12 Cromatografia em Camada Delgada
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- Rosângela Oliveira Belo
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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Instituto de Química ARARAQUARA / SP 12 Cromatografia em Camada Delgada Franco Zavarizi Luiz Joaquim de Alencar Júnior Caroline Varella Rodrigues Natália Gaspar Alves Thiago Luis Canozza Rocha Thiago dos Santos Luccas Prof. Dr. José Eduardo de Oliveira Prof. Dr. Leonardo Pezza Profª. Juliana Rodrigues
2 Cromatografia É um processo de separação e quantificação no qual os componentes da amostra são arrastados por uma fase móvel através de uma fase estacionária. Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais destes componentes, ou seja, os componentes da amostra têm diferentes velocidades ao passarem pela fase estacionária.
3 Métodos Cromatográficos CP: Cromatografia em Papel CCD: Cromatografia em Camada Delgada CGL: Cromatografia Gasosa Líquida CGS: Cromatografia Gasosa Sólida CSS: Cromatografia Supercrítica Sólida CSFL: Cromatografia Supercrítica da Fase Líquida CLL: Cromatografia Líquida Líquida CLS: Cromatografia Líquida Sólida CE: Cromatografia de Exclusão CLFL: Cromatografia Líquida de Fase Ligada CTI: Cromatografia por Troca Iônica CB: Cromatografia por Bioafinidade
4 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) A CCD consiste na separação dos componentes de uma mistura através de migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente (fase estacionária) retido sobre uma superfície plana (geralmente placas de vidro). Esse processo de separação está fundamentado, principalmente no fenômeno de adsorção. A CCD oferece vantagens como fácil compreensão e execução, separações em breve espaço de tempo, versatilidade e baixo custo.
5 O que é adsorção? Consiste em fenômenos físicos e/ou químicos que fazem com que uma substância acumule-se sobre a superfície de outra.
6 Os adsorventes mais utilizados na CCD 1- SÍLICA (SiO 2 ) A sílica é empregada na separação de compostos lipofílicos como aldeídos, cetonas, fenóis, ácidos graxos, aminoácidos, alcalóides, terpenóides e esteróides, usando o mecanismo de adsorção. Figura 1: estrutura da sílica
7 2- ALUMINA (Al 2 O 3 ) A alumina é geralmente empregada na separação de compostos lipofílicos e, pelo fato de poder ser preparada com características ácida, neutra e alcalina, é bastante útil na separação de substâncias que apresentam variações dessas características.
8 TÉCNICAS GERAIS DA CCD - PREPARAÇÃO DAS PLACAS - ATIVAÇÃO DAS PLACAS - SELEÇÃO DA FASE MÓVEL - APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS NAS CROMATOPLACAS - REVELAÇÃO DOS CROMATOGRAMAS - APLICAÇÕES DA CCD - FATOR DE RETENÇÃO
9 Preparação das placas: Preparação por espalhamento: Existem diversas formas de se preparar uma placa cromatográfica, seja manualmente ou com emprego de espalhadores. Independente do método escolhido, a preparação sempre se inicia com a limpeza da placa de vidro utilizando detergente, solução sulfocrômica e água corrente. Quando não se dispõe de um aplicador, existem outras formas bastante simples de preparar a placa. Uma delas consiste em preparar a suspensão do adsorvente no solvente adequado e, mantendo-se a placa de vidro na posição horizontal transferir a suspensão para a superfície da placa, espalhando-se de maneira uniforme. Repousa-se a placa em superfície horizontal e deixa-se secar ao ar. A dificuldade encontrada nesse processo é a obtenção de superfícies uniformes.
10 Quando se pretende preparar placas bem uniformes e com espessuras definidas, é necessário o uso de espalhadores. Eles são encontrados no mercado em tipos e marcas diferentes. Seu funcionamento consiste em manter as placas fixas em um suporte e, sobre elas, fazer deslizar um recipiente contendo a suspensão do adsorvente. Enquanto o recipiente desliza, deixa escoar a suspensão, através de uma fenda regulável existente ao longo de sua base.
11 Figura 2: Vista expandida do espalhador mostrando sua seqüência de montagem. Figura 3: Vista em perspectiva.
12 Placas pré-fabricadas: Placas cromatográficas pré-fabricadas, dos adsorventes mais utilizados, estão disponíveis no mercado há algum tempo. Apesar de terem custo bem mais elevado, dispensam a fase de preparação e são bem mais uniformes e homogêneas, o que melhora a separação. A camada de adsorvente está depositada sobre uma lâmina de material plástico, alumínio ou vidro. São pré-cortadas, geralmente nos tamanhos 5 x 20 cm e 20 x 20 cm, e com a espessura da camada de adsorvente variando entre 0,1 a 2,0 mm.
13 Ativação das placas: A ativação consiste em aquecer as placas em temperaturas relativamente elevadas, por tempo prolongado. Isto aumenta o seu poder de adsorção. Este processo promove a remoção de vapor d água e outros resíduos possivelmente adsorvidos na placa. Sílica e alumina são ativadas a ºC por 30 a 60 minutos. O tempo e a temperatura são fatores importante nesse processo, dependem do adsorvente utilizado.
14 Seleção da fase móvel: Na escolha da fase móvel, considera-se a natureza química das substâncias e a polaridade da fase móvel, tomando-se como base a série eulotrópica do solventes, que são ordenados segundo suas polaridades, que estão relacionadas com seu poder de eluição. Pequenas variações na composição da fase móvel levam a grandes alterações no deslocamento das manchas. Colocando-se manchas da amostra sobre uma cromatoplaca e gotejando sobre cada umas delas diferentes solventes, observa-se deslocamentos concêntricos das substâncias, obtendo assim informações da capacidade de deslocamento de diferentes solventes, dando uma idéia do poder eluente da fase móvel.
15 Figura 4: Aplicação da amostra na cromatoplaca.
16 Aplicação das amostras nas cromatoplacas: As amostras são aplicadas nas cromatoplacas na forma de soluções, em solventes bastante voláteis, que possam ser facilmente eliminados após a aplicação. Deve-se levar em conta o limite de detecção do revelador, pois se ele não detectar a amostra deve-se aumentar sua concentração na placa. Não devem ser utilizadas soluções muito diluídas pois exigem a aplicação de um volume muito grande de amostra. Para a aplicação da amostra utilizam-se micropipetas ou microsseringas que permitem determinar a quantidade de substância colocada na placa. Quando não exige-se a quantidade precisa de amostra a ser colocada, utilizam-se capilares de vidro, ou aplicadores automáticos. As gotas devem ser aplicadas 1,5 a 2,0 cm acima da borda inferior para que não fiquem mergulhadas na fase móvel quando a placa for colocada na cuba. A distância entre cada gota é de aproximadamente 1,0 cm para que se evite o contato entre as gotas.
17 Figura 5: Aplicação da amostra na cromatoplaca.
18 Cuba Cromatográfica: Em seguida, a placa é introduzida cuidadosamente em uma cuba fechada contendo o solvendo indicado, com a extremidade voltada para baixo. O nível do solvente deverá ficar abaixo dos pontos de aplicação das amostras. Durante a ascensão do solvente o sistema fica fechado para que a atmosfera esteja saturada pelo vapor do solvente. Facilita-se a saturação colocando-se um pedaço de papel de filtro na parede interna da cuba. A cromatoplaca deverá ser retirada da cuba somente quando o solvente atingir um limite pré-determinado na parte superior da placa (cerca de 1 cm).
19 Figura 6: Aplicação da amostra na cromatoplaca. Figura 7: Cuba Cromatográfica
20 Figura 8: aplicação da amostra e saturação na cuba cromatográfica. Figura 9: evolução da mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente.
21 Revelação dos cromatogramas: Essa etapa consiste em tornar visíveis as substâncias incolores presentes na amostra. A visualização pode ser feita por meio de métodos físicos ou químicos, podendo também ser biológicos, como no caso da utilização de reações enzimáticas ou bacterianas. Reveladores físicos e não-destrutivos: podem ser visualizados através de luz ultravioleta, por se tornarem fluorescentes quando excitados por essas radiações. Quando as substâncias não são fluorescentes, podem-se utilizar adsorventes impregnados com reagentes fluorescentes. Reveladores químicos: os métodos químicos de revelação são destrutivos e aplicáveis a separações analíticas. Utiliza-se agentes cromogênicos que, em contato com as substâncias da amostra, tornam-nas coloridas e, portanto, visíveis. O mais utilizado é o iodo, que torna as manchas marrons.
22 Figura 10: revelador para Radiação ultravioleta para compostos fluorescentes. Ex: clorofila.
23 Figura 11: Para a maior parte dos compostos orgânicos é muito utilizado a exposição da cromatoplaca aos vapores de iodo, em recipiente fechado Figura 12: aplicadores de vidro para reveladores químicos.
24 Reveladores biológicos: Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para tornar a mancha visível. Ex.: Para testar-se uma amostra que contém substância antifúngica revela-se o cromatograma com esporos de fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas substâncias.
25 Figura 13: A placa foi borrifada com solução de esporos de fungos. Onde apareceram manchas brancas houve inibição dos fungos pelas substâncias contidas nos extratos de uma planta.
26 Aplicações da CCD: A CCD pode ser usada em Química Orgânica para: - Estabelecer a identidade de dois compostos; - Determinar o número de compostos de uma mistura; - Determinar o solvente apropriado para uma separação por cromatografia em coluna; - Monitorar uma separação realizada por cromatografia em coluna; - Checar a eficiência de uma separação.
27 Fator de Retenção (R.f.) Sob condições bem estabelecidas, um dado composto percorre sempre uma distância fixa em relação à distância percorrida pelo solvente. Esta relação é chamada valor do Rf. Quando os parâmetros experimentais são especificados, o valor do Rf é uma constante, para um dado composto. E ele pode ser usado para auxiliar a identificação de uma substância. Muitos compostos têm o mesmo Rf, assim como diferentes compostos tem PF iguais. Comparações feitas do Rf obtido com o Rf de padrões é considerado um método qualitativo.
28 Distância percorrida pela mancha desde a origem ( x) R f = Distância percorrida pelo solvente desde a origem ( y) Figura 14: cálculo do R f para um componente de uma amostra
29 Análise Quantitativa A CCD pode ser utilizada para quantificação. Retira-se da cromatoplaca a área que contenha a substância desejada que é extraída e quantificada. Freqüentemente, utiliza-se a densitometria, medidas de fluorescência e radioatividade.
30 Vantagens da CCD Fácil execução; Maior rapidez; Menor trajeto da fase móvel ; Boa resolução; Manchas em geral menos difusas; Baixo custo; Versatilidade.
31 Desvantagens da CCD Difícil Reprodutibilidade: é muito difícil a confecção de duas placas idênticas, com a mesma quantidade de amostra, etc; Difícil determinação exata do Rf.
32 Tabela de constantes físicas e Toxicidade
33 CUIDADO! A aspiração da sílica causa silicose, um tipo de inflamação pulmonar crônica! A sílica deverá ser removida com espátula e colocada em béquer e deverá ser entregue ao técnico.
34 Descartes Alguns compostos que podem ser descartados diretamente na pia: Orgânicos: - Álcoois com menos de 5 carbonos etanol; - Ácidos carboxílicos com menos de 6 carbonos e seus sais de NH4 +, Na + e K + ; - Ésteres com menos de 5 carbonos. Alguns compostos que podem ser descartados no lixo: Para descarte (incineração/co-processamento): - solventes não halogenados, < 5% água; - solventes não halogenados, > 5% água; - solventes halogenados; - peróxidos orgânicos.
35 Fluxograma
36 Referência Bibliográfica BRAGA, G.L. Introdução a Métodos Cromatográficos. 6ª edição COLLINS, C.H.; BRAGA,G.L.; BONATO,P.S. Fundamentos de Cromatografia. São Paulo: da Unicamp, p.
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