AVALIAÇÃO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE Brachiaria brizantha UTILIZANDO COMPLEXO ENZIMÁTICO COMERCIAL

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1 AVALIAÇÃO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE Brachiaria brizantha UTILIZANDO COMPLEXO ENZIMÁTICO COMERCIAL T. D. MENDES 1, T. F. PACHECO 1, F. B. P. CARVALHO 1, D. S. RODRIGUES 1, C. M. M. MACHADO 1, M. A. CARVALHO 2 1 Embrapa Agroenergia Laboratório de Processamento de Matérias Primas Energéticas 2 Embrapa Cerrados Genética e Melhoramento de Forrageiras para contato: thais.demarchi@embrapa.br RESUMO A hidrólise enzimática é um dos principais fatores que elevam o custo da produção de etanol celulósico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um complexo enzimático e definir condições de hidrólise para um substrato natural (Brachiaria brizantha), previamente tratado com ácido (1,5% v/v) e hidróxido de sódio (4% m/v). As atividades enzimáticas foram determinadas em papel, avicel, carboximetilcelulose e celobiose. A biomassa pré-tratada (94% celulose), foi submetida à hidrólise em condições ótimas de temperatura e ph, até variação não significativa de glicose no meio (8 h). Em seguida, o sólido remanescente foi lavado e submetido novamente à hidrólise. Pôde-se observar que toda a celulose do material é passível de hidrólise em três etapas (24 h), enquanto o processo de hidrólise completa em uma etapa ocorre em 72 h, indicando efeitos de inibição. Testes de hidrólise da biomassa (razão sólido:líquido, 1:10) variando a concentração inicial de glicose (10 a 40 g/l) e a carga enzimática (30 a 240 FPU/g de material) foram realizados. Observou-se redução na velocidade inicial de hidrólise com o aumento da concentração inicial de glicose e redução do tempo de conversão com o aumento da quantidade de enzima. Os tempos para atingir conversão da celulose superior a 80 % foram: 72 horas para 30 FPU, 56 horas para 60 FPU e 48 horas para 120 e 240 FPU. Concluiu-se que a velocidade de hidrólise é afetada pela carga enzimática e pela concentração de glicose no meio. 1. INTRODUÇÃO O interesse acerca dos biocombustíveis aumentou de forma dramática nos últimos anos. Não apenas em virtude do discurso da contenção dos danos ambientais; mas também impulsionado pelo aumento da demanda de energia acompanhada do declínio da oferta de combustíveis fósseis. Os processos de obtenção de etanol a partir do caldo de cana-de-açúcar ou do amido do milho já se encontram estabelecidos há muitos anos. O crescente interesse e demanda por etanol tem direcionado as ações de PD&I para a viabilização da produção de etanol a partir de biomassa lignocelulósica, o denominado etanol de segunda geração. Pesquisas têm sido desenvolvidas visando o aproveitamento de biomassa, residuais ou não, como coníferas, feno,

2 forrageiras, taxi branco,bagaço e palha de cana-de-açúcar, palha de trigo, de milho e de arroz, resíduos da indústria de papel, entre outros. A biomassa lignocelulósica é constituída principalmente por celulose, hemicelulose e lignina. De maneira geral, a celulose, polissacarídeo composto por moléculas de glicose unidas por ligações β-1,4-glicosídicas,é encontrada em maior proporção. Para que a biomassa possa gerar açúcares fermentescíveis, via processo bioquímico, esta deve passar por duas etapas: pré-tratamento e hidrólise enzimática. A etapa do pré-tratamento é fundamental para o sucesso da ação das enzimas sobre a biomassa. Nesse processo, por ação físico-química, ocorre a desestruturação do material lignocelulósico, podendo ocorrer a extração da hemicelulose e/ou lignina. Como conseqüência, as fibras de celulose ficam mais acessíveis à ação das enzimas celulolíticas (OGEDA e PETRI, 2010). Celulases são divididas, de acordo com seu local de atuação, em três grupos: endoglucanases, que clivam as ligações glicosídicas internas das cadeias de celulose; exoglucanases, que atuam nos terminais da cadeia, gerando celobiose; e β-glucosidades que hidrolisam a celobiose à glicose (BHAT, 2000). Estes três grupos de enzimas agem em sinergia e, em consórcio, são denominadas como complexo celulolítico. O processo de hidrólise enzimática de biomassa ainda não se encontra estabelecido, mas é uma tecnologia que vem sendo indicada como a mais promissora e incluída como parte do processo modelo da produção de etanol de segunda geração. O entrave para sua aplicação ainda é o alto custo das enzimas (TAYLOR, 2008). Esforços em PD&I de empresas e instituições de diversos países têm como objetivos o aumento da eficiência do processo de hidrólise e diminuição do custo de produção e comercialização das enzimas. As empresas líderes no mercado de enzimas, Novozymes e Genencor, têm focado na indústria de biocombustíveis. A Genencor possui o complexo Accelerase DUET, que apresenta alta quantidade de β-glicosidase (GENENCOR, 2010). Já a Novozymes tem como atual produto o Cellic CTec2, que apresenta altos níveis de atividade β-glicosidase, é tolerante a inibidores, e compatível com diferentes matérias-primas lignocelulósicas e processos de pré-tratamento (NOVOZYMES, 2010). O custo do emprego de ambas as enzimas é o menor já alcançado pelas empresas, cerca de US$ 0,13 por litro de etanol. Um complexo celulolítico ideal, que proporcione alta eficiência de conversão, deve apresentar as seguintes características: operação em temperatura e ph brandos; ajuste correto na quantidade das diferentes enzimas componentes, garantindo uma ação sinérgica entre elas; elevada especificidade; tolerância ao produto de hidrólise; alta estabilidade em ph e temperaturas ótimos; alta atividade em substratos insolúveis (MAKI et al., 2009). A eficiência dos complexos enzimáticos não pode ser determinada apenas sobre substratos padrão. É de fundamental importância a avaliação da ação das preparações enzimáticas sobre substratos naturais, como a parede celular vegetal (SINGHANIA et al.,

3 2010). O objetivo deste trabalho foi caracterizar, quanto à atividade, o complexo enzimático Cellic CTec2 e avaliar a atuação deste na hidrólise de Brachiaria brizantha cv. Marandu. 2.MATERIAl E MÉTODOS 2.1. Material Foi utilizado o complexo enzimático comercial Cellic CTec2, gentilmente cedido pela empresa Novozymes. Como substrato, utilizou-se a forrageira Brachiaria brizantha cv. Marandu, cultivada em campo experimental da Embrapa Cerrados. O material passou por secagem a 70 C por 48 horas e moagem em moinho de facas (granulometria máxima de 2mm) Métodos Caracterização da atividade do extrato enzimático: Foram determinadas as atividades do extrato enzimático sobre os seguintes substratos: papel de filtro, carboximetilcelulose (CMC) e celobiose de acordo com metodologia descrita por Ghoose (1987) e em avicel, segundo Adriano (2008) Pré-tratamento da biomassa: O substrato seco e moído passou por pré-tratamento ácido seguido de alcalino. O pré-tratamento ácido consistiu em expor o material à solução de ácido sulfúrico 1,5 % v/v, para cada grama de material seco foram utilizados 10 ml de solução de ácido sulfúrico. A suspensão foi mantida em autoclave por 30 minutos a 121ºC. Após a reação, a amostra foi filtrada e a fração sólida passou por dupla lavagem com água destilada utilizando volume correspondente ao da solução ácida empregada. O sólido foi então submetido ao tratamento alcalino. Nesta etapa, para cada grama de material seco foram utilizados 10 ml solução de hidróxido de sódio 4% (m/v). A suspensão foi então mantida em autoclave por 30 minutos a 121ºC. Imediatamente após a retirada da autoclave, o material foi filtrado e a fração sólida lavada com água a 100ºC (cerca de cinco vezes o volume de solução de NaOH utilizado). A amostra resultante do pré-tratamento passou por caracterização quanto à composição de açúcares segundo método de Gouveia e colaboradores (2009) Hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada: A biomassa pré-tratada, ainda úmida, foi suspensa (na proporção 1:10, em base seca) em tampão citrato de sódio/ácido cítrico0,1m ph 5.Para cada grama de material presente na biomassa pré-tratada (peso seco) foi adicionado o correspondente a 30 FPU do complexo enzimático comercial. A hidrólise foi realizada em erlenmeyers de 250 ml, em agitador orbital, sob agitação constante de 200rpm, a uma temperatura de 50ºC por 72 horas Digestibilidade da celulose presente na biomassa pré-tratada: Para avaliar a digestibilidade da celulose disponível na biomassa pré-tratada, esta foi submetida a três hidrólises consecutivas. Cada etapa teve duração de 8 horas, as demais condições do processo foram mantidas(item 2.2.3). Entre os sucessivos processos de hidrólise, o material sólido foi lavado para a retirada dos açúcares e enzima livres provenientes da hidrólise anterior.

4 Efeito da adição de glicose sobre a atividade enzimática: Para avaliar o efeito inibitório do produto (glicose) sobre a atividade do complexo enzimático, ao início da hidrólise enzimática foram adicionadas 10, 20, 30 e 40 g/l de glicose. As condições de hidrólise foram as descritas no item e a quantidade de glicose foi acompanhada durante as 8 horas de hidrólise. A quantidade de glicose formada em cada uma das condições foi comparada à formada na hidrólise controle, onde não houve a adição prévia de glicose Efeito do emprego de diferentes cargas enzimáticas: Para avaliar o efeito do emprego de crescentes cargas enzimáticas sobre a velocidade de hidrólise foram empregados 30, 60, 120 e 240 FPU/g material seco. As condições de hidrólise foram as mesmas descritas no item RESULTADOS E DISCUSSÃO A caracterização do complexo enzimático Cellic CTec2 quanto à atividade sobre diferentes substratos está apresentada na Tabela 1. A atividade sobre papel de filtro Whatman n 1 (U FP ) é utilizada como referência para a atividade global das enzimas celulolíticas que agem sinergicamente na hidrólise da celulose (GHOSE, 1987). Pode-se observar também alta atividade em celobiose, o que indica que o extrato é rico em β-glicosidase. Segundo ficha técnica da Cellic CTec2, o diferencial do referido extrato é exatamente o enriquecimento com β-glicosidase (NOVOZYMES, 2010). A atividade em avicel é muito reduzida se comparada às atividades em CMC e celobiose. A baixa atividade em avicel indica que o extrato é pobre em exo-celulases. Tabela 1. Atividade do extrato enzimático Cellic CTec2 Novozymes sobre diferentes substratos. Substrato Atividade*.mL -1 de extrato Papel de filtro (U FP ) 583 CMC (U CMC ) 4121 Avicel (U Avicel ) 148 Celobiose (U Celobiose ) 9991 *µmol/min Para se avaliar a atuação do complexo celulolítico comercial na hidrólise de substrato real, optou-se por realizar um pré-tratamento que resultasse em material rico em celulose e baixos teores de hemicelulose e lignina. A forrageira B. brizantha passou, inicialmente, por um tratamento ácido para a remoção da hemicelulose e, em seguida, por um tratamento alcalino, para a extração da lignina. Ao final dos processos a biomassa pré-tratada apresentou 94% de celulose. A cinética da hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada está apresentada na Figura 1. Em reação contendo 10% de carga de sólido e 30 FPU/g de material lignocelulósico seco, após 72 horas de hidrólise, o meio reacional atingiu uma concentração de 88,3g/L de glicose, o que corresponde a 94% de conversão da celulose presente no material.

5 Observa-se a diminuição da velocidade da reação depois de transcorridas 8 horas de hidrólise, quando cerca de 45% da celulose disponível já havia sido convertida e a concentração de glicose no meio era de 42,5 g/l (Figura 1).A diminuição na velocidade pode ser resultante de diversos fatores, entre eles (i) o grau de cristalinidade e polimerização da celulose no material residual (XIMENESet al.,2010); (ii) difusão das enzimas (transferência de massa) no decorrer do processo hidrolítico (GAN et al., 2002); (iii) efeito da adsorção das enzimas à celulose (GAN et al., 2002) e principalmente à lignina (TU, et al., 2009); (iv) e inibição da enzima pela crescente concentração do produto (glicose e celobiose) no meio reacional (GAN et al., 2002). Concentração glicose (g/l) Tempo (horas) Figura 1. Cinética da hidrólise enzimática de B. brizantha pré-tratada em reação contendo 10% de sólido e 30 FPU/g de material seco. Para avaliar se há aumento gradativo da recalcitrância do material no decorrer da hidrólise enzimática, após as primeiras 8 horas de reação, a hidrólise foi interrompida e a fração sólida residual submetida à nova hidrólise. Foram realizadas três hidrólises sucessivas e os resultados estão apresentados na Figura 2. As duas primeiras hidrólises apresentam curvas sobrepostas, indicando que a celulose remanescente após as primeiras 8 horas apresenta a mesma digestibilidade que a celulose presente no material no início da hidrólise. Após a segunda hidrólise, cerca de 64% do material já havia sido convertido em glicose. Ao final da terceira hidrólise, que gerou 20 g/l de glicose, 85% da celulose presente no material havia sido hidrolisada. Estes dados mostram que a celulose disponível na biomassa prétratada não oferece resistência gradativa à ação das enzimas celulolíticas. A sacarificação ocorre em 24h quando realizada em três etapas, enquanto que a hidrólise completa, em apenas uma etapa, ocorre em 72 horas, indicando a presença de fatores de inibição.

6 35 Concentração glicose (g/l) a. Hidrólise 2a. Hidrólise 3a. Hidrólise Tempo (h) Figura 2. Hidrólise enzimática de B. brizantha pré-tratada em três etapas sucessivas. O efeito inibitório do produto da hidrólise sobre a atividade do complexo celulolítico foi avaliado adicionando-se, ao início da hidrólise, crescentes concentrações de glicose. Os resultados estão apresentados na Figura 3. Pode-se observar que quanto maior a concentração inicial da glicose no meio reacional, menor a velocidade de reação e a quantidade de glicose gerada ao final de 8 horas. Quando a hidrólise iniciou-se em meio contendo 40 g/l de glicose, apenas 13 g/l de glicose são gerados, o que corresponde a apenas 43% da glicose gerada no processo sem a adição de açúcar. Os dados mostram que o complexo enzimático Cellic CTec2 é fortemente inibido na presença de glicose. Para que a produção de etanol a partir de material lignocelulósico seja viabilizada comercialmente, uma produção mínima de 50 g/l de etanol deve ser alcançada. Tal exigência, implica em hidrolisados com concentração mínima de 100 g/l de glicose. Com o emprego do extrato Cellic CTec2 estes teores, utilizando a forrageira B. brizantha pré-tratada submetida a tratamento ácido e alcalino, estão próximos de serem alcançados, porém em um tempo ainda longo. 35 Concentração glicose gerada (g/l) Sem adição 10g/L 20g/L 30g/L 40 g/l Tempo (h) Figura 3. Efeito da adição de glicose na hidrólise enzimática de biomassa pré-tratada.

7 Para tentar se alcançar a conversão da celulose em glicose em um tempo menor, o efeito da adição de crescentes cargas enzimáticas na hidrólise da forrageira B. brizantha foi avaliado e os resultados estão apresentados na Figura 4. O nível máximo de conversão da celulose foi de cerca de 94% em todos os casos. Entretanto, o tempo de reação para atingir essa conversão foi diferente quando se utilizou diferentes quantidades do complexo enzimático. Com o emprego de 30 FPU/g de material seco são necessárias 72 horas para a hidrólise (como já mostrado na Figura 1), com carga de 60 FPU/g de material seco em 56 horas a mesma conversão é atingida. Utilizando-se 120 e 240 FPU/ g de material seco, a conversão foi atingida em 48 horas. 100 Concentração glicose gerada g/l FPU/g material 60 FPU/g material 120 FPU/g material 240 FPU/g material Figura 4. Efeito da adição de diferentes cargas enzimáticas na sacarificação de B. brizantha pré-tratada. Fazendo o emprego de 120 FPU/g de material seco é possível alcançar o mesmo teor de glicose gerado por 30 FPU/g de material seco em um tempo 24 horas menor. Porém, esta carga enzimática é extremamente alta, cerca de quatro vezes a indicada pelo fabricante e dificilmente poderia ser viabilizada comercialmente. 4. CONCLUSÃO Tempo (h) Concluiu-se que a hidrólise, utilizando como catalisador o complexo enzimático Cellic CTec2, da forrageira B. brizantha submetida a pré-tratamento ácido e alcalino pode atingir 94% de sacarificação da celulose, gerando um meio reacional com 88g/L de glicose. A adição de cargas enzimáticas superiores a 30 FPU/g material seco refletem no aumento da velocidade de reação. Tal carga é limitada a 120 FPU/g material seco, acima deste limite a adição de enzima não exerce efeito sobre a velocidade de formação de glicose. A velocidade de hidrólise é negativamente afetada com crescentes concentrações de glicose no meio reacional. Tendo em vista a necessidade de um hidrolisado com concentração mínima de 100 g/l para a viabilização econômica, esforços devem ser investidos no

8 desenvolvimento de formulações enzimáticas que sejam tolerantes à altas concentrações do produto de hidrólise. 5. REFERÊNCIAS ADRIANO, W. S. Preparação e Caracterização de Derivados de Enzimas Industriais em Quitosana Tese (Doutorado em Engenharia Química) Universidade Federal de São Carlos. BHAT, M. K. Cellulases and related enzymes in biotechnology.biotechnology advances v, 18, n. 5, p , GAN, Q.; ALLEN, S. J.; TAYLOR, G. Kinetic dynamics in heterogeneous enzymatic hydrolysis of cellulose: an overview, an experimental study and mathematical modelling. Process Biochemistry, v. 38, p , GENENCOR, Development of enzyme solutions for the biomass to ethanol industry.disponível em < 2_enzymes_bjarne_adamsen.pdf> Acesso em 15/02/2011. GHOSE, T.K. Measurement of cellulase activities.pure and Applied Chemistry, v. 59, p , GOUVEIA, R.; NASCIMENTO, R. T.; SOUTO-MAIOR, A. M; ROCHA, G. J. M. Validação de metodologia para a caracterização química de bagaço de cana-de-açúcar. Química Nova, v. 32, n. 6, MAKI, M.; LEUNG, K. T.; QIN, W.The prospects of cellulase-producing bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass.international Journal of Biology Science, v. 5, p , NOVOZYMES.Cellic CTec2 and HTec2 - Enzymes for hydrolysis of lignocellulosic materialsdisponívelemhttp:// > Acesso em 15/02/2012. OGEDA, T. L.; PETRI, D. F. S. Hidrólise enzimática de biomassa. Química Nova, v. 33, n. 7, p , SINGHANIA, R. R.; SUKUMARAN, R. K.; PATEL, A. K.; LARROCHE, C. PANDEY, A. Advancement and comparative profiles in the production technologies using solid-state and submerged fermentation for microbial cellulases. Enzyme and Microbial Technology, v. 46, p , TAYLOR, G. Biofuels and the biorefinery concept.energy Policy. v. 36, p , TU, M, PAN, X., SADDLER, J. N. Adsorption of Cellulase on Cellulolytic Enzymr Lignin from Lodgepole Pine. Journal Agricultural and Food Chemical, v. 57, p , XIMENES, E.; KIMA, Y.; MOSIERA, N.; DIEND, B.; LADISCH, M. Inhibition of cellulases by phenols.enzyme and Microbial Technology, v. 46, p , 2010.