Isolamento e Purificação de Biomoléculas. CFBio 2014 Emanuel Carrilho Sala 104 Q1 Ramal
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1 Isolamento e Purificação de Biomoléculas CFBio 2014 Emanuel Carrilho emanuel@iqsc.usp.br Sala 104 Q1 Ramal
2 Introdução à Separações Analíticas Anal. Chem. 1987, 59, 1109A
3 Introdução à Separações Analíticas Anal. Chem. 1987, 59, 1109A
4 Métodos de extração e preparo de amostra Métodos Físicos Extração com Fluido Supercrítico (SFE) Extração em Fase Sólida (SPE) Microextração em Fase Sólida (SPME)
5 1 Métodos baseados em equilíbrio* de fases GL GS LL SL *equilíbrio constante Destilação Adsorção Extração LL Cromatografia Sublimação Cromato- GL grafia LL Partição Precipitação Adsorção
6 2 Métodos de extração Extração: Processo preliminar de separação, com objetivo de isolar componentes de interesse de uma matriz complexa. Amostra gás líquido sólido Agentes Extrativos gás líquido sólido
7 2 Métodos de extração Extração: Processo preliminar de separação, com objetivo de isolar componentes de interesse de uma matriz complexa. Amostra Agentes Extrativos gás líquido sólido gás líquido sólido voláteis (arraste a vapor) extração líquido-sólido adsorção/desorção
8 2 Métodos de extração Extração: Processo preliminar de separação, com objetivo de isolar componentes de interesse de uma matriz complexa. Amostra Agentes Extrativos gás líquido sólido gás líquido sólido voláteis (arraste a vapor) extração líquido-sólido adsorção/desorção
9 2 Métodos de extração Extração: Processo preliminar de separação, com objetivo de isolar componentes de interesse de uma matriz complexa. Amostra Agentes Extrativos gás líquido sólido gás líquido sólido voláteis (arraste a vapor) extração líquido-sólido adsorção/desorção
10 Extração Líquido-Líquido: Partição* *"semelhante dissolve semelhante" Suponha que um soluto S é particionado entre duas fases imiscíveis 1 e 2. [S] 2 [S] 1 O coeficiente de distribuição, K D será a constante de equilíbrio para a reação): S (na fase 1) S (na fase 2) K D = a S 2!! a S1 [ S ] 2 [ S] 1
11 Extração Líquido-Líquido (ELL) K D = C C 2 1 fase superior fase inferior Exemplo: Separação de ácidos graxos de sabão K D = C C éter H 2 O S S H2O Ác. Graxos H2O sabão > S < S éter sabão éter Ác. Graxos KD >>1 p/ ácidos graxos e K D << 1 p/ sabão
12 Extrações Sucessivas Para KD >> 1 (~1000), uma extração é suficiente! Se 2 < KD < 10 extrações sucessivas Extrações com alíquotas de menor volume e um maior número de alíquotas! Exemplo: extração de 4,0 g de ác. butírico de 500 ml de H 2 O com 500 ml de éter (K D = 3) Para 1 extração: K D = C éter( g L)!! C H2 O (g L) = 3,0 = (4,0 x) 0,5 x 0,5 x = 1,0 m éter = 3,0 x é a massa de soluto remanescente na solução 1
13 Para duas extrações com 250 ml cada: K D = C éter (g L) C H2 O (g L) = 3,0 = (4,0 x ) 0,25 1 x 1 0,5 x 1 = 1,6g 1!! m éter = 2,4g K D = C éter( g L) C H2 O (g L) = 3,0 = (1,6 x 2) 0,25 x 2 0,5 x 2 = 0,64g 2!! m éter = 0,96g Após 2 extrações: m éter = 3,36 g Para 5 extrações com 100 ml cada: m éter = 3,77 g
14 Suponha que o soluto S em V 1 ml de solvente 1 é extraído com V 2 ml de solvente 2. Se m for o n o total de moles no sistema, q será a fração remanescente na fase 1 e (1-q) a fração transferida para a fase 2. K = S D!! S [ ] 2 = (1 q)m V 2 [ ] 1 qm V 1 Qual será a fração remanescente (q) na fase 1 depois de uma extração? q =!! V 1 V 1 + K D V 2 E após duas, três,... n?
15 Φ 2 =!q q =!! Φ n =!q n =!! $ V 1 ' & ) % V 1 + K D V 2 ( # V 1 & % ( $ V 1 + K D V 2 ' n Φ n n o extrações
16 Extração Líquido-Líquido Contínua J Instrumentação barata J Muito simples; Não requer treinamento L Grande volume ( ml de solvente (problemas com descarte) L Moroso (12-48 h) L Concentração da amostra (perda de voláteis)
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18 Extração Líquido-Sólido (ELS) Objetivo: Extração de compostos orgânicos solúveis de uma matriz sólida (solo, alimentos, fibras) Exemplos: - hidrocarbonetos de carvão mineral - alcalóides de plantas - resíduo de pesticidas/fármacos em alimentos Métodos: Agitação mecânica Ultrassom Soxhlet Extração com FSC não muito eficiente; grandes volumes de solvente; relativamente rápido (< 1h) comum em extração de pesticidas em solos
19 Soxhlet J Eficiente e exaustiva J Extração relativamente fria - análise de voláteis & termolábeis L Volume fixo de solvente (grande) L Muito demorado ( h)
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21 Separação Multi-Componente Para haver separação entre dois componentes, i e j, os respectivos coeficientes de partição, K i e K j devem ser diferentes. K i K j cada analito ficará preferencialmente em uma fase
22 3 Cromatografia
23 Definições Coluna (recipiente) empacotada/recheada/preenchida tubo aberto - capilar Fase móvel (solvente 1) eluente eluido Fase estacionária (solvente 2) suporte sólido filme líquido Soluto (analito)
24 Adsorção Tipos de Cromatografia
25 Partição Tipos de Cromatografia
26 Troca iônica Tipos de Cromatografia
27 Tipos de Cromatografia Exclusão molecular
28 Afinidade Tipos de Cromatografia
29 Tipos de Cromatografia Interações hidrofóbicas
30 Funcionamento Básico K = a S 2 a S1 K = C S!! C M [ S ] 2 [ S] 1 = concentração!soluto!fase!estacionária concentração!soluto!fase!móvel
31 Funcionamento Básico Fase Móvel t s 1 2 t m 3 t s Fase Estácionária É necessário identificar a fração do tempo que o soluto gasta na fase móvel. Para tal é necessário identificar a fração molar dessas moléculas na fase móvel
32 Fração do tempo gasto na fase móvel = n o moléculas na fase móvel n o total de moléculas Φ tm = C m V m C m V m + C s V s,!dividindo!se!por!c m V m!e lembrando!que!!k = C s Cm k = K V s Φ!! Vm tm = 1 1+ k k = fator de retenção 1 1+ K V s Vm
33 Amostra Volátil Não Volátil CGS CGL Solúvel Não Solúvel Orgânico Não Orgânico X PM Iônico Não Iônico CLS/CLL CEM PM CTI PM PM CLL CEM
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