O Sequenciamento de DNA

Transcrição

1 O Sequenciamento de DN

2 Definição Identificação da ordem exata das bases (,, e ) em um segmento de DN. Importância Ref: 1 O conhecimento da sequência de bases de um gene fornece importantes informações sobre sua estrutura, função e relação evolutiva com outros genes (de um mesmo organismo ou de organismos diferentes).

3 Frederick Sanger ~1955: publicou a sequência de aminoácidos da insulina anhou o Nobel de química em : inventou o método di-desoxi para o sequenciamento do DN 1977: foi o primeiro a sequenciar um genoma completo (bacteriófago phi X 174) 11 genes em 5386 bases anhou o segundo Nobel de química em 1980 Ref: 1.1 Ref: 2

4 O método de Sanger, 1975 Ref: 3 1- omo acontece a síntese de moléculas de DN? 2 -O que faria um nucleotídeo que, ao contrário de ter a extremidade 3 -OH, tivesse uma extremidade 3 -H?

5 Síntese do DN H Ref: 4

6 Ref: 5

7 Sequenciamento Sanger Etapa 1 mplificação ipo-pr - DN polimerase - Primer - ampão - dnps (desoxinucleotídeo) - ddnps (didesoxinucleotídeo) Etapa 2 - Eletroforese

8 Reação de Sequenciamento

9 Reação de Sequenciamento

10 3 5 3 Reação de Sequenciamento

11 Reação de Sequenciamento

12 Reação de Sequenciamento

13 Reação de Sequenciamento

14 Reação de Sequenciamento

15 Incorporação dos ddnps é aleatória População de moléculas Fita molde

16 Eletroforese separa os fragmentos de diferentes tamanhos Fragmentos maiores Fragmentos menores

17 Modelo Original Fita molde - 4 reações necessárias: uma para cada base (marcadas com radioisótopos) - Eletroforese separa fragmentos de diferentes tamanhos - Leitura manual da sequência de baixo pra cima Ref: 6

18 Modelo Moderno semi-automatizado Ref: 6.1 Eletroforese utiliza um laser para ativar os ddnps fluorescentes e um detector distingue as cores

19 BigDye terminator Espectro de Emissão Ref: 8.2

20 4 ddnps na mesma amostra Ref: 7

21 Sequenciamento em BI377

22 Eletroforese apilar O sequenciador executa a eletroforese em géis capilares ultrafinos Fragmentos maiores Fragmentos menores Ref: 9

23 romatograma

24 Sequenciamento ene específico

25 Sequenciamento enômico - Shotgun

26 Sequenciamento de Nova eração Sequenciar milhões de pares de bases em uma única corrida Pirosequenciamento Illumina Solid Ion torrent

27 Pirosequenciamento Sequenciamento por síntese!!! 454 S FLX+ system O método de pirosequenciamento baseia-se em detectar a atividade da DN polimerase com uma outra enzima que produz quimiluminescência

28 omo funciona 1. onstrução das bibliotecas: - Fragmentação do DN genômico por nebulização - Bioanalyzer DNhip - Ligação a adaptadores ( e B) Ref:11 Ref:11.2

29 2. PR em Emulsão em PR óleo Emulsão de água em óleo Ref:12

30 PR em Emulsão Biblioteca de DN com adaptadores Mistura das beads com o DN riação da emulsão água em óleo micro reatores Quebra dos micro reatores e isolamento das beads positivas (com DN) mplificação da amostra ocorre dentro dos micro reatores Deposição das beads e dos reagentes de PR nos micro reatores Ref:11

31 Sequenciamento das amostras 3. arregar as amostras em lâmina Ref:11

32 4. Sequenciamento Ref:11 Luz Ref:11.1

33 Pirograma 4-mer Ordem do fluxo de nucleotídeos 3-mer 2-mer 1-mer Sequência para calibração de sinal Ref:11

34 Originalmente desenvolvido pela Solexa Método baseado em nucleotídeos com corantes terminais reversíveis que permitem a identificação de bases individuais, que são introduzidos nas cadeias de DN. Sequenciamento por síntese!!

35 omo funciona 1. onstrução das bibliotecas: fragmentação do DN por sonicação e ligação a adaptadores 2. Ligação do DN à lâmina Ref: 13

36 3. PR em Ponte: amplificação dos fragmentos em uma plataforma sólida de vidro diciona-se os reagentes para PR Ref: 13

37 s bases são diferentes Nucleotídeos terminais reversíveis com marcadores fluorescentes O marcador fluorescente serve como terminador para a síntese Ref: 14

38 O Sequenciamento O ciclo começa com a adição das 4 bases, primers e DN polimerase. O laser excita o marcador fluorescente e a imagem é capturada pela câmera D. Ref: 13 Ref: 13

39 feature=endscreen&nr=1&v=l99akkhcx4 Ref: 13

40 SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) Sequenciamento por ligação!!! Ref: 15 Ref: 16

41 omo funciona 1. onstrução das bibliotecas: 2. PR em emulsão 3. Enriquecimento das beads 4. Deposição das beads 5. Sequenciamento Ref: 17

42 Sequenciamento por ligação: DN ligase ligação é realizada utilizando 16 sondas específicas: rupo OH livre 3 5 n n n z z z Sítio de clivagem orante fluorescente Ref: 11 E 5 primers: n, n-1, n-2, n-3, n-4 Ref: 11

43 O sequenciamento Ref: 17

44 Ref: 17

45 etapa de sequenciamento é composta basicamente de 5 rodadas Ref: 17 Permite a leitura de cada base duas vezes.

46 Ref: 17

47 6. Decodificando os dados: Ref: 17 base zero é conhecida pois faz parte do adaptador P1

48 Pirosequenciamento Solid Illumina Ref: 17.1

49 Jonathan Rothberg Ion torrent Um chip capaz de sequenciar um genoma inteiro. Sequenciamento por síntese Baseado na detecção de íons de hidrogênio: o H + liberado altera o ph da solução!!!

50 Preparação da biblioteca: Fragmentação do DN e reparo dos finais 3 e 5 Seleção do tamanho dos fragmentos Ligação a adaptadores mplificação por PR em emulsão Ref: 17.2

51 O sequenciamento: polimerase incorpora um nucleotídeo H + e fosfato são liberados Ref: 18

52 Ref: 18

53 Ref: 18 ransistor ISFE Semicondutor MOS Ref: 18.1

54 Sequencer 454 Illumina SOLiD Ion Sanger Mecanismo Pirosequenciamento Sequenciamento por síntese Ligação e ódigo de duas bases Semicondutor erminação de cadeia por ddnps amanho do read 800 pb pb 50 pb 75 pb pb 400 pb 900 pb Reads por corrida 1 b 600 b ~ 80 b ~ 120 b ~ 160 b 1-2 b 1,9 84 Kb empo de corrida 24 Horas 11 Dias 7 Dias 7 Horas 3 Horas Vantagens amanho do read, rapidez lta produtividade acuidade Rapidez, Baixo custo lta qualidade, tamanho Desvantagens Maior taxa de erro em homopolímeros, lto custo Montagem de reads pequenos Montagem de reads pequenos Baixa produtividade lto custo, Baixa produtividade

55 Sequenciamento de erceira eração Ref: 19 PR não é necessário antes de sequenciamento!!! O sinal é capturado em tempo real!!!

56 SMR: Single-Molecule Real-ime (PacBio) DN polimerase Ref: 19.1 Zero-mode waveguides (ZMWs): câmera de visualização nanofotônica Ref: 20 - Reads pb!!!

57 Nanopore Stuart Lindsay Ref: 22 Ref: 21 Método de sequenciamento de DN em que uma fita de cadeia simples de DN passa através de um nanotubo.