determinação de proteínas

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1 Preparo de amostras visando a determinação de proteínas Marco Aurélio Zezzi Arruda gepam.iqm.unicam.br zezzi@iqm iqm.unicamp..unicamp.br

2 INTRODUÇÃO GENOMA seqüenciamento de bases do DNA (Genoma humano: 3 bilhões de bases e genes) Genoma: lista de peças de um carro - não explica como as peças funcionam juntas

3 INTRODUÇÃO PROTEOMA representação funcional do genoma Um genoma com diferentes proteomas Proteoma é um sistema dinâmico Proteínas papel crucial em processos biológicos: catálise, transmissão de sinais e apoio estrutural Determinar as proteínas expressas, suas composições, estruturas e funções

4 INTRODUÇÃO Nobel de química (2004) Irwin Rose (Univ( Univ.. Califórnia, EUA) Aaron Ciechanover e Avram Hershko (Instituto Technion, Haifa,, Israel) degradação de proteínas no corpo humano ubiquitina

5 INTRODUÇÃO O PREPARO DA AMOSTRA VISA 1) Solubilizar as proteínas de forma efetiva; 2) Evitar a agregação; 3) Remover os interferentes; 4) Elevar a concentração da proteína de interesse para possibilitar a sua determinação; 5) Evitar modificações químicas ph, temperatura, enzimas e armazenamento; 6) Purificar as proteínas det.. seqüências de aminoácidos, formação de cristais real unidade funcional

6 INTRODUÇÃO Diferentes estratégias no preparo de amostras visando a determinação de proteínas Salting out Diálise Extração mediada por surfactantes Cromatografia de filtração em gel Cromatografia de troca-iônica Cromatografia de afinidade HPLC Eletroforese em gel 1 D e 2 D Eletroforese capilar

7 Etapas básicas na extração/separação de proteínas Amostra Ruptura celular Solubilização Centrifugação Fracionamento Análise/Det Det.

8 Etapas básicas na extração/separação de proteínas Amostra Ruptura celular Solubilização Centrifugação Fracionamento Análise/Det Det.

9 Ruptura Celular A proteína têm de ser liberada da célula

10 APLICAÇÕES Evaluation of Protein Extraction Procedures in Phytotherapic Medicines Cristiana Schmidt de Magalhães, Lira Celeste Alves, Marco Aurélio Zezzi Arruda Amostras: Ginkgo bilobae Folhas de uma árvore (EFOA( EFOA); Extrato seco (China( China) Spirulina maxima Pó (China) Aesculus hippocastanum I. Capsulas,, lote e #333962,# Lab. Herbarium Pó (Alemanha) in natura (adquirida em mercado local AlfenasA lfenas) )

11 APLICAÇÕES Evaluation of Protein Extraction Procedures in Phytotherapic Medicines Cristiana Schmidt de Magalhães, Lira Celeste Alves, Marco Aurélio Zezzi Arruda 1 agitação centrifugação 0 o C 2 agitação diálise centrifugação 0 o C 3 centrifugação 0 o C 4 diálise centrifugação 0 o C 5 agitação centrifugação 0 o C 6 centrifugação 0 o C

12 APLICAÇÕES Determinação de proteínas totais (mg g -1 ): Bradford (n=3) Amost água água água água água água tampão tampão tampão Aesc. natura ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.101 Aesc. pó ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.101 Ginkgo ext. seco ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.101 Ginkgo folhas ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.015 Spirul. caps ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.405 Spirul. pó ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.405 pior resultado melhor resultado

13 Etapas básicas na extração/separação de proteínas Amostra Ruptura celular Solubilização Centrifugação Fracionamento Análise/Det Det.

14 Solubilização Adição de tampão (surfactantes, caotrópicos, redutores e inibidores) β-mercaptoetanol ou Ditiotreitol reduzir pontes dissulfídricas dricas e separaçã ção de cadeias polipeptídicas Temperatura

15 Calo de Citrus 75 mg APLICAÇÕES Verbi,, F. M. et al., JBBM, aceito 300 mg µl tampão* ph 6,8 0 o C 75 mg Agitação por efeito vortex 20 min Aplicação no gel 100 o C 10 min 8500 g *tampão: 60 µl L SDS, 30 µl L glicerol, 15 µl β-mercaptoetanol,, 8 µl bromofenol,, 38 µl tris-hcl HCl, (13000 rpm) 150 µl água 5 min

16 APLICAÇÕES Chan et al. Proteomics,, 2(2002)1169 Otimizaram as condiçõ ções de preparo para Prorocentrum triestinum (dinoflagelado) visando análise por eletroforese 2-D. 2 Parâmetros avaliados: rompimento celular, extraçã ção independente e seqüencial, encial, soluçõ ções solubilizantes e agentes redutores.

17 APLICAÇÕES Células de P. triestinum com tampão TRIS Homogeneização usando esferas de vidro Sonicação Extração Seqüenciada Tampão TRIS (1) Precipitado Tampão ( uréia, CHAPS, TRIS e inibidor) (2) Precipitado SOBRENADANTES Tampão (uréia, tiouréia, CHAPS, TRIS e inibidor) (3)

18 APLICAÇÕES Extrações independentes Tampão (1) Tampão (2) Tampão (3) Precip.. TCA/Acet Acet. Centrifugação SOBRENADANTES Centrifugação Precipitado Solubilização (uréia e CHAPS) SOBRENADANTES

19 APLICAÇÕES Células de P. triestinum com tampão TRIS Precipitado SOLUÇÕES SOLUBILIZANTES a) 9,5 mol/l de uréia b) 8 mol/l de uréia c) 5 mol/l de uréia + 2 mol/l de tiouréia d) 7 mol/l de uréia + 2 mol/l de tiouréia Ag.. redutores DTT, TBP (tributilfosfina( tributilfosfina) ) e TCEP (triscarboxietilfosfina( triscarboxietilfosfina)

20 APLICAÇÕES RUPTURA CELULAR sonicaçã ção 10x mais eficiente mais fácil f de ser executada EXTRAÇÃ ÇÃO Seqüenciada enciada spots. Independente spots (TRIS) SOLUÇÃ ÇÃO O SOLUBILIZANTE 8 mol/l de uréia; tiouréia ia - apresentou spots artificiais. AGENTE REDUTOR - TCEP

21 APLICAÇÕES O procedimento otimizado foi usado em amostras cultivadas em diferentes condiçõ ções. Foi possível observar diferenças na expressão protéica. COMENTÁRIOS Trabalho amplo avaliaram vários v parâmetros; Conseguiram estimar a eficiência de cada procedimento.

22 Etapas básicas na extração/separação de proteínas Amostra Ruptura celular Solubilização Centrifugação Fracionamento Análise/Det Det.

23 Centrifugação Coef.. de sedimentação s = m (1 - υρ)/f massa coef.. de atrito força de flutuação (exercida pelo meio líquido) Proteína Inibidor pancreático de tripsina Citocromo C Mioglobina Lactato desidrogenase S (unidades Svedberg) 1 sedimentação PM (kda( kda) 6,520 1,83 12,31 1,97 17,80 7,54 146,2

24 Etapas básicas na extração/separação de proteínas Amostra Ruptura celular Solubilização Centrifugação Fracionamento Análise/Det Det.

25 ELETROFORESE Fracionamento Técnica de separação custo reduzido; Suporte PAGE; Aplica-se um campo elétrico; 1-D IEF ou PM; 2-D IEF e PM. Preparo de Amostras Presença de interferentes que afetam a migração: - elevadas concentrações salinas; - adição de DTT.

26 Eletroforese 1-D1 Eletroforese SDS-PAGE SDS-proteínas (cargas negativas) migração o no sentido anódico (parte baixa do gel) Poliacrilamida (?): açãa ção o de peneiramento separação o conforme tamanho Boa sensibilidade: ca.. 2 pmoles υ = Ez/f υ = vel.. de migração E = intens.. do campo z = carga global da proteína f = coef.. de atrito

27 Eletroforese 2-D 1 a dimensão 1 a dimensão: Separa de acordo com o ponto isoelétrico. 2 a dimensão: Eletroforese - SDS Separa de acordo com o peso molecular. 2 a dimensão Eletroforese 2-D possui resolução para identificar milhares de spots de proteínas

28 Eletroforese 2-D

29 Eletroforese 2-D - Resultados

30 Fracionamento Extração mediada por surfactantes - Ponto Nuvem As moléculas de surfactante possuem duas regiões distintas: uma delas apolar e outra polar ou iônica. Cabeça Hidrofílica parte da molécula de natureza POLAR ou iônica. (esta região apresenta solubilidade significativa em água) neutro iônico catiônicos aniônicos anfóteros Cauda Hidrofóbica parte da molécula de natureza APOLAR (esta região não apresenta solubilidade em água)

31 Fracionamento Extração mediada por surfactantes - Ponto Nuvem Uma das características de todos os surfactantes éa capacidade de formar agregados em solução aquosa a partir de uma determinada concentração Estes agregados são denominados micelas Micelas: responsáveis pela solubilização de gorduras; interagem com substâncias hidrofóbicas A concentração onde inicia o processo de formação das micelas é chamada de concentração micelar crítica, cmc (sendo uma propriedade intrínseca de todos os surfactante)