Colunas SEC Agilent AdvanceBio para análise de agregados: Compatibilidade do instrumento

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1 Colunas SEC Agilent AdvanceBio para análise de agregados: Compatibilidade do instrumento Descrição técnica Introdução As colunas SEC Agilent AdvanceBio são uma nova família de colunas de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) empacotadas com partículas de,7 µm de uma fase estacionária exclusiva de sílica, de baixa ligação e revestida por polímero. Essa tecnologia oferece interações não específicas mínimas e fornece um formato do pico melhor para a análise de moléculas bioterapêuticas, como anticorpos monoclonais (mabs) e conjugados de medicamento de anticorpo (ADCs). Embora seja recomendável utilizar um sistema LC Agilent 16 Infinity Bio-inert com colunas SEC AdvanceBio, as partículas de,7 µm altamente uniformes oferecem excelente eficiência de coluna, proporcionando máxima recuperação de proteína com pressões de operação que permitem a operação em qualquer sistema HPLC. Isso inclui instrumentos obsoletos de bar até instrumentação de UHPLC de 1. bar. A SEC AdvanceBio de 3 Å foi projetada especificamente para análise de agregados de anticorpos monoclonais, proporcionando um desempenho ideal onde o importante é a resolução de monômero e dímero. A SEC AdvanceBio de 13 Å tem um volume de poro alto similar, mas abrange proteínas e polipeptídeos menores. A grande variedade de dimensões de coluna abrange todas as necessidades de aplicação: da convencional de 7,8 mm de DI até,6 mm de DI para maior sensibilidade ou onde a disponibilidade de amostra for restrita. Os comprimentos de coluna são de 3 cm para separações de alta resolução tradicionais e de 15 cm para maior velocidade, quando é preciso uma frequência analítica maior. Também estão disponíveis colunas de guarda de cinco centímetros.

2 Tipo de instrumento Instrumento de HPLC Agilent 11, ( bar) Quaternário Agilent 16 Infinity Bio-inert (6 bar) LC Binário Agilent 19 Infinity (1. bar) Cromatograma de exemplo Norm Norm Norm Figura 1. Exemplos ilustrativos de separações de proteínas utilizando diferentes instrumentos de HPLC (traço azul: mistura de padrão de proteína BioRad; traço vermelho: g-globulina). Observação: Estes eram lotes diferentes de proteínas usadas em laboratórios diferentes. Condições Parâmetro Valor Eluente Tampão de fosfato de sódio de 15 mm, ph 7, Vazão Temperatura Amostra Instrumento Comprimento de onda 1, ml/ (colunas de 7,8 mm) ou,35 ml/ (colunas de,6 mm) Ambiente Concentração de proteína de 1 mg/ml Instrumento de HPLC Agilent 11 (obsoleto, bar) Quaternário Agilent 16 Infinity Bio-inert (6 bar) LC Binário Agilent 19 Infinity com G1315D DAD e cela de fluxo biocompatível (1. bar) nm

3 Escolha do diâmetro de coluna certo A operação de colunas de diferentes diâmetros internos requer ajustes na vazão (para manter a mesma velocidade linear) e no volume da amostra. O fluxo de operação normal para colunas de 7,8 mm é de 1, ml/; portanto, o fluxo correto a ser usada para colunas de,6 mm é de,35 ml/. O volume de injeção deve ser reduzido em um valor semelhante para poder obter uma resposta do detector comparável; portanto, uma injeção de 6 µl em uma coluna de 7,8 mm é reduzida a µl para uma coluna de,6 mm. Pode haver pequenas diferenças no tempo de retenção observado devido ao volume da coluna extra no instrumento. Da mesma forma, a pressão resultante observada com um instrumento operado a 1, ml/ será um pouco maior do que a pressão resultante observada se o mesmo instrumento for operado a,35 ml/, particularmente quando forem utilizados capilares de baixo volume morto. A Figura mostra o mesmo lote de fase estacionária empacotado em colunas de 3 cm em dimensões de 7,8 mm e,6 mm e testado no mesmo instrumento quaternário Agilent 16 Infinity Bio-inert. Isso ilustra claramente como as colunas são similares em desempenho. A capacidade de usar volumes de injeção menores para colunas de,6 mm é ideal quando a disponibilidade de amostra é limitada, e é mais adequada à moderna instrumentação de baixo volume morto. Para aplicações que requerem o uso de detectores menos sensíveis, incluindo A Agilent AdvanceBio SEC 3Å 7,8 3 mm 1, ml/ detectores de espalhamento de luz, detectores de índice de refração ou detector UV de comprimentos de onda mais longos (ao usar eluentes de fase móvel que têm um background alto em comprimentos de onda menores, por exemplo), a coluna de 7,8 mm oferece a capacidade de injetar volumes de amostra muito maiores Agregados de tireoglobulina. Monômero de tireoglobulina 3. Dímero de g-globulina. Monômero de g-globulina 5. Dímero de ovoalbua 6. Ovoalbua 7. Mioglobina 8. Vitaa B B Agilent AdvanceBio SEC 3Å,6 3 mm,35 ml/ Figura. Comparação da separação de padrão de proteínas em colunas de 7,8 mm e,6 mm. 8 3

4 O uso de composições fortes de tampão para análise significa que há risco de precipitação ou corrosão (se íons cloreto estiverem presentes na fase móvel). Há também a possibilidade de crescimento bacteriano nos tampões aquosos que não contêm conservante. É essencial fazer manutenção preventiva regular e sempre enxaguar os instrumentos para que eles não fiquem armazenados no tampão. Tampões recém-preparados filtrados com um filtro de membrana de, µm são um pré-requisito para uma operação segura. Por essas razões, o instrumento escolhido é o sistema quaternário Agilent 16 Infinity Bio-Inert. Garantia de confiabilidade contínua O monitoramento do desempenho da coluna é uma parte importante de uma cromatografia por exclusão de tamanho robusta. Os tampões de fosfato são conhecidos por causar deterioração das fases estacionárias a base de sílica. As colunas SEC AdvanceBio têm uma camada polimérica hidrofílica proprietária para ajudar a imizar as interações não específicas. Elas são rotineiramente testadas para demonstrar a grande vida útil da coluna, mesmo em tampões de fosfato de sódio concentrado (Figuras 3 e ). A vida útil da coluna pode ser reduzida se ela for operada a temperaturas maiores ou vazões mais rápidas. Área do monômero % Injeção Rs 1,16 (após dias),16 (após dias) 8, (após 8 dias) 1.,19 (após 1 dias) Figura 3. Experimento de vida útil em uma coluna SEC Agilent AdvanceBio de 3 Å e 7,8 3 mm realizado com 1. injeções durante operação de 1 dias. Amostra alterada Injeção Monômero % Agreg. % Dímero % Injeção 1. Injeção 8 Injeção Número de injeções Área do dímero e agreg. % Figura. Alteração mínima na % da área de monômero/dímero durante o experimento de vida útil em uma coluna SEC Agilent AdvanceBio de 3 Å e 7,8 3 mm durante operação de 1 dias.

5 Garantir resultados consistentes de instrumento para instrumento e de laboratório para laboratório é essencial para uma transferência de métodos eficaz. Apenas com a utilização regular de uma mistura de padrão de proteína é possível deterar se fatores diferentes da coluna precisam ser otimizados. A Figura 5 exibe a excelente reprodutibilidade mostrada a partir de instrumentos estreitamente alinhados que estão operando corretamente. Padrões de proteína da SEC Agilent AdvanceBio de 13 Å Uma mistura de proteínas que consiste de cinco proteínas selecionadas cuidadosamente (Ovoalbua, Mioglobina, Aprotinina, Neurotensina e Angiotensina II) projetada para calibrar as colunas de exclusão de tamanho AdvanceBio de 13 Å da Agilent. Esse padrão pode ser usado regularmente para calibrar a coluna e garantir o desempenho ideal do sistema em várias aplicações envolvendo análise e purificação de proteínas. Padrões de proteína da SEC Agilent AdvanceBio de 3 Å Uma mistura de proteínas que consiste de cinco proteínas selecionadas cuidadosamente (Tiroglobulina, G-Globulina, Ovoalbua, Mioglobina e Angiotensina II) projetada para calibrar as colunas de exclusão de tamanho AdvanceBio de 3 Å da Agilent. Esse padrão pode ser usado regularmente para calibrar a coluna e garantir o desempenho ideal do sistema em várias aplicações envolvendo análise e purificação de proteínas Resposta A HPLC Agilent Série 11 B Quaternário Agilent 16 Infinity Bio Figura 5. Comparação de uma mistura de padrão de proteína executada em colunas SEC Agilent AdvanceBio de 3 Å e 7,8 3 mm utilizando um instrumento de HPLC Agilent Série 11 e um instrumento quaternário Agilent 16 Infinity Bio-inert. 6 7 Padrões de proteína da SEC Agilent AdvanceBio Descrição Tamanho Part number 13 Å Vials de 1,5 ml Å Vials de 1,5 ml

6 Com um mecanismo de separação isocrática, as explicações mais prováveis para as diferenças no tempo de retenção são imprecisão da vazão (talvez resultante de uma manutenção ruim da bomba ou desgaste geral) ou diferenças no volume morto extra coluna (mudanças no diâmetro ou comprimento capilar ou tamanho do loop da amostra). Isso é particularmente importante durante a transferência de métodos para instrumentos de LC de outros fornecedores (Figuras 6 e 7). AU,3,,,15,1,5 AU,5,,3,,1 A B SEC Agilent AdvanceBio de 3 Å,6 x 15 mm em Sistema Classe H Waters (,35 ml/) Nº Tempo Área % 1,8 1, 3,3 87,8 SEC Agilent AdvanceBio de 3 Å 7,8 x 3 mm em Sistema Waters Alliance (1, ml/) Nº Tempo Área % 1 6,39 1,5 7,63 87, Figura 6. Comparação da separação de γ-globulina utilizando dimensões de coluna diferentes e instrumentos diferentes. AU,7 3,6,5 1. Agregados. Dímero 3. Monômero (Área % = 86,6%). Fragmento de baixo peso molecular 5. Conservante,,3,, Figura 7. Quatro injeções replicadas de γ-globulina em um sistema HPLC Waters Alliance. 6

7 Controle de temperatura Um fator muitas vezes esquecido quando se detera a robustez do método é a temperatura de separação. Muitas vezes, as separações são realizadas à temperatura ambiente; no entanto, a temperatura normal em um ambiente particular pode depender da hora do dia e das variações das estações, bem como da influência do aquecimento ou do ar condicionado. Com separações aquosas, a pressão resultante vai variar visivelmente com a mudança de temperatura; de qualquer maneira, algumas proteínas também são afetadas. É esperada uma melhoria na resolução com o aumento da temperatura; no entanto, também pode haver uma mudança no nível de agregação (Figuras 8 e 9). Por essa razão, é altamente recomendável que as separações sejam realizadas com a coluna contida num forno controlado termostaticamente e que as amostras sejam mantidas em um ambiente com temperatura controlada. Conclusões As colunas SEC Agilent AdvanceBio foram desenvolvidas para proporcionar um desempenho ideal, independentemente do instrumento utilizado. Esta visão geral técnica destaca algumas das áreas que necessitam de consideração para atingir resultados comparáveis em instrumentos mais antigos de bar por meio de instrumentação moderna habilitada para UHPLC, independentemente da localização ou do operador ,,5 5, 5,5 6, 6,5 7, 7,5 8, 8,5 Figura 8. Efeito da temperatura de análise de γ-globulina. Área do monômero % C 167,5 bar Rs 1,8 Área do monômero % = 7,8 % C 1,6 bar Rs 1,8 Área do monômero % = 73,9 % Monômero % Agreg. % Dímero % 15 C C C 3 C 35 C C 5 C 5 C 55 C Número de injeções Figura 9. Efeito da temperatura de análise em conteúdo de monômero/dímero/agregado de γ-globulina Área do dímero e agreg. % 7

8 Estas informações estão sujeitas a alterações sem aviso prévio. Agilent Technologies, Inc., 16 Publicado nos Estados Unidos, 1 de janeiro de PTBR