UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

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1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA Período : 01 / 2015 a 08 / 2015 ( ) PARCIAL (x) FINAL RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO: Aproveitamento dos Resíduos Agroindustriais de Cacau (Theobroma cacao l.): Obtenção de Extratos Secos Padronizados em Antioxidantes Naturais e Aplicações na Nome do Orientador: Maria Roseane Ribeiro Costa Titulação do Orientador: Doutora Faculdade : Farmácia Unidade: Instituto de Ciências da Saúde Laboratório:Controle de Qualidade de Medicamentos Título do Plano de Trabalho: Obtenção de Extratos Secos dos Compostos Marjoritários dos Resíduos do Cacau (Theobroma cacao l.) Nome do Bolsista: Kalene de Almeida Oliveira Tipo de Bolsa : ( ) PIBIC/CNPq ( ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/INTERIOR ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PRODOUTOR ( ) PARD renovação ( ) PIBIC/PIAD ( ) PIBIC/AF-CNPq ( ) PIBIC/AF-UFPA (x) PIBITI ( ) PADRC

2 2 INTRODUÇÃO O Brasil é um dos maiores produtores de alimentos obtidos de frutas tropicais como cacau e esse tipo de comercio vem ganhado destaque devido o grande consumo no mercado nacional e internacional o que tem levado ao aumento da produção e extração dos mesmos, que pode estar relacionada à presença de propriedades benéficas para a saúde, pois podem ajudar na prevenção de doenças degenerativas, assim como doenças cardíacas e diabetes. Contudo também tem elevado a produção de resíduos agroindustriais, que por sua vez tem ocasionado um problema ambiental. Esses resíduos assim como os frutos também podem apresentar compostos com propriedades bioativas, além de fibras, lipídeos, vitaminas, proteínas, carboidratos, minerais etc. Esses resíduos apresentam grande potencial nutritivo podendo ser reaproveitados, agregando valor a um produto antes descartado. O cacau (Theobroma cacao L) é uma espécie tropical, encontrada de forma espontânea nas planícies úmidas da América do Sul e Central, é uma cultura que permite o sustento do homem á terra e possui importância ecológica, social e econômica..o Estado do Pará é o segundo maior produtor de cacau do Brasil, sendo o município de Medicelândia o responsável por 60% da produção de cacau do Estado do Pará. Alguns estudos revelam que o cacau, assim como outras frutas amazônicas apresentam produtos fenólicos. Logo os subprodutos gerados da extração do cacau possam apresentam compostos fenólicos e nutritivos, sendo viável o reaproveitamento dos mesmos agregando valor a cadeia produtiva do cacau e além de minimizar os danos ambientais. Existem diversas técnicas de extração de compostos fenólicos entre elas a técnica de extração por banho ultrassom, que é barata, eficiente e simples. Essa técnica permitirá a obtenção de extratos secos dos resíduos de cacau preservando a presença de compostos majoritários nos mesmos. 2

3 3 JUSTIFICATIVA Recentemente novas técnicas de extração vêm sendo desenvolvidas entre elas a realizada por banho ultrassom. Essa técnica é uma alternativa barata, simples e eficiente para a extração convencional por reduzir a temperatura, a quantidade de solvente e encurtar o tempo de extração sendo promissora na extração de compostos termossensíveis e estavéis. Logo esta técnica pode ser usada para a extração de compostos fenólicos. Os resíduos de cacau oriundos da semente é um subproduto desperdiçado do processo de extração da gordura de cacau, esses resíduos possuem elevado teor de polifenóis, que tem ação antimicrobiana, anti-inflamatória, antimutagênico e anticarcinogênico. Esses resíduos também são ricos em proteínas, fibras solúveis e carboidratos o que agrega valor nutricional aos subprodutos do cacau e do potencial antioxidante como forma de agregar valor a cadeia produtiva. Sendo assim, neste projeto será desenvolvida a extração dos compostos fenólicos dos resíduos de cacau utilizando banho ultrassônico e seus metabolitos serão quantificados por cromatografia de líquida de alta eficiência. OBJETIVOS Realizar a extração por banho ultrassom dos resíduos agroindustriais do cacau (Theobroma cacao L.) e quantificar por cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) os componentes majoritários viabilizados pela análise fatorial OBJETIVOS FINALIZADOS Analise microbiológica da amostra; Analise de densidade da amostra; Analise de ph. Extração por ultrassom; Analise fatorial; Validação do método de quantificação por HPLC; Quantificação dos compostos majoritários. 3

4 4 MATERIAIS E MÉTODOS: PROCESSAMENTO DO MATERIAL VEGETAL O material vegetal foi levado à secagem em estufa na temperatura de 40ºC e mantido até peso constante, processo este que durou aproximadamente 3 dias. Posteriormente, o material foi processado para obtenção do material particulado uma vez que o material tem um percentual de óleo e isso dificulta a pulverização em moinho de facas. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS PÓS DETERMINAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO GRANULOMÉTRICA Para a determinação da granulometria dos pós, foi pesado 10g do material vegetal em triplicata, submetendo as amostras em tamises de diferentes malhas (1700, 710, 355, 200, 180, 125 e 106 µm), em agitador de peneiras eletromagnético durante 20 minutos. Em seu termino, realizou-se a quantificação do percentual retido em cada tamis, para classificar o pó de acordo com sua granulometria (FARMACOPÉIA BRASILEIRA V, 2010). ANÁLISE MICROSCÓPICA DOS PÓS Para a análise microscópica do pó, a amostra foi colocada em uma lâmina e então foi adicionado 2 gotas de água e, posteriormente, observados em microscópio óptico (Charriot) nas objetivas de 10 e 40 (Farmacopéia Brasileira V, 2010). ANÁLISE DE MATERIAL ESTRANHO De acordo com a Farmacopéia Brasileira (2010), para a análise de material estranho foi pesado 25g do pó, e por quarteamento a amostra foi espalhada sobre uma superfície plana e a análise de partículas estranhas foi visualizada a olho nu, submetendo o material à análise com lente de aumento de 5 a 10 vezes. ANÁLISE CENTESIMAL A determinação da análise centesimal foi realizada através da investigação do percentual de umidade, cinzas, teor de lipídeos, proteínas, carboidratos e fibras a partir de 100g do pó (AOAC, 2012). 4

5 5 DETERMINAÇÃO DE PERDA POR DESSECAÇÃO Para a determinação de perda por dessecação foram pesadas três amostras de 1g do material vegetal e as mesmas foram transferidas para pesa-filtros, previamente dessecados por 30 minutos. As amostras foram levadas à estufa por duas horas a 105ºC, após este processo, as mesmas foram resfriadas em dessecador e pesadas. Este procedimento foi feito até a obtenção de peso constante (FARMACOPÉIA BRASILEIRA V, 2010). A determinação do resultado foi avaliado de acordo com a Equação 1: % perda = Pu Ps x 100 Equação (1) Pa Onde: Pa = peso da amostra (g) Pu = peso do pesa-filtro contendo a amostra antes da dessecação(g) Ps = peso do pesa-filtro contendo a amostra após a dessecação(g) INTUMESCIMENTO DOS PÓS Pesou-se 1g do pó e transferiu-se para proveta de 25mL, em seguida o volume foi completado com agua (qsp 25mL) e foi agitado a cada 10 minutos por 1 hora. Posteriormente, a amostra foi mantida em repouso por 3 horas. O procedimento foi realizado em triplicata. O resultado foi obtido através da diferença entre o volume final (após experimento) do volume inicial (FARMACOPÉIA BRASILEIRA V, 2010). ANALISE FATORIAL Foi realizado o planejamento fatorial de 2 3 com 3 pontos centrais utilizando três variáveis que são relação solvente/ água, tempo de extração e concentração das amostras de acordo com Tabela 1 (Bashi et al, 2012). 5

6 6 Tabela 1: Analise fatorial da extração por ultrassom. Amostras Solv/Água Tempo Concentração EXTRAÇÃO POR ULTRASSOM As amostras obtidas por meio da análise fatorial foram preparadas em triplicata para um volume final de 10 ml e levadas para o banho de ultrassom (Kondentech) onde ficaram por períodos de 20, 30 e 40 minutos, de acordo com o tempo estabelecido pela analise fatorial. Em seguida, todas as amostras foram filtradas e armazenadas em frascos âmbar e levadas para a geladeira (Bashi et al, 2012). DETERMINAÇÃO DE POLIFENÓIS TOTAIS Os estudos preliminares da eficiência da extração por ultrassom foi investigado por meio da determinação de polifenóis totais realizada utilizando o reagente Folin-Ciocalteu (Wang et al, 2013). Foram preparadas as soluções de Folin- Ciocalteui em água na proporção 1:1 (v/v) e carbonato de cálcio 75g/L (m/v). As amostras do extrato foram diluídas 100 vezes e as amostras de tintura foram diluídas 50 vezes, em seguida foi adicionado na cubeta 750 µl de amostra, 375 µl de Folin e 1875 µl de carbonato de sódio, e o branco foi preparado substituindo a amostra por 6

7 7 água destilada. As amostras ficaram incubadas durante 30 minutos. A leitura foi realizada em espectrofotômetro UV (Shimadzu UV 1800) a 735 nm, utilizando ácido gálico como padrão. DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS MARJORITÁRIOS Foi realizado por CLAE (Cromatografia Liquida de Alta Eficiência) através da metodologia adaptada de Lacopini et al (2008) nas seguintes condições cromatográficas: sistema gradiente de eluição de solventes (Tabela 2), fluxo de 0,8 ml/min, volume de injeção 10uL e coluna na temperatura de 40 C. Tabela 2: Metodologia para analise em CLAE. Tempo minutos Solvente A: água Solvente B: ac acético 10% Solvente C: Metanol RESULTADOS: A Figura 1 apresenta a distribuição granulométrica do pó do resíduo de cacau, o qual ficou 58% retido no tamis de 710 o que não permite classificar o pó de resíduos de cacau segundo a Farmacopéia Brasileira V (2010). Ess analise é fundamental para a caracterização do pó, pois a uniformidade do tamanho de particulas representa influencia direta no processo de extração (Migliato et al, 2007) 7

8 Percentual do pó retido (%) IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO: Aproveitamento dos Resíduos Agroindustriais de Cacau (Theobroma ,222 29,55 21,734 4, Malha dos tamises (µm) Figura 1: Classificação do pó. TEOR DE UMIDADE E PERDA POR DESSECAÇÃO Os resultados encontrados na Tabela 3 indicam que a amostra apresenta pouca água em sua constituição o que é favorável ao uso desse pó, uma vez que a presença de quantidade elevada de água em uma amostra favorece o crescimento de microrganismos, levando a degradação mais rápida da amostra (Penha e Matta, 1998). Tabela 3: Caracterização de perda por dessecação, teor de umidade e intumescimento em porcentagem. Análise Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Média Perda por 6,2926% 6,4935% 6,8917% 6,56% dessecação Teor de umidade 5,3% 5,8% 5,6% 5,57% Intumescimento dos pós 1,1mL 1,0mL 1,0mL 1,03mL DETERMINAÇÃO DE MATERIAL ESTRANHO A determinação de material estranho foi empregada para identificar algum tipo de materiais estranhos como impurezas de origem mineral, material contaminante ou outras partes do vegetal. Neste contexto, não foi observado aspecto diferente, contaminações e nem indícios de nenhum material estranho. ANÁLISE CENTESIMAL Na análise centesimal os valores de lipídeos, carboidratos e proteínas foram mais elevados que indica o valor nutricional desse pó. Os valores encontrados neste trabalho para proteínas e lipídeos 8

9 9 no entanto, foi inferior ao obtido por Efraim et al (2010), que foram 23,88 e 54,82 respectivamente. Tabela 3: Analise Centesimal em porcentagem. PARÂMETRO MÉDIA(%) DP(%) Umidade 6,68 0,01 Cinzas 4,10 0,11 Lipídeos 39,35 0,19 Proteínas 17,31 0,58 Carboidratos 31,56 Fibras 13,23 2,21 ANÁLISE MICROSCÓPICA A Figura 2 mostra a fotomicroscopia óptica do pó de resíduo de cacau, a qual evidencia partículas de tamanho heterogêneo, que dificultou a classificação do pó. Entretanto, nenhuma característica incomum ao pó foi encontrada. Figura 2: Objetiva de 10X. Objetiva de 40X. DETERMINAÇÃO DE POLIFENÓIS TOTAIS Os polifenóis encontrados nesse trabalho estão no intervalo de 54,62 464,62 µg/eq.g Ac. Gálico (Tabela 4). Wang et al (2013) reportaram valores de µg/eq.g Ac.Gálico diretamente em amostras de rizoma, o que pode estar relacionado a diferentes quantidades de polifenois obtidos nesse trabalho. Outros fatores que influenciam é a degradação desses compostos fenólicos em temperaturas elevadas, a quantidade e a polaridade do solvente utilizado que alteraram o rendimento da extração, uma vez que a extração dos compostos fenólicos depende da polaridade do solvente. Logo em alguns casos um único solvente não é o suficiente para fazer uma boa extração dos compostos e também quanto maior a quantidade de solvente utilizada na extração menor é o rendimento da extração (Wang et al, 2013; Markon et al, 2007). 9

10 10 Tabela 4: Determinação de polifenóis totais expressos em µg/eq.g Ac. Gálico. AMOSTRA µg/eq.g Ac. Gálico (média) Desvio Padrão Coeficiente de Variação 1 342,64 26,27 7, ,29 22,17 11, ,27 64,98 18, ,62 11,33 2, ,16 71,28 21, ,20 71,16 48, ,36 64,36 23, ,91 40,36 22, ,81 45,43 24, ,36 12,18 5, ,98 25,83 16, ,62 20,03 36, ,15 22,89 13, ,50 30,23 12, ,95 38,03 17, ,92 10,33 9, ,92 35,46 44,37 DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS MAJORITÁRIOS No desenvolvimento do método de quantificação por CLAE, de acordo com o tempo de retenção do padrão (Figura 3) em comparação ao extrato (Figura 4), observa-se que foi possível identificar a presença apenas da epicatequina na amostra de estudo. Entretanto, o desenvolvimento do método encontra-se em andamento, uma vez que é comum se encontrar polifenóis como catequina e epicatequina na amostra de residuos de cacau. Esses compostos são predominantes nesta espécie vegetal de acordo com o descrito na literatura (Efraim et al, 2006). 10

11 11 Catequina Epicatequina Figura 3: Cromatograma dos padrões. Epicatequina Figura 4: Cromatograma do extrato. CONCLUSÃO A princípio foi realizada a caracterização do pó, através da qual foi possível obter parâmetros como analise centesimal, perda por dessecação, intumescimento do pó e analise microbiológica os quais apresentaram valores compatíveis com os encontrados na literatura. O ensaio de granulometria não permitiu caracterizar o pó. De acordo com o ensaio centesimal o pó apresentou uma grande quantidade de lipídeos e carboidratos. No entanto, a caracterização do pó é a primeira etapa para o processo de extração por ultrassom, uma vez que é necessário conhecer o material para que se possa verificar as alterações sofridas após o processo de extração. Neste estudo, sugere-se que a metodologia empregada (meio ultrassonico) foi possível extrair os metabólitos de interesse e, em seguida, determinar os teores de polifenóis totais. A metodologia de CLAE em desenvolvimento permitiu apenas a quantificação da epicatequina, sendo necessária a continuação dos estudos para a identificação da catequina e outros possíveis marcadores. 11

12 12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADOLFO INSTITUT MOLE, S. & WATERMAN, P. G. A critical analysis of techniques for measuring tannins in ecological studies II. Techniques for biochemically defining tannins. Oecologia. v.72, p , 1987b. AJILA, C. M.; BHAT, S. G.; PRASADA RAO, U. J. S. Valuable components of raw and ripe peels from two Indian mango varieties. Food Chemistry, Washington, v. 102, n. 4, p , BASHI, D. S. et al. Optimization of Ultrasound-assisted Extraction of Phenolic Compounds from Yarrow (Achillea beibrestinii) by Response Surface Methodology. Food Sci. Biotechnol. 21(4): , EFRAIM, P. et al. Teores de Compostos Fenólicos de Sementes de Cacaueiro de Diferentes Genótipos. Braz. J. Food Technol., v. 9, n. 4, p , out./dez EFRAIM, P. et al. Influência da fermentação e secagem de amêndoas de cacau no teor de compostos fenólicos e na aceitação sensorial. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 30(Supl.1): , maio FARMACOPÉIA BRASILEIRA V. 5a ed. Volume 1 e 2. Agência Nacional de Vigilância Sanitária GUO, C.; YANG, J.; WEI, J.; LI, Y.; XU, J.; JIANG, Y. Antioxidant activities of peel, pulp and seed fractions of common fruits as determined by FRAP assay. Nutrition Research, Washington, v. 23, n. 12, p , HALLIWELL, B., Antioxidants in human health and disease. Annual Review of Nutrition,16, 33 50, LEIFERT, W. R.; ABEYWARDENA, M. Y. Cardioprotective actions of grape polyphenols. Nutrition Research, Tarrytown, v. 28, n. 11, p , 2008b. Ma YQ, Chen JC, Liu DH, Ye XQ. Simultaneous extraction of phenolic compounds of citrus peel extracts: Effect of ultrasound. Ultrason. Sonochem. 16: (2009). Markom, M et al. Jahim, Extraction of hydrosable tannins from Phyllanthus niruri Linn. Effect of solvents and extraction methods, Sep. Purif. Technol. 52, ,

13 13 MEDEIROS, M. L. & LANNES, S. C. da S. Propriedades físicas de substitutos do cacau. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 30(Supl.1): , maio MIGLIATO, K. F. et al. Controle da qualidade do fruto de Syzygium cumini (L.) Skeels. Brazilian Journal of Pharmacognosy. 17(1): , Jan./Mar PENHA, E. D. M. e MATTA, V. M. D. Caracteristicas físico-química, microiologica da polpa de cacau. Pesq. agropec. bras., Brasilia, v. 33, n.l 1, p , nov RODRIGUES, S. B. Resíduos da Agroindústria como fonte de fibras para elaboração de pães integrais, 2010, 98 f. Dissertação de Mestrado (Mestrado em Ciências dos Alimentos) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, São Paulo. SCHIEBER, A.; STINTZIN, G. F. C.; CARLE, R. By-products of plant food processing as a source of functional compounds recent developments. Trends in Food Science & Technology, v.12, n.11., p , WANG, X. et al. Optimisation of ultrasound assisted extraction of phenolic compounds from Sparganii rhizoma with response surface methodology. Ultrasonics Sonochemistry 20, DIFICULDADES: - Atraso no recebimento do aparelho de ultrassom para inicio das extrações; - Atraso na obtenção da amostra. PARECER DO ORIENTADOR: A bolsista Kalene de Almeida Oliveira desenvolve suas atividades com dedicação, desempenho e responsabilidade. DATA: 10/08/2015 ASSINATURA DO ORIENTADOR ASSINATURA DO ALUNO 13

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