no vetor por uma ligase processo ineficiente se aumentar a concentração, aumenta-se a chances de ato-circularização do vetor 2. Likers são adicionados ao cdna eles contêm extremidades coesivas permitem melhor controle na formação do constructo vetor + DNA de interesse 3. Adaptadores 4. Caldas de homopolímeros 5. Estratégias avançadas de clonagem

17 Exemplo da estratégia desenvolvida por Hiroto Okayama and Paul Berg permitiu que a seqüência completa do cdna fosse clonada Síntese do primer

18 Exemplo da estratégia desenvolvida por Hiroto Okayama and Paul Berg permitiu que a seqüência completa do cdna fosse clonada Síntese do adaptador Síntese do ds cdna encolve: RNAse H, DNA poli e Ligase Adaptador