Manipulação genética em modelos animais

Transcrição

1 Manipulação genética em modelos animais

2 Antes da biologia molecular aplicada a genética: -Modelos animais = mutações espontâneas -Transmitidas para descendentes -Identificar defeitos genéticos de interesse

3 Com os avanços das técnicas de biologia molecular e celular e da engenharia genética: novas metodologias passaram a ser empregadas e tornou-se possível a manipulação do DNA bem como a alteração controlada do genoma

4 Animais transgênicos O termo transgênico: engloba animais que tiveram genes adicionados (transgênicos por adição), modificados (knockin) ou retirados (knockout). As técnicas para a geração de modelos transgênicos representavam uma das mais promissoras biotecnologias tanto para fins comerciais como para diversas áreas da pesquisa básica

5 Os primeiros animais transgênicos knockout, produzidos pela técnica de recombinação homóloga em células tronco só foram gerados em 1987 por dois grupos diferentes (Doetschmann e cols, 1987; Thomas e Capecchi, 1987)

6 Mario R. Capecchi, Ph.D., of the University of Utah, has won the 2007 Nobel Prize in Physiology or Medicine

7 animais transgênicos Diferentes espécies como boi, porco, ovelha, coelho, rato e camundongo, etc... Camundongos: menor tamanho, custo de manutenção reduzido, embriões de boa qualidade para manipulação, além de ser uma das poucas espécies cuja manutenção de células tronco indiferenciadas em cultura éviável, o que possibilita a retirada de genes por recombinação homóloga e geração de modelos knockout

8 Camundongos transgênicos Importância: Em pesquisa biomédica, na criação de modelos animais de doenças humanas, entre elas, doenças cardiovasculares, auto-imunes e neurológicas, AIDS câncer Tais modelos animais permitem o exame detalhado da fisiopatologia da doença, além de servirem para delinear novas formas de tratamento, desenvolvimento de testes diagnósticos, agentes terapêuticos inovadores e em terapia gênica

9 Camundongo transgênico Por adição

10 Camundongos knockout

11 Camundongos knockout

12 Step 1. Isolate developing embryo at blastocyst stage. This embryo is from a strain of mice with gray or white fur. (C57Bl6 albino) Step 2. Remove embryonic stem cells from gray or white-fur blastocyst. Grow stem cells in tissue culture. Células embrionarias: 129

13 Recombinação homologa neomicina Timidina kinase

14 Timidina kinase Não vive na presença de ganciclovir

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16 Step 3. Transfect stem cells with homologous recombination construct. Select for homologous recombination by growing stem cells in neomycin and gancyclvir. + neomycin + gancyclovir

17 Step 4.Remove homologously recombined stem cells from petri dish and inject into a new blastocyst that would have only white fur.

18 Step 5. Implant several chimeric blastocysts into pseudo-pregnant, white or black fur mouse. (C57Bl6) Step 6. Mother will give birth to a range of mice. Some will be normal white fur mice but others will be chimeric mice. Chimeric mice have many of their cells from the original white fur blastocyst but some of their cells will be derived from recombinant stem cells. Fur cells from recombinant stem cells produce gray patches which are easily detected.

19 Step 7. Mate the chimeric mice with wild-type white fur mice. If the gonads of the chimeric mice were derived from recombinant stem cells, all the offspring will have gray fur. Every cell in gray mice are heterozygous for the homologous recombination. Step 8. Mate heterozygous gray mice (+/ H) and genotpye the gray offspring. Identify homozygous recombinants (H / H) and breed them to produce a strain of mice with both alleles knocked out. The pure breeding mouse strain is a "knockout mouse". knockout mouse

20 A Timeline for Knockouts after DNA is provided to Core Step in the Process Responsibility Timeframe 1. Wait for transfection avaliability: 1-2 weeks 2. Transfection, picking, expanding, freezing: CORE 4 weeks 3. Screening: Investigator 1 month max 4. Expanding homologous recombinant clones: CORE 3 weeks 5. Reconfirmation: Investigator 2 weeks 6. Karyotype: CORE 2-3 weeks 7. Blastocyst injection: CORE 1-2 weeks 8. Transfer chimeric mice after blastocyst injection: CORE 5 weeks 9. Breeding for germline transmission: Investigator 1-6 months 10. Breeding to homozygosity: Investigator 2-3 months Reasonable expectation: 1 year

21 Outros modelos green fluorescent protein GFP Vitor 1 o camundongo transgênico pela microinjeção pronuclear UNIFESP hipertenso

22 Obrigado!!! Pink e cérebro Vamos conquistar o mundo