Noções Básicas de Seqüenciamento Genético. Maria do Carmo Debur LACEN/PR

Transcrição

1 Noções Básicas de Seqüenciamento Genético Maria do Carmo Debur LACEN/PR

2 Determinar a seqüência de nucleo3deos do DNA

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4 Métodos Clássicos 1976 Allan Maxam e Walter Gilbert (EUA) Método da Degradação Química (Tratamento com substâncias químicas que cortam a molécula de DNA em nucleo9deos específicos) 1977 F. Sanger e A.R. Coulson (Reino Unido) Método enzimáqco, dideóxi ou do término da cadeia (Síntese enzimá@ca de uma fita complementar, cujo crescimento é interrompido pela adição de um dideoxinucleo9deo)

5 Método de Sanger

6 Método de Sanger Animação

7 Seqüenciamento X PCR Sequenciamento: Amplificação linear Um primer dntps e ddntps PCR: Amplificação exponencial Dois primers dntps

8 Método de Sanger - MANUAL

9 GATTCGAGCTGddA GATTCGddA GddA +ddctp GATTCGAGddC GATTddC +ddgtp GATTCGAGCTddG GATTCGAddG GATTCddG ddg +ddttp GATTCGAGCddT GATddT GAddT

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11 Método de Sanger - AUTOMATIZADO

12 Método de Sanger - AUTOMATIZADO

13 Método de Sanger AUTOMATIZADO ELETROFORESE CAPILAR µm interno

14 Método de Sanger AUTOMATIZADO ELETROFORESE CAPILAR Os ácidos nucléicos migram para o ânodo, pois em ph neutro sua carga é nega@va

15 Método de Sanger AUTOMATIZADO ELETROFORESE CAPILAR A separação das fitas de DNA é dependente: Tempo de migração, Temperatura, Força iônica do tampão, Intensidade do campo elétrico, Viscosidade do meio.

16 Quais os passos necessários

17 SEQUENCIAMENTO O que seqüenciar? Produto de PCR Clone

18 PURIFICAÇÃO DNA

19 PURIFICAÇÃO DNA

20 QUANTIFICAÇÃO DO DNA

21 REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO Reagent es BigDye QuanQda de 8 µl Mix Primer 4 µl (3,2 Água pmol) q.s.p. 20 DNA µl 5 µl

22 REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO Reagent es BigDye QuanQda de 8 µl Mix Primer 4 µl (3,2 Água pmol) q.s.p. 20 DNA µl 5 µl

23 REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO TERMOCICLAGEM: Inicial: 96ºC 1 min ciclos Desnaturação: 96ºC 15 seg Anelamento: 50ºC 15 seg Extensão: 60ºC 4 min Final: 4-10ºC infinito Rampa: 1ºC/seg para facilitar o anelamento do primer

24 PURIFICAÇÃO DA REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO G A A G T C C T T G G C T A A C C C A C A Isopropanol 70% Etanol/EDTA/Acetato de sódio Kit BigDye X- Terminator

25 PURIFICAÇÃO DA REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO ATGCTTCT ATGCTTCTG ATGCTTCTGG G ATGCTTCTGGC G ATGCTTCTGGCA T C A ATGCTTCTGGCAG A ATGCTTCTGGCAGA T T C C C ATGCTTCTGGCAGAT G ATGCTTCTGGCAGATC G C ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCTG C T A ATGCTTCTGGCAGATCTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAA C ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC A ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA A ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT A Isopropanol 70% Etanol/EDTA/Acetato de sódio Kit BigDye X- Terminator

26 SEQUENCIAMENTO

27 Dado Bruto

28 Analisando o Cromatograma

29 O que fazer com estes dados????

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33 Para conhecimento...