DIAGNÓSTICO DE PACIENTES BRASILEIROS COM INTOLERÂNCIA HEREDITÁRIA À FRUTOSE ATRAVÉS DE NGS

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1 DIAGNÓSTICO DE PACIENTES BRASILEIROS COM INTOLERÂNCIA HEREDITÁRIA À FRUTOSE ATRAVÉS DE NGS 1. INTRODUÇÃO A intolerância hereditária à frutose (IHF, OMIM#229600) é um erro inato do metabolismo da frutose de herança autossômica recessiva causado por deficiência na atividade da enzima aldolase B (E.C ) no fígado, rins e intestino. A aldolase B realiza a clivagem da frutose-1p em duas trioses (gliceraldeído e diidroxiacetona fosfato) importantes em vias metabólicas de produção de energia e na lipogênese (STEINMANN, SANTER, VAN DEN BERGHE, 2012). Em pacientes com IHF, o consumo de alimentos contendo frutose, sacarose ou sorbitol causa desconforto gastrointestinal, náusea, vômito, hipoglicemia com sudorese, tremor, tontura, letargia, e eventualmente, apatia, coma e convulsões. A descompensação metabólica é caracterizada por hipoglicemia, acidemia láctica, hipofosfatemia, hipermagnesemia, hiperuricemia e hiperalaninemia (BOUTELDJA; TIMSON, 2010). A incidência da doença é bastante variável entre as diferentes etnias. Em estudos de triagem neonatal na Inglaterra e na Alemanha a prevalência de IHF foi calculada em 1/ e 1/29.600, respectivamente (SANTER et al., 2005; COX, 2002). Muitos pacientes desenvolvem uma aversão protetiva contra alimentos doces que contém frutose, sendo essa uma característica importante da doença. O diagnóstico definitivo pode ser realizado a partir do teste de tolerância à frutose ou pela análise da atividade hepática da enzima aldolase B (ALI; RELLOS; COX, 1998). Ambos os procedimentos são considerados altamente invasivos ao paciente. Assim, a análise do gene ALDOB, que codifica a enzima aldolase B, vem sendo amplamente estudada como forma de diagnóstico definitivo da doença. O gene ALDOB está localizado no cromossomo 9q22.3, apresentando 9 éxons que são traduzidos em uma enzima de 364 aminoácidos. Já foram descritas 65 mutações no gene ALDOB em pacientes com IHF (dados do HGMD). As mutações mais frequentes são c.448g>c (p.ala150pro), c.524c>a (p.ala175asp) e c.1005c>g (p.asn334lys), embora haja diferenças de incidência entre as etnias (COFFEE et al., 2010; FERRI et al., 2012). Em um estudo brasileiro com quatro pacientes a mutação mais frequente foi c.524c>a (VALADARES et al., 2015). A IHF se manifesta por sintomas comuns, o que dificulta o correto diagnóstico baseado apenas nos achados clínicos. Além disso, no Brasil não há laboratórios credenciados para a realização da análise de atividade da aldolase B. Dessa forma, a

2 análise genética do gene ALDOB é a forma mais rápida e menos invasiva para o diagnóstico da IHF. Por se tratar de uma doença metabólica facilmente controlada por meio de uma dieta restrita em frutose, é imprescindível o correto e rápido diagnóstico, pois dessa forma se evita manifestações crônicas da doença, como hepatomegalia. Em vista disso, o objetivo do presente estudo é realizar o diagnóstico genético da IHF por sequenciamento de nova geração (NGS), identificando as mutações de pacientes brasileiros, para implementar o método como padrão de diagnóstico dessa doença no Brasil. 2. METODOLOGIA O presente projeto encontra-se em conformidade com a legislação vigente estando registrado sob nº junto ao comitê de ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Todos os participantes da pesquisa concordaram com sua participação através da assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Os dados clínicos dos pacientes foram obtidos a partir da análise de prontuários e fichas clínicas encaminhadas pelos médicos. Foram coletadas amostras de sangue de doze pacientes - dez com suspeita clínica de intolerância hereditária à frutose e 2 com diagnóstico genético prévio. A extração de DNA foi realizada com Easy-DNA Kit (Invitrogen ) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. A análise da sequência do gene ALDOB foi realizada através de NGS com painel de genes na plataforma IonTorrent PGM (Life Technologies). O gene em análise apresentou 100% de cobertura, incluindo todos os éxons e a borda dos íntrons. Todas as mutações detectadas foram confirmadas por sequenciamento automatizado de Sanger. 3. RESULTADOS e DISCUSSÃO Achados clínicos: A análise dos dados clínicos dos pacientes evidenciou que a maior parte dos pacientes (n=8, tabela 1) apresenta aversão à doces e hipoglicemia após o consumo de frutas (n=7, tabela 1). Além desses sintomas, os pacientes apresentaram vômitos (pacientes 1, 4, 8 e 9), náuseas (paciente 9), crises convulsivas (paciente 2) e dores abdominais (paciente 8). O início dos sintomas variou entre 2 meses até 2 anos de idade. Já a idade ao diagnóstico, baseado em achados clínicos, variou de 1 ano e 8 meses (paciente 4) até os 46 anos (paciente 8). A isoeletrofocalização para transferrina tem sido apontada como um biomarcador importante no diagnóstico e/ou monitoramento de pacientes com IHF. Nesses indivíduos, a N-glicosilação encontra-se prejudicada em consequência da inibição da enzima manose-6- fosfato isomerase por conta do acúmulo de frutose-1p gerado pela atividade ineficiente da aldolase B, resultando em um teste alterado (BOUTELDJA; TIMSON, 2010).

3 Paciente Tabela 1: Achados clínicos nos pacientes com suspeita de IHF. Achados clínicos e bioquímicos Estado Idade ao Isoeletrofocalização Aversão Gênero de diagnóstico Hepatomegalia para à doces origem (anos) transferrina Hipoglicemia após ingestão de frutas 1 M RS 13 Sim Sim Alterada Sim 2 F RS 9 Sim Sim Alterada Sim 3 M CE ND * F RS 1 Sim Sim Alterada Não 5* M RS 9 Sim - Normal Não 6 F RS 4 Sim Não Normal Sim 7 F GO 25 Sim - - Sim 8 F MS 46 Sim - - Sim 9 F GO Sim 10 M RS 2 Sim Sim Alterada Sim 11 M RS ND Não Não Normal - 12 F RS ND Não Não Normal - Nota: *irmãos, M = masculino; F = feminino; RS=Rio Grande do Sul; CE=Ceará; GO=Goiás; MS=Mato Grosso do Sul; - dado não disponível; ND=não definido. Entre os pacientes que realizaram esse exame (n=6), quatro (pacientes 1, 2, 4 e 10) apresentaram alteração no padrão de isoeletrofocalização para transferrina. Esses resultados podem justificar a dificuldade de diagnóstico e o tempo decorrido entre o início dos sintomas e o diagnóstico final, uma vez que os sintomas iniciais da IHF podem ser confundidos com outras doenças, como os defeitos de glicosilação por exemplo. O diagnóstico de IHF tem apresentado outras complicações como o aparecimento de sintomas incomuns à doença, como neuropatia severa (MAITRE et al., 2016), além de casos de pacientes com sintomas de IHF que após extensiva pesquisa clínica, concluiu tratar-se de enterocolite (FIOCCHI et al., 2014), e de pacientes com IHF que apresentavam quadro compatível com Mucolipidose II/III (FERREIRA et al., 2017). Em vista disso, o diagnóstico genético tem sido amplamente empregado como metodologia para o diagnóstico final da doença. Análise genética: O DNA de onze pacientes foi analisado por NGS. Este é o primeiro trabalho a implementar esta tecnologia no diagnóstico molecular de pacientes com IHF. O paciente 5 teve seu genótipo determinado por sequenciamento automatizado de Sanger. Para esse paciente analisou-se apenas as regiões cujas mutações foram identificadas na irmã (paciente 4). A análise genética evidenciou que sete pacientes com quadro clínico suspeito de IHF não apresentaram nenhuma alteração no gene ALDOB (pacientes 3, 6, 7, 8, 9, 11 e 12, tabela 2). Esses achados, reforçam a necessidade de implementação do diagnóstico genético para essa doença, posto que os achados clínicos podem dificultar o diagnóstico definitivo e atrasar o início do tratamento adequado aos pacientes.

4 Tabela 2: Genótipo de pacientes brasileiros com IHF. Genótipo Paciente Posição transcricional Posição do amino ácido NM_ NP_ Referência 1** c.[448g>c;360_363delcaaa] p.[ala150pro;asn120lisfs*32] (CROSS; TOLAN; COX, 1988; 2** c.[448g>c;178c>t] p.[ala150;pro;arg60*] (BROOKS; TOLAN, 1994; CROSS; TOLAN; COX, 1988) 3 Sem variantes patogênicas 4 # c.[448g>c;360_363delcaaa] p.[ala150pro;asn120lisfs*32] (CROSS; TOLAN; COX, 1988; 5 # c.[448g>c;360_363delcaaa] p.[ala150pro;asn120lisfs*32] (CROSS; TOLAN; COX, 1988; 6 Sem variantes patogênicas 7 Sem variantes patogênicas 8 Sem variantes patogênicas 9 Sem variantes patogênicas 10 c.[448g>c;360_363delcaaa] p.[ala150pro;asn120lisfs*32] (CROSS; TOLAN; COX, 1988; 11 Sem variantes patogênicas 12 Sem variantes patogênicas Nota: **pacientes com diagnóstico genético prévio; # irmãos. Cinco pacientes tiveram o diagnóstico de IHF confirmado. Todos os pacientes com mutações detectadas são heterozigotos compostos, tendo sido detectados dois genótipos diferentes: c.[448g>c;360_363delcaaa] (n=4) e c.[448g>c;178c>t] (n=1). Um dado importante, que valida o painel utilizado para análise genética dos pacientes, é que dois pacientes (pacientes 1 e 2, tabela 2) com diagnóstico prévio realizado a partir de sequenciamento automatizado de Sanger tiveram seu genótipo confirmado pelo NGS. Todas as mutações detectadas foram previamente descritas em pacientes com IHF de outros países e acarretam em alterações importantes na atividade da proteína (BROOKS; TOLAN, 1994; DAZZO; TOLAN, 1990; MALAY; ALLEN; TOLAN, 2005). A mutação c.448g>c foi descrita em diferentes populações sendo globalmente distribuída como a mais frequente (COFFEE et al., 2010; FERRI et al., 2012; JAMES et al., 1996). Entre os dez alelos de pacientes com IHF confirmada, as mutações c.448g>c, c.360_363delcaaa e c.178c>t apresentam frequência de 50%, 40% e 10%, respectivamente. Esses dados são diferentes do observado por Valadares et al (2015) em que a frequência desses alelos foi de 12,5%, 25% e 25%, nessa ordem. A ampla distribuição dos alelos c.448c>g e c.178c>t em populações europeias e norte americanas sugere que esses alelos apresentaram um evento de origem e se propagaram por deriva genética (TOLAN, 1995). Isso pode justificar as diferenças nas frequências alélicas observadas em estudos do Brasil, refletindo a grande miscigenação da população brasileira. 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS A análise em conjunto dos dados clínicos e genéticos, demonstra que a isoeletrofocalização é um bom biomarcador que, associado a outros achados clínicos e

5 bioquímicos, pode auxiliar no diagnóstico de IHF. Contudo, o diagnóstico definitivo, no Brasil, só pode ser realizado a partir de análises genéticas do gene ALDOB. Para tanto, o método de NGS apresenta-se como uma ferramenta adequada e inovadora ao diagnóstico da IHF, podendo ser implementado para o diagnóstico genético da doença em pacientes brasileiros. 5. REFERÊNCIAS ALI, M.; RELLOS, P.; COX, T. M. Hereditary fructose intolerance. Journal of medical genetics, v. 35, p , BOUTELDJA, N.; TIMSON, D. J. The biochemical basis of hereditary fructose intolerance. Journal of Inherited Metabolic Disease, v. 33, n. 2, p , BROOKS, C. C.; TOLAN, D. R. A partially active mutant aldolase B from a patient with hereditary fructose intolerance. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, v. 8, n. 1, p , COFFEE, E. M. et al. Increased prevalence of mutant null alleles that cause hereditary fructose intolerance in the American population. Journal of Inherited Metabolic Disease, v. 33, n. 1, p , COX, T. M. The genetic consequences of our sweet tooth. Nature reviews. Genetics, v. 3, n. 6, p , CROSS, N. C. P.; TOLAN, D. R.; COX, T. M. Catalytic deficiency of human aldolase B in hereditary fructose intolerance caused by a common missense mutation. Cell, v. 53, n. 6, p , DAZZO, C.; TOLAN, D. R. Molecular evidence for compound heterozygosity in hereditary fructose intolerance. American Journal of Human Genetics, v. 46, n. 6, p , ESPOSITO, G. et al. Six Novel Alleles Identified in Italian Hereditary Fructose Intolerance Patients Enlarge the Mutation Spectrum of the Aldolase B Gene. Human Mutation, v. 761, n. August, p. 1 8, FERREIRA, C. R. et al. Hereditary fructose intolerance mimicking a biochemical phenotype of mucolipidosis: A review of the literature of secondary causes of lysosomal enzyme activity elevation in serum. American Journal of Medical Genetics, Part A, v. 173, n. 2, p , FERRI, L. et al. Integration of PCR-Sequencing Analysis with Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification for Diagnosis of Hereditary Fructose Intolerance. JIMD Reports, v. 4, n. June, p , FIOCCHI, A. et al. Fruit-induced FPIES masquerading as hereditary fructose intolerance. Pediatrics, v. 134, n. 2, p. e602-5, JAMES, C. L. et al. Neonatal screening for hereditary fructose intolerance: frequency of the most common mutant aldolase B allele (A149P) in the British population. Journal of medical genetics, v. 33, n. 10, p , MAITRE, A. et al. Relapsing Acute Axonal Neuropathy in Hereditary Fructose Intolerance. Pediatric Neurology, v. 64, p , MALAY, A. D.; ALLEN, K. N.; TOLAN, D. R. Structure of the Thermolabile Mutant Aldolase B, A149P : Molecular Basis of Hereditary Fructose Intolerance. Journal of Molecular Biology, v. 347, p , SANTER, R. et al. The spectrum of aldolase B (ALDOB) mutations and the prevalence of hereditary fructose intolerance in Central Europe. Human mutation, v. 25, n. 6, p. 594, STEINMANN, B.; GITZELMANN, R. The diagnosis of hereditary fructose intolerance. Helvetica paediatrica acta, v. 36, n. 4, p , set STEINMANN, B.; SANTER, R.; VAN DER BERGHE, G. Inborn metabolic diseases diagnosis and treatment. Inborn Metabolic Diseases: Diagnosis and Treatment. [S.l: s.n.], p TOLAN, D. R. Molecular Basis of Hereditary Fructose Intolerance : Mutations and Polymorphisms in the Human Aldolase B Gene. Human Mutation, v. 6, p , VALADARES, E. R. et al. Hereditary fructose intolerance in Brazilian patients. Molecular Genetics and Metabolism Reports, v. 4, n. June 2015, p , 2015.