PCR em Tempo Real PCR Quantitativa (qpcr)

Transcrição

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE LABORATÓRIO DE VIROLOGIA PCR em Tempo Real PCR Quantitativa (qpcr) DOUTORANDA: TIANE MARTIN DE MOURA PPG MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO AMBIENTE 1

2 Histórico Descrita pela primeira vez em 1993 por Higuchi e seus colaboradores Acoplaram uma câmara de vídeo monitorando a PCR durante todos os ciclos para detectar a fluorescência Ligação do EtBr às moléculas de dsdna recém-sintetizadas 2

3 Princípios da PCR em Tempo Real Metodologia de PCR + Sistema de detecção de sinais fluorescentes Detecção, quantificação e amplificação de DNA em uma única etapa o Agilidade na obtenção de resultados Técnica quantitativa o Quantificação do número de moléculas produzidas a cada ciclo 3

4 Princípios da PCR em Tempo Real Etapas de amplificação de uma PCR convencional o o Temperaturas e tempos diferentes Curva de dissociação Coleta de dados o Fase exponencial da reação Reagentes de uma PCR convencional + Corante o o Intercalantes de DNA de dupla fita (dsdna) Oligonucleotídeos marcados Plataforma de instrumentação o o Termociclador + Sistema Óptico Computador com software para aquisição de dados e análise final 4

5 Vantagens PCR em Tempo Real Coleta de dados na fase exponencial SEM manipulação pós- PCR Resultados quantitativos Requer concentrações de DNA/cDNA 1000 x < Tempo de reação reduzido Maior reprodutibilidade, sensibilidade e precisão PCR convencional Coleta de dados na fase final da reação (plateau) Manipulação pós-pcr Preparação de gel de agarose - visualização Resultados qualitativos Requer concentrações maiores de DNA/cDNA Muito tempo para obter resultados 5

6 Aplicações Todas as aplicações da PCR tradicional Quantificação de carga viral Quantificação de expressão gênica Testes de eficiência terapêutica Detecção de agentes infecciosos Caracterização de agentes (Genotipagem) 6

7 Princípios da PCR em Tempo Real Curva de Amplificação Amplificação Exponencial 7

8 Fluorescência (Rn) Linear Princípios da PCR em Tempo Real Curva de Amplificação Gráfico de Amplificação A1 A2 Baseline background Exponencial Plateau NTC (no template control) 8

9 Fluorescência (delta Rn) Linear Princípios da PCR em Tempo Real Curva de Amplificação Gráfico de Amplificação A1 A2 Baseline Exponencial Ct 14,5 Ct 20,8 Threshold NTC 9

10 Fluorescência (delta Rn) Log Princípios da PCR em Tempo Real Curva de Amplificação Gráfico de Amplificação Exponencial Threshold 10

11 Princípios da PCR em Tempo Real Reagentes - Mix Master Mix Comerciais o Primers e DNA/cDNA Mix convencional 11

12 Princípios da PCR em Tempo Real Ciclagem Tempo estimado: 00:57:34 12

13 Princípios da PCR em Tempo Real Ciclagem Tempo estimado: 00:47:37 13

14 Princípios da PCR em Tempo Real Otimização Primers Desenho de primers (Produto de pb) Determinar a concentração ideal de uso Utilizar uma concentração fixa de DNA/cDNA Gradiente da concentração dos primers o 0,25 μm; 0,4 μm; 0,5 μm e 0,7 μm 14

15 Princípios da PCR em Tempo Real Otimização Primers Analisar a Curva de dissociação Melhor concentração dos primers Menor concentração de primers Máxima amplificação 15

16 Princípios da PCR em Tempo Real Validação Primers Determinar a concentração ideal de uso Utilizar uma concentração fixa de primers Gradiente da concentração de DNA/cDNA o 100 ng; 50 ng; 25 ng; 12,5 ng e 6,25 ng 16

17 Princípios da PCR em Tempo Real Validação Primers Analisar a Curva de dissociação Valores de slope e de R2 Eficiência Concentração ideal dos primers (Otimização) determinada e validada (Validação) Reações Padronizadas 17

18 Princípios da PCR em Tempo Real Sistemas de Detecção Detecção não-específica Fluoróforos ligando-se ao dsdna e emitindo fluorescência o SYBR-Green Detecção específica Oligonucleotídeos marcados com fluoróforos altamente específico a sequência alvo, emitindo fluorescência apenas na presença do produto de PCR de interesse o TaqMan 18

19 Princípios da PCR em Tempo Real Sistemas de Detecção Fluoróforos ou Fluorocromos Cada molécula apresenta um espectro de absorbância e emissão característicos SYBR-green Absorção máxima : 494 nm Emissão máxima : 521 nm 19

20 Princípios da PCR em Tempo Real Sistemas de Detecção TAMRA Absorção máxima : 555 nm Emissão máxima : 580 nm FAM Absorção máxima: 495 nm Emissão máxima : 521 nm TET Absorção máxima : 519 nm Emissão máxima : 539 nm HEX Absorção máxima : 537 nm Emissão máxima : 556 nm 20

21 Princípios da PCR em Tempo Real Sistemas de Detecção 21

22 Princípios da PCR em Tempo Real Sistemas de Detecção Intercalantes de dsdna green Detecta produtos inespecíficos dímeros de primers Fluoróforo disponível em suspensão Curva de dissociação Não permite multiplex 22

23 Princípios da PCR em Tempo Real Sistemas de Detecção O corante liga-se imediatamente a todos os dsdna Amplificação dos genes alvos O corante liga-se a cada nova cópia de dsdna alvo 23

24 Princípios da PCR em Tempo Real Sistemas de Detecção O corante liga-se a todos as moléculas de dsdna Quando o DNA é desnaturado, o corante dissocia-se Início da fase de anelamento de primers Polimerização é completada. O corante liga-se ao produto de dsdna e a fluorescência aumenta 24

25 Princípios da PCR em Tempo Real Sistemas de Detecção Oligonucleotídeos Marcados Detecta produtos específicos Permite Multiplex Não necessita curva de dissociação Sondas o Corante reporter 5 (fluorescente) e Corante quencher 3 (silenciador) 25

28 Máquinas Eppendorf Mastercycler ep realplex Corbett Rotor Gene 6000 Stratagene Mx series 28

29 Máquinas Bio-Rad Qiagen Rotor Gene Q Roche LigthCycler 29

30 Máquinas Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast/Step One/ Step One Plus 30

31 Máquinas Illumina Eco TM Real-Time PCR System 31

32 Eco Real-Time PCR System 32

33 Eco Real-Time PCR System 33

34 Ensaios Quantificação Absoluta Correlacionar o número de cópias virais vs. estado de uma doença DNA/RNA Quantificação Relativa Analisar alterações na expressão gênica em determinada amostra relativa à outra amostra de referência (controle não tratado) Transcrição - RNAm 34

35 Quantificação Absoluta Curva Padrão Método para determinar o número exato de moléculas (cópias de DNA ou ng de DNA) Determinar a concentração inicial de uma amostra de concentração desconhecida a partir de uma curva padrão de concentração conhecida o 100 ng; 50 ng; 25 ng; 12,5 ng e 6,25 ng 35

36 Quantificação Absoluta Curva Padrão Otimização e Validação dos primers Standard x Amostras Testes Amplificação Determinar a quantidade de alvo Parâmetros para conversão de concentração o ng/µl moléculas/µl 36

37 Quantificação Relativa Método da Curva Padrão o Exige menor quantidade de otimização e validação Método CT Comparativo o Semelhante ao método da CP, porém utiliza-se fórmulas aritméticas o Experimento de validação eficiência da amplificação do alvo e do controle deverão ser iguais o Aumenta rendimento (número de poços na placa) o Elimina erro de diluição das amostras 37

38 Quantificação Relativa Genes Alvo o Genes de interesse Genes Endógeno Referência o Gene de expressão estável sob diferentes situações testadas o Normalização de dados Correção das variações entre amostras 38

39 Quantificação Relativa Método CT Comparativo Método 2 -ΔΔCt Eficiência das amplificações % Software já calcula Comparação dos valores C T amostras/controle normalizados por genes endógenos ΔΔCT= ΔC T amostra - ΔC T referência 39

40 Quantificação Relativa Gene expression fold-change values derived from qpcr data. The changes in expression of four genes: glucose-6-phosphate isomerase (GPI); granulysin (GNLY); granzyme B (GZMB); and granzyme H (GZMH) in MCF-affected tissues were normalised to ribosomal protein S9 (RPS9) and plotted with respect to equivalent tissues from control animals. Results of kidney transcript assays are in the light columns while results of lymph node assays are in the dark columns Russell et al Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine herpesvirus 1. Virus Research v169, p

41 Bibliografia Creating Standard Curves with Genomic DNA or Plasmid DNA Templates for Use in Quantitative PCR EcoTM Real-Time PCR System User Guide Guide to Performing Relative Quantitation of Gene Expression Using Real-Time Quantitative PCR. Disponível em: _Guide_Relative_Quantification_using_realtime_PCR.pdf Acesso em 08 de abril de Higuchi R et al (1993). Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology Nature Publishing Company 11, Livak KJ, Schmittgen TD (2001). Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T) ) method. Methods 25, Oliveira TMS (2010). PCR em tempo real: métodos e aplicações. Dissertação de Mestrado. Universidade de Aveiro Russell et al (2012) Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine herpesvirus 1. Virus Research v169, p

42 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO AMBIENTE ANÁLISE TRANSCRICIONAL DO PATÓGENO Enterococcus faecalis VANCOMICINA RESISTENTE 42 DOUTORANDA: TIANE MARTIN DE MOURA (BOLSISTA CAPES) ORIENTADORA: PROFA. DRA. ANA PAULA GUEDES FRAZZON

43 Justificativa e Objetivos A espécie E. faecalis Comensal potencialmente patogênica Desenvolve estratégias para detectar, responder e se adaptar a ambientes hostis oportunista Relevância clínica infecções x tratamento o Verificar o comportamento de uma cepa EVR em ambiente simulado frente à vancomicina o Analisar a regulação in vitro de alguns genes relacionados a virulência o Avaliar o conjunto de transcritos gerados 43

44 In Vitro Evaluation of Biofilm Formation and Expression of Virulence-Related Genes in Vancomycin Resistant Enterococcus Faecalis Isolated from Urinary Tract Infection 44

45 Objetivo Avaliar a resposta apresentada por uma cepa de E. faecalis Vancomicina Resistente em um ambiente simulado acrescido de urina (simulação de ITU) frente à Vancomicina Expressão de genes relacionados a virulência 45

46 Fold Changes qpcr Resultados e Discussão tuf 20 0 bopa* bopc* vana* Expressão de genes de relacionados à virulência de VRE em caldo 2xYT/Urina tratados com vancomicina em comparação ao controle (sem vancomicina) (* p 0,05). 46

47 Conclusão A presença de vancomicina é capaz de estimular a regulação de genes importantes na formação de biofilme A vancomicina induz a auto-expressão do vana Administração de vancomicina pode estar contribuindo para o aumento da virulência em isolados clínicos portanto, é extremamente necessário ter cautela na prescrição deste antimicrobiano 47

48 Obrigada!