Animais transgênicos e Xenotransplantes

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1 Animais transgênicos e Xenotransplantes Prof. Dr. Vinicius Farias Campos Disciplina de Transgênese Animal Graduação em Biotecnologia - UFPel

2 Abordagens da aula Histórico e contextualização 2. Animais transgênicos e xenotransplantes 3. Métodos de geração e controle da expressão 4. Minisuínos transgênicos 6. Aplicações dos xenotransplantes

3 Contextualização e classificação dos transplantes Autotransplante (auto = próprio) transplante de tecido de uma parte para outra do corpo da mesma pessoa sem rejeição Ex. ponte de safena transplante Tipo mais comum de Alotransplantes (alo = outro) transplante entre indivíduos de uma mesma espécie mas geneticamente diferentes. Ex. transplante de coração a partir de um doador compatível Xenotransplante (xeno = extranho) transplante entre espécies diferentes. Ex. suíno para um humano

4 Alotransplantes Revolucionaram a medicina década de 50 Atualmente são realizados cerca de transplantes por ano no Brasil Set/2013 haviam pessoas na fila de espera no Brasil Escassez de órgãos Busca de novas fontes de órgãos Dados: ABTO, 2012

5 ABTO, 2013

6 Novas fontes de órgãos para transplantes Órgãos robóticos ou mecânicos Engenharia de tecidos células tronco Xenotransplantes

7 Histórico dos Xenotransplantes 1682 Transplante de parte do crânio de um cão para um homem na Rússia 1800 Transplante da pele de sapo para feridos na guerra inglesa 1965 Transplante de rins de chimpanzé para um homem 1992 Transplante de um fígado de babuíno para um homem 2012 Testes pré-clínicos com transplante de ilhotas pancreáticas de suínos transgênicos para humanos

8 Por que gerar animais transgênicos para os xenotransplantes? Nos alotransplantes barreiras genéticas imunológicas precisam ser superadas Busca de doadores geneticamente compatíveis e uso de imunossupressores O que nem sempre é bem sucedido! E causa redução da resposta imune no paciente transplantado Nos xenotransplantes isto ocorre também!

9 Por que gerar animais transgênicos para os xenotransplantes? Com o desenvolvimento da transgênese animal Modificação os animais doadores para remover as barreiras imunológicas Fornecendo uma solução genética para um problema genético!

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11 Quais espécies podem ser usadas para os xenotransplantes? Macacos Suínos

12 Macacos Animal com maior semelhança ao humano; Transmissão de vírus patogênicos (HIV); Problemas éticos; Não é mais usado

13 Suínos Humano (9 semanas) Suíno (4 semanas)

14 Suínos Não-primata mais semelhante fisiologicamente ao homem; Órgãos com tamanho semelhante aos órgãos humanos; Ciclos reprodutivos curtos e proles grandes; Crescimento rápido; Espécie domesticada e já utilizada no consumo humano Menos problemas éticos; Métodos para a transgênese bem estabelecidos. Modelo ideal para xenotransplantação

15 Qual o papel da transgênese nos xenotransplantes? 1. Superar barreiras imunológicas 2. Superar barreiras fisiológicas 3. Evitar xenozoonoses

16 1. Suínos transgênicos para superar barreiras imunológicas Remoção dos genes (knockout) dos principais antígenos causadores da rejeição hiperaguda; Adição de genes (knockin) para proteínas imunomoduladoras do sistema imune humano rejeição crônica;

17 Quais genes devem ser removidos (nocauteados) nos suínos transgênicos? O epítopo α1, 3-galactosiltransferase (αgal) Glicoproteína de membrana das células suínas; Presente em quase todas as células suínas; Principal responsável pela rejeição hiperaguda; Atacado por antícorpos humanos anti-αgal; Principalmente em órgãos vascularizados. D ápice & Cowan, 2009

18 Quais genes devem ser inseridos (knockin) nos suínos transgênicos? Reguladores do sistema complemento Função de bloquear o sistema complemento humano Reguladores da coagulação e trombose Inibir a formação de coágulos e trombos nos órgão xenotransplantados Moléculas imunossupressivas Atuam bloqueando a resposta imune no órgão xenotransplantado

19 Os suínos transgênicos são utilizados nos xenotransplantes para: 1. Superar barreiras imunológicas 2. Superar barreiras fisiológicas 3. Evitar xenozoonoses

20 Suínos transgênicos para superar barreiras fisiológicas Órgãos complexos como FÍGADO e RIM produzem muitas proteínas circulantes; As proteínas suínas podem ser incompatíveis com os receptores humanos devido à diferenças estruturais Proteína Humana Proteína Suína D ápice & Cowan, 2009

21 Suínos transgênicos para superar barreiras fisiológicas Genes para proteínas humanas devem ser inseridos em suínos transgênicos Garantindo a funcionalidade completa do órgão D ápice & Cowan, 2009

22 Os suínos transgênicos são utilizados nos xenotransplantes para: 1. Superar barreiras imunológicas 2. Superar barreiras fisiológicas 3. Evitar xenozoonoses

23 Suínos transgênicos para evitar xenozoonoses Retrovírus endógeno suíno (PERV) Integrado no genoma suíno Transmitido junto com as células transplantadas Risco de ser ativado Remoção do PERV por nocaute do genoma viral PERV em células suínas

24 Como gerar os suínos transgênicos para xenotransplantes?

25 Transferência Gênica Métodos de geração de suínos transgênicos Embriões Gametas Células Microinjeção de DNA Transferência gênica mediada por espermatozoides (SMGT)} Transferência nuclear de células somáticas (SCNT)

26 Transferência nuclear de células somáticas (SCNT) Suínos transgênicos para xenotransplantes SCNT Nocaute Inserção Ex. αgal Ex. hdaf

27 Multi-SMGT Embriões suínos expressando três proteínas fluorescentes EBFP DsRED GFP

28 Como controlar a expressão dos transgenes?

29 Métodos de controle da expressão gênica em animais transgênicos Construção do vetor (cassete gênico) Promotores tecido-específicos ou constitutivos

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32 Controle da expressão do transgene em suínos para xenotransplantes Realizar a expressão tecido-específica dos imunoreguladores; Essencial para prevenir rejeição dos órgãos xenotransplantados Promotores tecido-específicos; Evitar o uso de promotores virais e constitutivos; Genoma suíno (2012) novas regiões regulatórias devem ser descobertas.

33 Controle da expressão do transgene em suínos para xenotransplantes Expressão do imunomodulador CD4 células β das ilhotas Insulina hcd4 Klymiuk et al. (2012) Células β - ilhotas

34 Minisuínos Transgênicos

35 Minipigs transgênicos para o estudo da xenotransplantação Tamanho Reduzido Fácil manipulação em experimentos Baixo custo de manutenção Minipigs nocaute αgal

36 Aplicações atuais dos xenotransplantes

37 Aplicações atuais dos xenotransplantes Transplante de órgãos sólidos Ex. Fígado, Rim, Coração Transplante de células e tecidos Ex. Ilhotas pancreáticas

38 Aplicações atuais dos xenotransplantes Transplante de ilhotas pancreáticas de suínos para portadores de diabetes

39 Aplicações atuais dos xenotransplantes Em 2010 foi aprovado o xenotransplante de ilhotas pancreáticas de súínos para humanos na Rússia

40 Outros órgãos suínos para xenotransplantação

41 Recapitulando... Não há doadores suficientes para alotransplantes Xenotransplantes Suínos transgênicos para tornar os xeno-órgãos compatíveis geneticamente com os humanos Nocaute do αgal Inserção de genes imunomoduladores Geração dos suínos transgênicos por SCNT e SMGT Controle da expressão por promotores tecidoespecíficos Minipigs

42 Prof. Dr. Vinicius Farias Campos Graduação em Biotecnologia