Transcritômica. João Carlos Setubal IQ/USP outubro de 2013

Transcrição

1 Transcritômica João Carlos Setubal IQ/USP outubro de 2013

2 Objetivo Obter, analisar, e interpretar dados de expressão gênica mrnas (que vão virar proteína) RNAs (que não vão virar proteína; ncrnas) O gene é expresso ou não? Abundância Não esquecer que níveis de expressão de mrnas nem sempre se correlacionam com níveis de expressão das proteínas correspondentes Condições de expressão

3 Expressão gênica Quase sempre estamos interessados na variação da expressão em diferentes condições (expressão diferencial) Exemplos Células normais (c 1 ) e cancerosas (c 2 ) de um determinado tecido (ex: fígado) Bactéria crescendo num meio de cultura X (c 1 ) versus meio de cultura Y (c 2 )

4 Duas metodologias básicas Hibridização (microarrays) Sequenciamento Expressed Sequence Tags (EST) RNA-seq

5 Microarrays Tecnologia bem estabelecida (20 anos ou mais) Depende de hibridização entre moléculas É necessário criar o chip com moléculas prédeterminadas Quantificação da hibridização depende de análise computacional de imagens Sujeita a erros nas diversas etapas Necessidade de normalização para capturar transcritos pouco abundantes Necessidade de replicatas biológicas e técnicas barato

6 Sequenciamento: RNA-seq Uso de sequenciamento de alto desempenho (high throughput, next generation sequencing) para sequenciar RNA total (ou filtrado) de amostras Ainda caro quando comparado com microarrays Também sujeito a erros Potencialmente muito mais preciso do que microarrays Transcritos pouco abundantes Sem a limitação de moléculas pré-determinadas: transcritoma para valer! Também precisa de replicatas técnicas e biológicas Confirmação por RT-PCR para casos críticos Reads são curtos (50 a 200 bp)

7 Outros aspectos de RNA-seq Mapeamento de sequências de transcritos no respectivo genoma (quando disponível) RNA-seq criou a necessidade de algoritmos capazes de lidar com grande volume de dados (mapeamento de milhões de reads) lidar com problemas tais como splice alternativo PD, BLAST, MUMmer não servem! Diversos softwares específicos Reconstrução (ou montagem) de transcritos Exons na ordem correta Problema: splices alternativos (isoformas) Sequências de transcritos são muito úteis para ajudar na anotação do genoma (determinação de genes)

8 Reconstrução de mrna Garber et al. 2011

9 Normalização dos valores de expressão medidos pelo número de reads mapeados Fontes de variação Fragmentação de RNA na construção de bibliotecas faz com que transcritos mais longos gerem mais reads comparado com transcritos mais curtos com mesmos níveis de abundância, numa dada amostra Diferentes corridas de sequenciamento produzem diferentes números de reads

10 RPKM Reads per kilobase of transcript per million mapped reads Dado um trecho de 1 kbp de transcrito Se neste trecho houver 1 milhão de reads mapeados RPKM = 1 Leva em conta o tamanho e o número de reads FKPM = fragments (paired-end reads)

11 Outros problemas Nem sempre é possível obter unicidade de mapeamento de reads Múltiplas isoformas Parálogos Em geral queremos quantificar a expressão de genes e não de isoformas; como fazer? Intersecção dos reads mapeados nos exons de um dado gene União dos reads mapeados nos exons de um dado gene

12 Garber et al. 2011

13 Trapnell et al. 2012

14 Expressão diferencial Estatística é fundamental Objetivo: estabelecer que a expressão de um gene é significativamente maior (ou menor) em condição c 1 do que em condição c 2 Z scores ou Standard scores x μ z = σ x = score bruto μ = média (população) σ = desvio padrão (população) Uma forma de normalizar valores de amostras diferentes

15 Heat maps São matrizes de valores representados graficamente em geral são valores comparativos fold values : quantas vezes maior do que um valor de referência (ex: Z-score zero) tons de verde representam valores acima do valor de referência tons de vermelho representam valores abaixo do valor de referência valores escuros representam valores próximos do valor de referência Valores semelhantes podem ser agrupados nas linhas e/ou nas colunas: clusterização hierárquica Exige noção de similaridade ou distância A linguagem R permite gerar heat maps

16 Transcritômica e Redes Co-expressão de genes Construção de redes de expressão (interação) gênica Redes de interação proteína-proteína (PPI networks) Dependem de outras tecnologias Biologia de sistemas

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18 Literatura Garber et al Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nature Methods 8(6): Trapnell et al Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature Protocols. 562, 7:3.

19 Garber et al. 2011