Manual Técnico. quantificação de DNA humano em análises forenses. Para

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1 Kit Genomic de Quantificação de DNA Manual Técnico Para quantificação de DNA humano em análises forenses

2 1. Introdução Na maioria dos casos forenses, as amostras recebidas apresentam-se com alto grau de degradação, além de serem freqüentemente contaminadas com microorganismos. A metodologia empregada na extração dessas amostras não permite a distinção do DNA proveniente das células do material humano daquele oriundo dos contaminantes. O mesmo ocorre com o procedimento utilizado na quantificação do material extraído, que detecta ácido desoxirribonucléico, independentemente de sua origem. Devido a esses fatores, a qualidade do DNA humano e a quantidade do mesmo nas amostras forenses não podem ser aferidas com alto grau de precisão. O kit Genomic de Quantificação de DNA humano da baseia-se na utilização de PCR em tempo real para amplificar de forma específica, e no mesmo tubo, seqüências presentes nos cromossomos autossômico e Y humanos (Tabela 1). O kit também conta com um controle interno, constituído por uma seqüência de DNA sintético, com objetivo principal de analisar a presença de possíveis inibidores da reação presentes nas amostras forenses extraídas. Os três pares de primers sintetizados para os alvos descritos resultam em um sistema triplex. Tabela 1: 1 Alvos do kit de quantificação humana da Genomic. Alvo Gene Alvo Fluoróforo oro Tamanho Ploidia do amplicon Autossômico Retinoblastoma 1 FAM 110 pb Diplóide Cromossomo Y DAZ Texas Red 110 pb Haplóide IPC DNA sintético Cy5 110 pb

3 O kit é indicado para confirmar se a quantidade de DNA humano existente em uma dada amostra é viável para posterior utilização nos sistemas de identificação humana, tais como análises de STRs, SNPs e DIPs, e além disso, para indicar se a amostra possui inibidores para as análises citadas. Princípios do kit A química utilizada no sistema baseia-se na utilização de quenchers BHQ ligados covalentemente a um oligonucleotídeo genérico (antiprimer), capaz de parear com os primers fluorescentes de cada um dos alvos (Tabela 1) e inibir a fluorescência dos mesmos. A fluorescência aumenta à medida que os produtos são amplificados, possibilitando a captação do sinal pelo equipamento (Figura 1). Ciclo 1: Síntese da primeira fita do template. Ciclo 2: Síntese da fita complementar, incluindo a região contendo a sequência genérica. Diminuição da temperatura para ligação do antiprimer aos primers livres e captação da fluorescência das duplas-fitas geradas. Repetição por 40 ciclos. A captação da fluorescência aumenta à medida que os produtos são gerados. Figura 1: A cada final de ciclo, a temperatura da reação é diminuída para permitir a ligação do antiprimer aos oligonucleotídeos marcados livres. O antiprimer não é capaz de ligar aos produtos de PCR dupla-fita, permitindo com que a amplificação dos produtos com primers marcados com FAM ou Texas Red resulte em um aumento exponencial da fluorescência.. Figura retirada de Li, J. et al.,

4 O sistema mostra acurácia para soluções contendo concentrações de DNA acima de 32 pg/µl, onde a curva padrão mostra linearidade. 4

5 2. Composição do kit Componentes fornecidos Todos os reagentes necessários para a amplificação dos 3 alvos são fornecidos com o kit em uma série de 3 tubos (Tabela 2). Tabela 2: Componentes do kit e suas respectivas quantidades para 200 reações. Componente PCR Mix Primer Mix DNA genômico controle Descrição Quatro tubos contendo uma mistura de MgCl 2, desoxirribonucleotídeos trifosfatos e Taq DNA polimerase em solução tampão apropriada. Dois tubos contendo primers fluorescentes Foward e Reverse para amplificação dos 3 alvos, Antiprimer contendo o quencher BHQ-2 e a referência passiva Cy3. Um tubo contendo DNA genômico masculino a 50 ng/µl. Volume 1,25 ml/tubo 0,55 ml/tubo 50 µl/tubo 5

6 Armazenamento dos Componentes Os fluoróforos ligados aos primers são sensíveis à luz. Portanto, devem ser protegidos quando não estiverem em uso. Todos os componentes são entregues congelados. Após o primeiro descongelamento, armazená-los a temperatura de 2ºC a 8ºC. 6

7 3. Reação de PCR Preparo das diluições seriadas para a curva padrão Vortexar o DNA controle por 15 segundos antes de iniciar as diluições (Tabela 3). Tabela 3: 3 Diluições seriadas do DNA controle para composição da curva padrão. Volume Tubo do DNA Buffer TE Concentração Final 1 Não diluído ng/µl 2 8uL tubo 1 32 µl 10 ng/µl 3 8uL tubo 2 32 µl 2 ng/µl 4 8uL tubo 3 32 µl 0,4 ng/µl 5 8uL tubo 4 32 µl 0,08 ng/µl As diluições se mantém estáveis por até 2 semanas, desde que armazenadas a temperatura entre 2 a 8ºC. Preparo da Reação 1. Preparar todas as reações em duplicata e um volume de master mix 10% maior que o total requerido. Lembre-se de considerar os controles positivos e negativos (Tabela 4). Vortexar os tubos por 5 segundos antes de efetuar a mistura. 7

8 Tabela 4: 4 Volumes necessários para o preparo do master mix para uma reação. Componente Volume PCR Mix 23,0 µl Primer Mix 5,0 µl 2. Homogeinize a mistura gentilmente e dispense 28 µl em cada tubo. 3. Adicione 2 µl de Buffer TE aos tubos do controle negativo (NTC). 4. Adicione 2 µl das diluições seriadas (Tabela 5) ou 2 µl da amostra desconhecida individualmente em cada tubo. 5. Feche os tubos, centrifugue por 20 segundos a 3500 r.p.m. e coloque as reações em um equipamento de Real-time PCR. Protocolo para utilização do sistema Applied Real-time PCR Na tela inicial, clique em Advanced Setup. 8

9 2. Nomeie o experimento e mantenha as demais condições. 3. Clique em Plate Setup e Add new target para inserir os três alvos. Em seguida clique Add new samples para definir o número de amostras a serem quantificadas. 9

10 4. Na mesma tela, clique na aba Assign Targets and Samples. 5. Selecione os poços para o controle negativo e marque-os como NTC para os alvos autossômico e Y e desconhecido (U) para o IPC. 10

11 6. Clique em Define Set Up Standards e preencha os campos conforme abaixo. 7. Clique apply e close. 8. Selecione os poços referentes aos pontos da curva e marque-os como Standards para os alvos autossômico e Y e desconhecido para o IPC. Verifique se a concentração de cada ponto está corretamente indicada para os 2 alvos. 11

12 9. Selecione o número de poços referente às amostras e marque-as como desconhecido para os 3 alvos. Lembre-se se adicionar duplicatas para cada amostra. Selecione também Cy3 em Passive Reference. 12

13 11. Clique em Run Method e configure o ciclo conforme descrito abaixo. 13

14 12. Após salvar o método, clique em Run e depois Start Run. 14

15 4. Análise das reações 1. Em Analisys, clique em Amplification Plot e selecione os poços referentes aos pontos da curva. 2. Em options,selecione um dos alvos e marque o campo referente ao Threshould automático. O threshould também poderá ser modificado manualmente quando for conveniente. 3. Clique em Analyze. Os gráficos esperados para cada alvo são mostrados na figura 2. Autossômico Y IPC Figura 2: Gráficos esperados para as reações triplex feitas com os pontos da curva padrão. As linhas nos gráficos autossômico e Y representam, respectivamente, os pontos de 50 ng/µl, 10 ng/µl, 2 ng/µl, 0,4 ng/µl, 0,08 ng/µl e NTC. 15

16 4. Para ver a curva padrão, clique em Standard curve. Checar o coeficiente de regressão linear e a eficiência da reação. Os valores considerados satisfatórios são mostrados na tabela 5. Tabela 5: 5 Valores do coeficiente de regressão linear e eficiência da reação esperados para a curva padrão. Parâmetro Valores de referência Coeficiente de regressão linear (R 2 ) Acima de 0,990 Eficiência da reação Entre 80% e 110 % As curvas padrão esperadas para cada alvo são mostradas na figura 3. Autossômico Y R2= 0,999 Ef = 95% R2= 0,999 Ef = 94% Figura 3: Curvas padrão esperadas as reações triplex. Os pontos em vermelho referem-se, respectivamente, às concentrações de 50 ng/µl, 10 ng/µl, 2 ng/µl, 0,4 ng/µl, 0,08 ng/µl. 16

17 Acessando as concentrações das amostras quantificadas Em Amplification Plot, selecione a aba View Well Table. A planilha informará a quantidade de DNA detectada para cada alvo dentro de uma mesma amostra. As unidades serão as mesmas utilizadas para as amostras da curva padrão, ou seja, ng/µl. Interpretação do resultado de amplificação do controle interno. O uso do controle interno IPC é útil na determinação de falhas no equipamento ou de falhas humanas, bem como na indicação da presença de possíveis inibidores da reação de PCR. A kit Genomic de quantificação de DNA foi desenvolvido para que a amplificação do controle interno gere em condições padrão um Ct de aproximadamente 27. No entanto, uma variação no valor do 1,5 Ct acima ou abaixo dos pontos da curva poderão ser observados e deverão ser considerados normais. Além disso, amostras com concentrações maiores que 50 ng/µl podem gerar Ct mais alto do que os citados acima. As situações possíveis para o sistema são descritas na tabela 6. Tabela 6: 6 Interpretações com base na amplificação do controle interno da reação. Alvos Y ou Autossômico IPC Interpretação Sem amplificação Amplificação Resultado negativo- DNA humano não encontrado Sem amplificação Sem amplificação Resultado inválido Amplificação com baixo Ct e alto Rn Sem amplificação ou Ct alto (>29) Resultado do IPC inconclusivo Amplificação com alto Ct Sem amplificação ou Ct alto (>29) Presença de inibidores na reação 17

18 5. Validação do kit Para validação do kit, um total de 7 amostras extraídas pela GENOMIC foram quantificadas por espectrofotômetro e nanodrop. Outras 3 amostras foram adquiridas através do National Institute of Standards & Technology (NIST). As amostras e suas respectivas concentrações estão descritas na tabela 7. Tabela 7: 7 Amostras usadas como template nas reações de validação do kit. Nome Descrição Concentração Amostra 1 DNA masculino 0,1 ng/µl Amostra 2 DNA masculino 0,29 ng/µl Amostra 3 DNA de múltiplos homens 2 ng/µl e mulheres. Amostra 4 DNA masculino 2 ng/µl Amostra 5 DNA feminino 13,5 ng/µl Amostra 6 DNA masculino 16 ng/µl Amostra 7 DNA feminino 22 ng/µl Amostra NIST A DNA masculino de um 5 ng/µl único indivíduo. Amostra NIST B DNA de múltiplas 5 ng/µl mulheres. Amostra NIST C DNA de múltiplos homens e mulheres. 5 ng/µl As amostras foram usadas como template em reações de PCR em tempo real dos kits de Quantificação da Genomic, Quantifiler Duo DNA Quantification Kit (Applied Biosystems) e Investigator Quantiplex (Qiagen). Os resultados das quantificações apresentaram mesmo grau de magnitude em todos os casos testados (Tabela 8). 18

19 Tabela 8: 8 Quantificação de 10 amostras de concentrações conhecidas utilizando o kit de quantificação da Genomic e Quantifiler Duo DNA Quantification Kit (Applied Biosystems) e Investigator Quantiplex (Qiagen). Um volume de 2 µl de cada amostra foi usado nas reações em duplicata em todos os kits. 19

20 6. Efeito dos inibidores no sistema O efeito dos inibidores hematina e ácido húmico nas reações de quantificação foram observados através de reações contendo quantidades crescentes de cada inibidor. Os resultados mostraram que o Ct do controle interno aumenta à medida que a concentração de inibidor aumenta na reação. Além disso, o aumento do Ct para o controle interno é acompanhado pelo aumento do Ct dos alvos autossômico e Y (Figuras 4 e 5). A. Ct Hematina 0 µm 10µM 15µM 20µM 25µM 30µM 35µM Y Autossômico IPC B. Ct IPC - Hematina 0 µm 10µM 15µM 20µM 25µM 30µM 35µM 20

21 C. 1 Hematina DNA (ng/µl) 0,8 0,6 0,4 0,2 Y Autossômico 0 0µM 10µM 15µM 20µM 25µM 30µM Y 0,775 0,565 0,42 0,175 0,023 0 Autossômico 0,82 0,725 0, Figura 4: 4 Amostras de concentração 1 ng/µl de DNA genômico masculino humano foram geradas com diferentes concentrações do inibidor hematina. A) Cts observados para os alvos autossômico, Y e IPC. B) Variação do Ct para o alvo IPC. C) Quantificação obtida das amostras em cada situação de inibição. 21

22 A Ácido Húmico Ct ng/µl 5 ng/µl 10 ng/µl 15 ng/µl 20 ng/µl 25 ng/µl 30 ng/µl Y Autossômico IPC B. Ct IPC - Ácido Húmico 0 ng/µl 5 ng/µl 10 ng/µl 15 ng/µl 20 ng/µl 25 ng/µl 30 ng/µl C. 1,2 1 Ácido Húmico DNA (ng/µl) 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 ng/µl 5 ng/µl 10 ng/µl 15 ng/µl 20 ng/µl 25 ng/µl Y 0,988 0,643 0,378 0,233 0,019 0 Autossômico 1,038 0,419 0,258 0, Figura 5: Amostras de concentração 1ng/uL de DNA genômico masculino humano foram geradas com diferentes concentrações do inibidor ácido húmico. A) Cts observados para os alvos autossômico, Y e IPC. B) Variação do Ct para o alvo IPC. C) Quantificação obtida das amostras em cada situação de inibição. 22

23 7. Mistura de DNA masculino e feminino O comportamento do sistema foi avaliado em situações de misturas de DNA masculino e feminino. Uma quantidade fixa de 0,2 ng/µl de DNA masculino foi misturada a DNA feminino em diferentes proporções. Um volume de 2 µl de cada mistura foi usado para avaliar o limite de detecção do sistema para o alvo do cromossomo Y. As quantificações obtidas do DNA masculino ficaram dentro do esperado, mesmo em background 1000 vezes maior de DNA feminino. 100 DNA (ng/ul) ,1 0,01 Y Autossômico 1:0 1:1 1:2 1:5 1:10 1:20 1:50 1:100 1:500 1:1000 0:1 Proporção (DNA masculino:dna feminino) 23

24 8. Contato GENOMIC Engenharia Molecular Rua Itapeva, 500 Conjunto 5AB São Paulo- SP Responsável técnico: Dr. Martin Whittle Contato: 24