Sistema Web para Projeto de PCR

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1 Sistema Web para Projeto de PCR Abstract. This paper describes a web system that help the work of molecular biologists, automatizating the steps necessary for preparing a PCR experiment. This system will search for genomic sequences in public databases, will do the design and analysis of primers that will be used in the reaction, will analyze the amplified product (considering restriction enzimes), and, at last step, will simulate the electrophoresis gel, showing the final result of the PCR. Resumo. Este artigo descreve um sistema web que auxilia o trabalho dos pesquisadores de ciências biológicas, automatizando as etapas necessárias para a realização de um experimento de PCR. O software fará a busca de seqüências genômicas em bancos de dados públicos, fará o projeto e análise de primers que serão usados na reação, a análise do produto amplificado (considerando enzimas de restrição) e, por fim, fará a simulação do gel de eletroforese, apresentando o resultado final da PCR. 1. Conceituação Teórica 1.1. Bancos de Dados Biológicos Públicos Com o aumento do número de pesquisas na área de bioinformática tornou-se indispensável a criação de bancos de dados para o armazenamento de informações relevantes sobre tal área. Esses bancos de dados possuem seqüências de DNA, RNA, proteínas, genes, ESTs (Expressed Sequence Tags), revistas e artigos de ciências biológicas e médicas, entre outras informações. Um dos principais trabalhos realizados na área de biologia molecular é o seqüenciamento de um trecho de DNA. Assim, para que os trechos seqüenciados fiquem disponíveis ao mundo todo, foram criados bancos de dados biológicos públicos. Esses bancos de dados estão disponíveis em sites da internet e podem ser acessados por pesquisadores do mundo todo. Os sites mais conhecidos são: o NCBI (National Center for Biotechnology Information), o GenBank e o Expasy. Uma das grandes vantagens da existência desses repositórios é a estruturação dos dados, que facilita o desenvolvimento de algoritmos para tratar os dados armazenados e evita que dados sejam armazenados duplicados Reação de PCR A PCR é uma técnica que possibilita a reprodução de milhares de cópias de um determinado fragmento de DNA. Através dessa técnica, uma seqüência particular de interesse pode ser amplificada (replicada), tornando-se majoritária na amostra de DNA, e assim a seqüência amplificada pode ser utilizada para outros fins (TRIUNFOL, 2003).

2 PCR é útil em diagnósticos para DNA para verificar a presença de um gene ou um estado mutacional de um gene específico, ou simplesmente na amplificação de um segmento específico (GRIFFITHS et al, 2002). Depois que uma seqüência é amplificada, ela pode ser utilizada em um experimento de eletroforese, por exemplo. Após a reação de PCR, normalmente a seqüência é analisada em outra ferramenta. O processo de PCR utiliza múltiplos ciclos de desnaturação, anelamento com primers e alongamento da seqüência por ação da polimerase (LIFE TECHNOLOGY, ca. 2000). Esses primers são pequenos fragmentos de DNA complementares a cada uma das extremidades da seqüência de DNA de interesse. A Figura 1 mostra uma representação da técnica de PCR. Figura 1. Reação em cadeia da polimerase PCR Fonte: Triunfol (2003) Há alguns tipos de reações de PCR com processos e finalidades diferentes. Entre eles, destacam-se no contexto deste trabalho: Nested PCR, Multiplex PCR, Universal Primers e Degenerate Primers (SINGH e KUMAR, 2003). Além dos tipos de PCR, existem parâmetros que afetam a eficiência da PCR, como a: temperatura de anelamento (Ta) e tempo de anelamento, temperatura de desnaturação (Tm) e tempo de desnaturação, concentração e seleção das enzimas de restrição, concentração e projeto de primer Primers Primer é uma pequena cadeia de DNA de fita simples, onde, a partir da posição 3, a enzima DNA polimerase iniciará a incorporação de nucleotídeos, formando a fita dupla do DNA. Os primers são produzidos in vivo ou in vitro. Na forma natural, os primers são produzidos por uma RNA polimerase especial chamada Primase (SILVA, 2001). Primers são utilizados para reações de PCR e para seqüenciamento. O projeto de primer é uma das mais importantes etapas para que se tenha uma reação de PCR bem sucedida (ALKAMI, 1999). Existem muitos pontos que devem considerados para se projetar um primer de boa qualidade. Os principais são: tamanho da seqüência do primer, temperatura de anelamento do primer, quantidade de nucleotídeos G e C no primer, potencial do primer para formar estruturas secundárias (primers que se anelam entre si ou se anelam a outros primers).

3 Existem várias ferramentas computacionais que projetam primers. Um exemplo de ferramenta disponível na internet é Web Primer (WEB PRIMER, 2003), e outra ferramenta, também gratuita, é Gene Runner. A ferramenta Web Primer provê primers para duas finalidades distintas: seqüenciamento ou PCR. A ferramenta Gene Runner para Windows está disponível para download gratuitamente em Gene Runner (2003). Essa ferramenta provê vários serviços. Para o projeto de primers essa ferramenta não é muito eficiente, pois não restringe os primers de acordo com os parâmetros de entrada Enzimas de Restrição Segundo De Robertis e Hib (2001), enzimas de restrição são enzimas que reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos nas moléculas de DNA, e promovem um corte nesses pontos. As enzimas atuam como tesouras, cortando o DNA. As enzimas não cortam aleatoriamente. Elas cortam em locais específicos (GRIFFITHS et al, 2002). Cada enzima reconhece um trecho específico de uma seqüência de DNA. As enzimas de restrição são utilizadas em reações de PCR, técnica de DNA recombinante e clonagem de genes. Geralmente, após a reação de PCR faz-se necessário comprovar se uma seqüência contém um determinado trecho ou não. Então a seqüência é submetida à ação de enzimas. Se for verificado através da eletroforese que o trecho foi cortado, então o trecho procurado está presente na seqüência. Mas se a seqüência continuar inteira, o trecho procurado não foi amplificado. Um exemplo de enzima de restrição muito utilizada é a enzima EcoRI. Ela reconhece a seqüência GAATTC. Essa seqüência é um palíndromo, porque a fita complementar a ela é CTTAAG, que é exatamente a mesma seqüência, mas em orientação antiparalela. Quando a enzima corta essa seqüência ela deixa duas pontas adesivas, que podem se unir a qualquer outra seqüência que foi cortada pela mesma enzima, como pode ser visto na Figura 2 (GRIFFITHS et al, 2002). Existem enzimas que fazem um corte preciso, não deixando as pontas adesivas. Figura 2. Sítio-Alvo da Enzima EcoRI Fonte: Biomania (2003)

4 A digestão de DNA por enzimas de restrição ocorre de forma simples. A enzima em contato com a seqüência, a uma temperatura ideal (em geral 370 ºC), corta a seqüência em trechos definidos. O número de trechos é estabelecido pelo número de sítios de restrição reconhecidos pela enzima (TRIUNFOL, 2003) Eletroforese Eletroforese é a técnica pela qual, fragmentos de DNA de diferentes tamanhos são separados por peso molecular. As seqüências de DNA são colocadas em um equipamento que contém canais preenchidos de gel, e elas percorrem esse gel, movidos por uma diferença de potencial elétrico. Se o peso molecular de uma seqüência é maior que o de outra, o primeiro percorre o gel mais lentamente que o segundo (TRIUNFOL, 2003). A Figura 3 mostra um gel de eletroforese. Nas colunas de 1 a 14 há poços contendo diferentes seqüências de DNA. Pode-se ver os tamanhos dos fragmentos separados no gel no lado esquerdo da Figura. Figura 3 Exemplo de gel de eletroforese Fonte: Threlfall et al (2003) Trechos de DNA, depois de amplificados por PCR, e possivelmente cortados por enzimas de restrição, podem ser separados pela eletroforese e comparados a outras seqüências, para verificar se duas seqüências possuem o mesmo gene, por exemplo. Existem softwares disponíveis na web que simulam a eletroforese. Um exemplo é o Gel Electrophoresis Simulator (COWAN, 2003), que pode ser visto na Figura 4. Ele tem a possibilidade de ter no máximo oito fragmentos de DNA e o gel utilizado é

5 agarose. O maior problema desse simulador é que ele não mostra o tempo de corrida dos fragmentos no gel. Mas podem ser alterados o potencial de eletricidade e a concentração do gel de agarose. Figura 4. Tela do software Gel Electrophoresis Simulator Fonte: Cowan (2003) Outra ferramenta disponível na web é Simulation of Electrophoresis & Sequence Building of DNA (CRAIG, 2003). A tela desse software pode ser vista na Figura 5. Figura 5. Tela do software Simulation of Electrophoresis & Sequence Building of DNA Fonte: Craig (2003)

6 1.6. Bioinformática A bioinformática é uma ferramenta recente e em pleno desenvolvimento. Imagina-se que será a nova ciência do século XXI, e seus primeiros resultados já são visíveis, como a identificação de genes para inúmeras doenças, como o câncer de mama. A bioinformática é uma nova ferramenta científica que une a bioquímica com a informática. Criada nas últimas décadas para tratar a imensa massa de dados que vem sendo gerada pelos vários projetos de genoma ao redor do mundo, a bioinformática permite explorar informações nunca antes disponíveis, e pode gerar resultados nunca antes imaginados. A bioinformática inicia logo após o seqüenciamento de DNA. Com essa etapa concluída, a bioinformática é utilizada para extrair informações importantes a respeito das seqüências, fazer novas descobertas, como, por exemplo, quais trechos de DNA correspondem aos genes. A bioinformática poderá num futuro breve auxiliar na produção de fármacos com base na estrutura das proteínas. A bioinformática pode simular situações para minimizar custos e tempo, que é caso da simulação da eletroforese. 2. Descrição do Problema O projeto de PCR inclui basicamente quatro etapas: a busca de seqüências de interesse, o projeto e a análise de primers, a análise do produto amplificado, e a revelação do gel de eletroforese. Neste trabalho, são executadas as etapas acima, para que minimize os esforços do pesquisador. O sistema proposto serve para auxiliar biólogos e outros profissionais. Atualmente, o pesquisador precisa procurar pelas seqüências a serem amplificadas em sites como o NCBI; depois ele precisa usar ferramentas para projetar primers, o que é geralmente trabalhoso e demorado; então ele deve fazer um alinhamento local para saber se o primer é específico para a seqüência que ele quer; depois ele faz uma análise com as enzimas de restrição em outra ferramenta/site; e finalmente, vai ao laboratório aplicar sua amostra à eletroforese para verificar se algo foi amplificado. As etapas podem ser ainda mais trabalhosas se o mesmo primer for projetado para alinhar em mais de uma seqüência. 3. Desenvolvimento da Pesquisa Cada uma das fases do projeto permite a intervenção do pesquisador para melhor ajuste. Para cada fase são necessárias uma ou mais telas para a entrada de parâmetros e a saída dos resultados. O usuário pode escolher uma opção entre as que o sistema permite: Projeto de PCR (completo), Análise de Primers (análise de características de primers prontos definidos pelo usuário), Análise do Produto Amplificado (análise com enzimas de restrição para uma seqüência fornecida pelo usuário) e Simulação de Eletroforese (apenas simula a eletroforese de seqüência(s) fornecida(s) pelo usuário).

7 3.1. Fase 1 Busca de seqüências Esta etapa permite ao pesquisador digitar parâmetros de busca de seqüências no sistema. Assim, automaticamente, o sistema procura no site do NCBI as seqüências encontradas e monta uma página dinâmica com os resultados. O sistema permite ao pesquisador especificar a(s) seqüência(s) de interesse, ou realizar automaticamente uma busca em banco de dados públicos com base em palavras-chave especificadas pelo pesquisador. Também permite especificar quais seqüências deseja-se anelamento dos primers, e para quais os primers não devem se anelar. Para isso há ferramentas de alinhamento múltiplo e árvores filogenéticas que permitem que seja feita uma análise das seqüências para determinar em quais seqüências o primer deve anelar. Como a busca resultará em seqüências que não farão parte da análise de primers, há a opção, para cada seqüência, do pesquisador especificar se a seqüência será considerada na análise ou não. Para a busca são usadas classes do BioPerl (bibliotecas implementadas em Perl que tratam de assuntos biológicos, seqüências de DNA,...) que permitem a busca de seqüências, e um estudo aprofundado para montar uma string de pesquisa eficiente para que não haja muitos resultados indesejados. Há a opção do pesquisador guardar em banco de dados as seqüências que ele pesquisou, visualizar a árvore filogenética e o alinhamento múltiplo (essas duas últimas opções são feitas através de ferramentas já disponíveis na internet) Fase 2 Projeto e Análise de Primers Esta etapa é feita com base nas seqüências escolhidas e em parâmetros de primers especificados pelo pesquisador. O sistema projeta primers mais adequados à reação de PCR, sendo esta etapa o enfoque deste trabalho. A análise das características dos primers encontrados permite apresentar ao pesquisador uma relação ordenada pela qualidade dos mesmos. Os primers selecionados também são testados quanto a sua especificidade, onde o sistema realiza automaticamente alinhamento par-a-par com outras seqüências em banco de dados públicos. Através de uma tela de parâmetros de entrada, o usuário define qual o tipo de PCR e quais as características desejadas. Existem vários tipos de PCR e várias características diferentes. Com esses valores, são projetados primers específicos de acordo com as características. As regiões para fazer primers são pontuadas e mostradas em ordem decrescente de pontuação, para que o pesquisador possa escolher as melhores regiões para projetar primers. Este tipo de análise diminui o trabalho do pesquisador, por que o sistema já deixa definido quais as melhores e piores regiões. Após terem sido definidas as regiões para os primers, o sistema gera os primers, e mostra características de cada um. A etapa de gerar os primers é exaustiva: primeiramente projeta-se primers de menor tamanho possível (dentro dos limites estabelecidos pelo usuário) que se anelem a seqüência. Depois, para cada um dos primers gerados, verifica-se se está dentro dos outros limites estabelecidos pelo usuário, como temperatura de anelamento. Para cada primer gerado há uma pontuação específica. A pontuação difere pelo tipo de reação de PCR escolhida. Para alguns tipos

8 de PCR, não importa de o primer forma estruturas secundárias, mas para outros tipos de PCR, este parâmetro é de fundamental importância. Nesta mesma etapa, é feito um alinhamento par-a-par (com a ferramenta Blast (BLAST, 2003)) de cada um dos primers escolhidos pelo usuário com o banco de dados público. Isso faz a análise de especificidade de primer, para que o mesmo primer não se anele em outras seqüências do banco. Se o pesquisador quer um primer para verificar se um indivíduo possui um determinado gene de doença, esse mesmo primer não deve se anelar a seqüências que normalmente o individuo possui Fase 3 Análise do Produto Amplificado Esta etapa permite ao pesquisador obter características do amplicon (trecho da seqüência que foi amplificada) e aplicar a ação das enzimas de restrição, obtendo também informações sobre as enzimas possíveis de serem usadas, os cortes e os pesos moleculares dos produtos resultantes. Com isso, o pesquisador pode estar mais certo da identidade do produto amplificado pela PCR. O pesquisador pode escolher quais as enzimas de restrição que devem fazer parte da análise. Geralmente, o pesquisador não dispõe de todas as enzimas existentes, então ele só seleciona as que ele tem acesso. Ele escolhe quais os parâmetros de entrada, como tamanho do amplicon, número mínimo e máximo de cortes, etc. O pesquisador também pode incluir no banco de dados do sistema enzimas que não estão cadastradas. Para esta etapa, são utilizados recursos da linguagem Perl para tratamento de strings. As características de cada enzima são obtidas na internet, em sites de dados biológicos Fase 4 Simulação do Gel de Eletroforese Por último, para poder identificar com sucesso o resultado da PCR com gel de eletroforese, o sistema permite ao pesquisador informar os parâmetros da mesma e prever a aparência do gel e a separação das bandas esperadas. A eletroforese é importante para comprovar se a seqüência foi amplificada pelo(s) primer(s) escolhido(s) e se a ação das enzimas escolhidas foi a esperada. Como o objetivo da reação de PCR é amplificar um trecho de seqüência, é importante comprovar os resultados. Se uma seqüência foi amplificada corretamente, e foi usada uma enzima de restrição correta, no momento da simulação da eletroforese, aparece bandas de tamanhos diferentes no gel. Outra grande vantagem da simulação é determinar quanto tempo a seqüência leva para percorrer o gel, qual é a melhor concentração do gel, qual o tipo de gel utilizado. Se o gel for simulado com alguns parâmetros, e não foi obtido o melhor resultado, é interessante alterar os parâmetros e verificar o resultado novamente. Quando os parâmetros estiverem corretos, pode-se efetuar o experimento em um laboratório. Para que esta etapa seja feita são utilizadas fórmulas que calculam o tempo, qual a melhor concentração do gel, o melhor tipo de gel, etc...

9 5. Conclusões O sistema está sendo feito em parceria com o Laboratório de Biologia Molecular da UNIVALI e o Laboratório de Virologia da UEL (Universidade Estadual de Londrina). Ele ficará pronto e disponível na internet até a metade do ano corrente. O sistema terá grande utilidade para biólogos e outros profissionais da área. Ele diminuirá o tempo de projetar primers, e diminuirá custos de experimentos. Para a etapa de análise do produto amplificado e a simulação do gel de eletroforese provavelmente não será dispensado muito tempo. Para a análise do produto amplificado é feito um trabalho de tratamento de strings, e para a simulação são usadas fórmulas de física. Provavelmente para as etapas de busca de seqüência e projeto de primers, maior tempo será consumido. Durante o desenvolvimento da etapa de busca de seqüências, problemas foram já observados, como falta de classes do BioPerl ou classes com poucas opções de busca de seqüências. A busca de seqüências e outras etapas talvez se tornem lentas. Então seria necessário fazer os algoritmos rodarem em maquinas paralelas. E a etapa de projeto de primers, que é o grande objetivo do sistema, deverá ter algoritmos rápidos, e talvez será necessário analisar outros critérios ainda a serem definidos. A pontuação dos primers é uma tarefa que exige muita dedicação, por que vários são os tipos de PCR. As classes do BioPerl são de difícil compreensão, e isso pode se tornar um problema de relevância. Referência Bibliográfica ALKAMI Biosystems. Alkami Quick Guide for PCR. 1. ed. United States of America: Guanabara Koogan, BIOMANIA. Disponível em: < Acesso em: 15 set BLAST. Disponível em: < Acesso em: 22 nov COWAN, John. Gel Electrophoresis Simulator. Disponível em: < Acesso em: 23 nov CRAIG, Paul. Simulation of Electrophoresis & Sequence Building of DNA. Disponível em: < Acesso em: 23 nov DE ROBERTIS, E. M. F., HIB, Jose. Bases da Biologia Molecular e Celular. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. GENE RUNNER for Windows. Disponível em: < Acesso em: 20 set GRIFFITHS, A. et al. Introdução a Genética. 7. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002.

10 LIFE TECHNOLOGY. PCR/RT-PCR Applications Guide. Induslab. [S.I. : s.n.], [ca. 2000] 29 p. SILVA, Flávio Henrique (Resp.). Módulo: Biologia Molecular. I Escola Brasileira de Inteligência Artificial e Bioinformática InBio - São Carlos: [s.n.], SINGH, Vinay K. e KUMAR, Anil. PCR Primer Design. Bioinformatics Sub-centre, School of Biotechnology, Devi Ahilya University, Índia. Disponível em: < Acesso em: 19 nov THRELFALL, E. John et al. Application of Pulsed-Field Gel Electrophoresis to an international Outbreak of Salmonella agona. Laboratory of Enteric Pathogens, Central Public Health Laboratory, London, United Kingdom. Abr-jun Disponível em: < Acesso em: 16 dez TRIUNFOL, Márcia L. O DNA vai à escola. Disponível em: < Acesso em: 24 out WEB PRIMER: DNA and Purpose Entry. Disponível em: < Acesso em: 14 nov