RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA PIBIC: CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PRODOUTOR, INTERDISCIPLINAR, ACERVO, PIBIT, EBTT E FAPESPA RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período: AGOSTO / 2016 a FEVEREIRO/2017 ( X ) PARCIAL ( ) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa: Avaliação Epidemiológica, Genética, Molecular e Bioquímica de Pacientes com Mucopolissacaridoses na Região Norte do Brasil. Nome do Orientador: Luiz Carlos Santana da Silva Titulação do Orientador: Doutor Faculdade: Universidade Federal do Pará Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas Laboratório: Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo Título do Plano de Trabalho: Investigação bioquímica e molecular da mutação D444H no gene BTD em ameríndios, quilombolas e indivíduos da região do estado do Pará. Nome do Bolsista: Ingrid Luiza Oliveira de Oliveira Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/CNPq ( ) PIBIC/CNPq AF ( ) PIBIC/CNPq- Cota do pesquisador ( X ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/UFPA AF ( ) PIBIC/INTERIOR ( ) PIBIC/PRODOUTOR ( ) PIBIC/PRODOUTOR RENOVAÇÃO ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PIBIC/ACERVO ( ) PIBIC/PE-INTERDISCIPLINAR ( ) PIBIC/VOLUNTÁRIO ( ) PIBIC/PIBIT 1

2 INTRODUÇÃO: A biotina, ou vitamina B8, é uma molécula hidrossolúvel que participa como cofator no ciclo das carboxilases, catalisando vias que estão envolvidas com a biossíntese dos ácidos graxos, gliconeogênese, ciclo do ácido tricarboxilícico e também com o metabolismo dos carboidratos. A biotina pode ser adquirida na dieta, assim como também se encontra ligada a proteínas no organismo. Dentre as enzimas que fazem parte da homeostase da biotina, a biotinidase é responsável pela reciclagem da biotina a partir da biocitina, tornando-a livre para ser absorvida pelo intestino, participar de outras vias metabólicas, ou até mesmo, liberando-a para as histonas. As histonas são proteínas diretamente ligadas ao empacotamento do DNA, porém o mecanismo de ligação da biotina a estas proteínas necessita de estudos adicionais para a sua elucidação. A deficiência da biotinidase (DB) é um erro inato do metabolismo do grupo das acidemias orgânicas, apresentando um padrão de herança autossômica recessiva. A deficiência da atividade enzimática de biotinidase causa a não reciclagem de biotina, podendo gerar uma deficiência múltipla de carboxilases com posterior acúmulo de substâncias tóxicas no organismo (corpos cetônicos, lactato, entre outros). O diagnóstico bioquímico é confirmado através de um ensaio enzimático para quantificar a atividade de biotinidase. Este protocolo utiliza como amostras biológicas plasma, soro ou sangue impregnado em papel filtro. Os indivíduos que apresentarem atividade enzimática <10% são considerados deficientes totais de biotinidase; àqueles com atividade enzimática variando entre 10 a 30% apresentam a deficiência parcial de biotinidase. Indivíduos heterozigotos para DB possuem atividade enzimática na faixa entre indivíduos afetados e normais. A deficiência de biotinidase já pode ser diagnosticada pelo teste de triagem neonatal, autorizado pelo Ministério da Saúde através da Portaria nº (14 de dezembro de 2012), fazendo parte da Fase IV do teste do pezinho junto com a Hiperplasia Adrenal Congênita. Os sintomas da DB total aparecem em média aos 3,5 meses. O quadro clínico se caracteriza pela presença de problemas dermatológicos, neurológicos e metabólicos. O tratamento precoce com suplementação de biotina evita os principais sintomas da DB, como perda auditiva, visual, deficiência mental e coma. Crianças com DB parcial não tratada podem exibir sintomas mais leves e surgem apenas quando a criança passa por um período de estresse, como uma infecção prolongada ou alimentação inadequada. Para o tratamento de pacientes com disfunção enzimática da biotinidase, administra-se suplementação oral de biotina livre (em média, 5-20mg por dia) por toda a vida. 2

3 JUSTIFICATIVA: O gene BTD, que codifica a enzima biotinidase, está localizado na região 25.1 do braço curto do cromossomo 3, é composto por 2200pb com 4 exons que codificam uma proteína de 543 aminoácidos. Na literatura, mais de 100 mutações para caracterização da deficiência total desta enzima já foram descritas. Dentre as mutações encontradas no gene BTD que causam a deficiência parcial de biotinidase, a mais relatada tem sido a mutação missense G1330>C, que resulta na substituição de um resíduo de histidina por um resíduo de aspartato na posição 444 da proteína (D444H). Indivíduos homozigotos para a variante c.1330g>c (p.d444h) apresentam aproximadamente 45 a 50% da atividade normal da biotinidase, o que é similar à atividade dos heterozigotos para DB total tais indivíduos podem não necessitar de tratamento. As associações entre genótipo e fenótipo bioquímico, descritas para a DB, foram feitas a partir da comparação entre o genótipo e a atividade da biotinidase. Ainda que se trate de uma deficiência parcial, a literatura registra sintomas que possivelmente podem estar ligados a esse genótipo, como tem sido o caso da alopecia areata, porém é preciso que novos estudos sejam realizados para a confirmação dessa possível associação. O projeto em questão procura investigar a incidência da mutação D444H nas populações ameríndias, quilombolas e de indivíduos de Belém e estabelecer a frequência alélica nas mesmas. OBJETIVOS: Realizar investigação bioquímica da enzima Biotinidase em populações ameríndias, quilombolas e do município de Belém. Realizar investigação molecular da enzima Biotinidase, focando na pesquisa da mutação D444H, em populações ameríndias, quilombolas e do município de Belém. Estabelecer valores de referência para cada população. Nesta primeira fase do relatório foi possível determinar a atividade sérica da enzima biotinidase em populações ameríndias Assurini, quilombolas (Quilombo Mangueiras) e do município de Belém. Desta forma, foi possível realizar o estabelecimento da média da atividade enzimática de cada população, bem como os valores de referência de cada uma. 3

4 Limitações técnicas impossibilitaram a quantificação da atividade enzimática de biotinidase em amostras de sangue impregnado em papel filtro. MATERIAIS E MÉTODOS: Coleta: Foram coletadas 143 amostras de soro, sendo 47 de indivíduos pertencentes ao Quilombo Mangueiras, 49 amostras da população ameríndia (Assurini) e 47 amostras de indivíduos do município de Belém. As amostras de soro de indígenas e quilombolas foram cedidas pelo Laboratório de Genética Humana e Médica da Universidade Federal do Pará com a autorização do Profº Dr. João Farias Guerreiro. A coleta das amostras de indivíduos de Belém foi realizada no Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo da Universidade Federal do Pará, sendo colhidos 5mL de sangue em tubo sem anticoagulante e 5mL de sangue em tubo de EDTA. Ensaio enzimático de biotinidase em soro: O ensaio enzimático de biotinidase em soro foi feita através de testes colorimétricos com a utilização do substrato artificial Ácido biotinil-4-amidobenzóico. A leitura da absorbância das amostras foi realizada em Espectrofluorímetro Spectra Max M2, utilizando comprimento de onda de 546 nm. Os valores de referência em soro variam entre 4,4 a 12 nmol/min/ml. Foram utilizados controles normais para realização da técnica e os resultados foram tabelados. Análise Estatística: A determinação de média, desvio padrão e intervalo das amostras foram realizadas pelo programa Biostat 5.0 4

5 RESULTADOS: Após a realização da dosagem enzimática das amostras de cada população em estudo (Tabelas 1, 2 e 3), os resultados obtidos foram: Atividade enzimática de biotinidase para a população ameríndia Assurini: Média da atividade enzimática Desvio padrão Intervalo 6,79 nmol/min/ml ± 1,47 3,3 10,1 nmol/min/ml Tabela 1: Valor de referência para atividade normal de biotinidase em soro: 4,4-12 nmol/min/ml; Heterozigotos: 2,2-5,2 nmol/min/ml; Deficiência parcial de biotinidase de 0,7-2,1 nmol/min/ml; Deficiência total de biotinidase <0,7 nmol/min/ml (Hommes, 1991). Analisando os resultados obtidos pela população ameríndia Assurini, observou-se que 2,0% (1/49) das amostras apresentou atividade abaixo do valor de referência para atividade normal de biotinidase. Considerando apenas 47 indivíduos dessa população, o valor de referência seria corrigido para um intervalo de 4,38 a 10,1 nmol/min/ml, valores que estão de acordo com os encontrados no estudo de Hommes et al., Atividade enzimática para a população do Quilombo Mangueira: Média da atividade enzimática Desvio padrão Intervalo 5,54 nmol/min/ml ± 1,53 1,54 8,6 nmol/min/ml Tabela 2: Valor de referência para atividade normal de biotinidase em soro: 4,4-12 nmol/min/ml; Heterozigotos: 2,2-5,2 nmol/min/ml; Deficiência parcial de biotinidase de 0,7-2,1 nmol/min/ml; Deficiência total de biotinidase <0,7 nmol/min/ml (Hommes, 1991). Em relação aos resultados da atividade de biotinidase na população quilombola, aproximadamente 17%, (8/47) apresentou atividade menor (1,54 a 3,77 nmol/min/ml) que a estipulada para valor de referência para atividade normal de biotinidase. Dessa forma, o valor de referência para população quilombola, seguindo os valores determinados por Hommes et al, 1991, seria de 4,42 a 8,6 nmol/min/ml. 5

6 Na população do município de Belém: Média da atividade enzimática Desvio padrão Intervalo 8,52 nmol/min/ml ± 1,6 4,97 12,21 nmol/min/ml Tabela 3: Valor de referência para atividade normal de biotinidase em soro: 4,4-12 nmol/min/ml; Heterozigotos: 2,2-5,2 nmol/min/ml; Deficiência parcial de biotinidase de 0,7-2,1 nmol/min/ml; Deficiência total de biotinidase <0,7 nmol/min/ml (Hommes, 1991). Quanto aos resultados determinados para população do município de Belém, todas as amostras constavam dentro do valor de referência estimado por Hommes (1991). ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES ATIVIDADES Meses Levantamento bibliográfico X X X X X X X X X X X Análise Molecular do exon 4 do gene BTD X X X X X Análise Estatística X X X X Elaboração do relatório final de atividades X X X X Apresentação de um resumo em eventos da área X X Elaboração de artigo para posterior publicação em revistas com fator de impacto ou qualis. X X X CONCLUSÃO: Os mecanismos de ação da enzima biotinidase e sua importância para regulação da homeostase têm sido esclarecidos. No entanto, estudos na área de genética de populações que avaliem a atividade da referida enzima em diversos grupos étnicos ainda são escassos, principalmente quanto à investigação de uma mutação que caracteriza uma deficiência parcial da enzima em populações indígenas e quilombolas do estado do Pará. A análise molecular será uma etapa crucial para determinação da frequência alélica e genotípica desta mutação. 6

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BAY LB, DE PINHO S, EIROA HD, OTEGUI I, RODRIGUEZ R The importance of a law on time: presentation of a girl with biotinidase deficiency who was not picked up through the neonatal screening]. Arch Argent Pediatr (2010) 108: e BORSATTO et al. Biotinidase deficiency: clinical and genetics studies of 38 Brazilin patients. BMC Medical Genetics :96. CHAPMAN-SMITH A, CRONAN JE JR. Molecular biology of biotin attachment to proteins. J Nutr Feb;129(2S Suppl):477S-484S. COLE H, REYNOLDS TR, LOCKYER JM, BUCK GA, DENSON T, SPENCE JE, HYMES J, WOLF B (1994) Human serum biotinidase. cdna cloning, sequence, and characterization. J Biol Chem 269: COWAN TM, BLITZER MG, WOLF B. Working Group of the American College of Medical Genetics Laboratory Quality Assurance Committee (2010) Technical standards and guidelines for the diagnosis of biotinidase deficiency. Genet Med 12: MCVOY JR, LEVY HL, LAWLER M, SCHMIDT MA, EBERS DD, HART PS, PETTIT DD, BLITZER MG, WOLF B (1990) Partial biotinidase deficiency: clinical and biochemical features. J Pediatr 116: NETO EC, SCHULTE J, RUBIM R, et al. Newborn screening for biotinidase deficiency in Brazil: biochemical and molecular characterizations. Braz J Med Biol Res 2004;37: SCHULTE J. Estudo da estabilidade térmica e temporal da atividade de biotinidase em amostras de sangue (papel-filtro, plasma e soro) Mestrado. Faculdade de Medicina. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, p. 67. SWANGO KL, DEMIRKOL M, HÜNER G, et al. Partial biotinidase deficiency is usually due to the D444H mutation in the biotinidase gene. Hum Genet 1998;102: WEISSBECKER, K.A., WOLF, B., PUISSAN, C. AND NANCE, W.E. Detection of heterozygotes for biotinidase deficiency. Am J. Hum Genet. 37, A 81. WOLF B. Biotinidase deficiency: "if you have to have an inherited metabolic disease, this is the one to have. Genet Med. 2012; 14: WOLF B, GRIER RE, ALLEN RJ, GOODMAN SI, KIEN CL Biotinidase deficiency: the enzymatic defect in late-onset multiple carboxylase deficiency. MCMAHON RJ. Biotin in metabolism and molecular biology. Annu Ver Nutr. 2002;22: Epub 2002 Jan 4. WOLF B, JENSEN K et al. Seventeen novel mutations that cause profound biotinidase deficiency. Mol Genet Metab (1-2):

8 DIFICULDADES Nada a declarar PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o desenvolvimento das atividades do aluno e justificativa do pedido de renovação, se for o caso. O relatório parcial está consistente com os objetivos traçados. A acadêmica Ingrid de Oliveira tem despertado grande interesse e responsabilidade nas suas atividades de pesquisa. Portanto, emito parecer favorável ao presente relatório parcial. DATA: 23 de fevereiro de 2017 Luiz Carlos Santana da Silva ASSINATURA DO ORIENTADOR Ingrid Luiza Oliveira de Oliveira ASSINATURA DO ALUNO INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Em caso de aluno concluinte, informar o destino do mesmo após a graduação. Informar também em caso de alunos que seguem para pós-graduação, o nome do curso e da instituição. 8