UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE. Jenielly de Noronha Ferreira de Castro

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE Jenielly de Noronha Ferreira de Castro PERFIL DE RESISTÊNCIA DE CEPAS DE Pseudomonas aeruginosa EM TRÊS CENTROS DE SAÚDE DO ESTADO DO RN Natal /RN 2015

2 JENIELLY DE NORONHA FERREIRA DE CASTRO PERFIL DE RESISTÊNCIA DE CEPAS DE Pseudomonas aeruginosa EM TRÊS CENTROS DE SAÚDE DO ESTADO DO RN Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Centro de Biociências, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos à obtenção de título de Mestre em Ciências Biológicas. Área de concentração: Biodiversidade - Microbiologia (Bacteriologia médica). Orientador: Prof. Dr. Renato Motta Neto Natal /RN 2015

3 Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências Castro, Jenielly de Noronha Ferreira de. Perfil de resistência de cepas de pseudomonas aeruginosa em três centros de saúde do Estado do RN / Jenielly de Noronha Ferreira de Castro. Natal, RN, f.: il. Orientador: Prof. Dr. Renato Motta Neto Dissertação (Mestrado) Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas. 1. Pseudomonas aeruginosa Dissertação. 2. Resistência. Dissertação. 3. AmpC. Dissertação. I. Motta Neto, Renato. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título RN/UF/BSE-CB CDU

4 FOLHA DE APROVAÇÃO

5 DEDICATÓRIA Dedico estre trabalho aos meus pais, meus irmãos e meu esposo por todo o apoio que me ofereceram nesses anos de estudos. Especialmente ao meu filho, o maior presente na minha vida.

6 AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Rosa Maria de Noronha e Jessé Ferreira, pelo amor, carinho e compreensão, e por terem sido um exemplo em minha vida de retidão de caráter, honestidade e perseverança. Aos meus irmãos, Jeilma Noronha e Jonatas Noronha, por todo o incentivo, carinho e amizade que me deram força, muito obrigada por acreditar em mim; Ao meu esposo, Elnaem Castro, pelo companheirismo, amor e compreensão, sem o seu apoio seria muito difícil chegar até aqui. Ao Professor Dr. Renato Motta Neto, pela oportunidade que me foi confiada, mesmo quando ainda não me conhecia, muito obrigada pela confiança, incentivo, paciência e pelos valiosos ensinamentos. Ao Professor Dr. Kassio Michel Gomes de Lima e Professora Maria Celeste Nunes de Melo pelas contribuições científicas deste trabalho. Aos colegas de laboratório, Fagner Martins, Miguel Ansaldi, Maria Eduarda Costa, Ransay Lourenço, e Edilaine Silva pela amizade, convívio e ajuda; Aos bioquímicos dos laboratórios de Análises Clínicas do HUOL, do HGT e LACEN-RN, sobretudo aos responsáveis pelo setor de microbiologia pela abertura cedida para o recrutamento das amostras clínicas. Aos colegas da Pós Graduação em Ciências Biológicas, especialmente Israelly Senna e Maria Carolina, que se tornaram grandes amigas, pela troca de experiências dentro e fora das salas de aula, tornando o período das disciplinas momentos agradáveis e de crescimento coletivo. A todos que contribuíram direta ou indiretamente neste trabalho, os meus sinceros agradecimentos.

7 RESUMO O crescente aumento da resistência aos antimicrobianos em Pseudomonas aeruginosa é um exemplo notável de como as bactérias podem manter e expressar novas informações genéticas que conferem resistência a uma ou várias drogas. No presente estudo avaliou-se o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos em isolados de P. aeruginosa provenientes de três grandes centros de referência do Estado do Rio Grande do Norte: Laboratório Dr. Almino Fernandes (LACEN-RN), Laboratório de Análises Clínicas do HUOL e Laboratório de Análise Clínicas do Hospital Giselda Trigueiro (HGT). Os isolados foram obtidos entre janeiro de 2013 e junho de 2014, onde 113 cepas foram isoladas de diversas amostras clínicas por demanda espontânea. A espécie de P. aeruginosa foi identificada inicialmente nos laboratórios de origem e confirmada, através de testes fenotípicos, no Laboratório de Micobactérias (LABMIC) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN. A determinação da susceptibilidade aos antimicrobianos deu-se através do Teste de Disco Difusão. Após a determinação do perfil de resistência, as amostras foram submetidas à avaliação fenotípica confirmatória para detecção de produção de Beta Lactamase do tipo AmpC e Metallo Beta Lactamase. Dos 113 isolados 67,2% (n = 76) apresentaram perfil de resistência a, pelo menos, uma classe de antimicrobianos. Todas as cepas de P. aeruginosa foram susceptíveis a Polimixina B. As maiores taxas de resistência foram verificadas frente à Ofloxacina 57,5% (n=65), Ciprofloxacina 55,7% (n=63), Norfloxacina 55,7% (n=63), Ticarcilina-ácido clavulânico 43,3% (n=49), Ceftazidima 41,5% (n=47), Meropenem 39,8% (n=45), Aztreonam e Cefepime 38,9% (n=44), Imipenem 36,2% (n=41), Tobramicina 36,2% (n=41), Piperacilina-tazobactam 28,3% (n=32) e Amicacina 28,3% (n=32). Das 113 cepas estudadas, 46 (40,7%) apresentaram resultados fenotípicos positivos para produção de β-lactamases do tipo AmpC através do método de disco aproximação. Cinquenta (44%) isolados apresentaram resistência a, pelo menos, um dos carbapenêmicos avaliados, e estes foram submetidas ao teste de detecção fenotípica para produção de Metallo Beta Lactamase MBL, através do teste de bloqueio enzimático com discos combinados com EDTA. Das 50 amostras com resistência a carbapenêmicos, 21 (42%) apresentaram teste fenotípico positivo para produção de metallo-β-lactamase, sendo presuntivamente consideradas produtoras de MBL. Os dados obtidos, demonstram elevada produção de β-lactamases do tipo ampc e Metallo-β-lactamases. Foram também observadas elevadas taxas de resistência a antimicrobianos, especialmente em carbapenêmicos. Portanto conclui-se que a identificação de patógenos e a análise da resistência de microrganismos aos antimicrobianos constituem importante ferramenta para auxiliar os clínicos no tratamento de infecções. Palavras-Chave: Pseudomonas aeruginosa. Resistência. MBL. AmpC.

8 ABSTRACT The enhanced antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa is a remarkable example of how the bacteria can maintain and express the new genetic information conferring resistance to one or more drugs. In the present study we evaluated the profile of antimicrobial susceptibility in isolates of P. aeruginosa from three major Rio Grande do Norte state reference centers: Laboratory Dr. Almino Fernandes (LACEN- RN), Laboratory of Clinical Analysis of HUOL and Analysis Laboratory of Clinical Hospital Giselda Trigueiro (HGT). The isolates were obtained between January 2013 and June 2014, in which 113 strains were isolated from various clinical specimens by spontaneous demand. The species of P. aeruginosa was first recognized in home laboratories and confirmed by phenotypic tests, the Mycobacteria Laboratory (LABMIC) of the Federal University of Rio Grande do Norte - UFRN. The determination of antimicrobial susceptibility was given through the disk diffusion test. After determining the resistance profile, the samples were subjected to confirmatory phenotypic evaluation to beta lactamase producing AmpC type detection and Metallo Beta Lactamase. Of the 113 isolates 67.2% (n = 76) showed resistance profile of the at least one class of antimicrobials. All strains of P. aeruginosa were susceptible to Polymyxin B. The highest resistance rates were checked against the ofloxacin 57.5% (n = 65), Ciprofloxacin 55.7% (n = 63), Norfloxacin 55.7% (n = 63), Ticarcillinclavulanic acid 43.3% (n = 49) Ceftazidime 41.5% (n = 47), Meropenem 39.8% (n = 45), and Aztreonam Cefepime 38.9% (n = 44), Imipenem 36.2% (n = 41 ) Tobramycin 36.2% (n = 41), piperacillin-tazobactam 28.3% (n = 32) and amikacin 28.3% (n = 32). Of the 113 strains studied, 46 (40.7%) showed positive phenotypic results for the production of β-lactamases AmpC type of approach through the disk method. Fifty (44%) isolates showed resistance to at least one of the evaluated carbapenems, and these were subjected to phenotypic screening test for production Metallo Beta Lactamase - MBL, by blocking enzymatic test with discs combined with EDTA. Of the 50 samples with resistance to carbapenems, 21 (42%) showed positive phenotypic test for the production of metallo-β-lactamase producing considered presumptively with MBL. The data demonstrate high production of β-lactamases type ampc Metallo-and β-lactamase. It was also observed high antimicrobial resistance rates, especially carbapenems. Therefore it is concluded that early identification of pathogens and analysis of microorganisms to antimicrobial resistance constitute an important tool to assist clinicians in the treatment of infections. Keywords: Pseudomonas. Aeruginosa. Resistance. MBL. AmpC.

9 LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS Figura 1 - Mecanismo de ação das β-lactamases com serina no sítio ativo Figura 2 - Representação esquemática da disposição dos discos de antimicrobianos utilizados no teste fenotípico de detecção de AmpC Figura 3 - Representação esquemática da disposição dos discos de antimicrobianos utilizados no teste fenotípico de detecção de MBL Figura 4 - Método de disco aproximação para detecção fenotípica de betalactamases AmpC induzíveis Figura 5 - Amostras positivas para produção de MBL no teste fenotípico bloqueio enzimático com EDTA A) Imipenem e Imipenem + EDTA, Meropenem e Meropenem + EDTA e Aztreonam. B) Imipenem + EDTA e Imipenem... 42

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Distribuição de 113 amostras de P. aeruginosa de origem clínica, de acordo com o sítio de isolamento Tabela 2 - Distribuição da frequência de resistência a 13 antimicrobianos, de 113 amostras de P. aeruginosa, de acordo com os resultados do teste de disco difusão

11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REFERENCIAL TEÓRICO Gênero Pseudomonas Identificação e Características Bioquímicas Epidemiologia e prevalência das infecções por P. aeruginosa Potencial De Patogenicidade Fatores de virulência Resistência bacteriana aos antimicrobianos Alteração das PBP s Perda de porinas Sistema de efluxo Produção de Enzimas Inativadoras de Antimicrobianos Β-Lactamases β-Lactamases de Espectro Estendido (ESBL) Metallo-Β-Lactamase Ampc Produção De Enzimas Inativadoras De Aminoglicosídeos Resistência A Fluoroquinolonas Resistência À Polimixina OBJETIVOS Geral Específicos METODOLOGIA Características do estudo Local e período do estudo Confirmação da identificação dos isolados de P. aeruginosa Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos Detecção Fenotípica da produção de Beta-Lactamase do tipo Ampc Confirmação fenotípica da produção de Metallo-Beta-Lactamases (MBL) RESULTADOS... 40

12 5.1 Amostras bacterianas: fontes de isolamento Determinação do padrão fenotípico de resistência a antimicrobianos Detecção da produção de Β-Lactamases do tipo Ampc Produção de Metallo Β-Lactamase DISCUSSÃO CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS ARTIGO ANEXOS... 87

13 13 1 INTRODUÇÃO Os Bacilos Gram Negativos não Fermentadores (BGNNF) de carboidratos são organismos versáteis, apresentam baixa necessidade nutricional e boa tolerância a uma série de condições físicas adversas, devido a sua resistência intrínseca a desinfetantes, degermantes e múltiplas classes de antimicrobianos, além da resistência adquirida devido a mutações cromossômicas e aquisição de genes de resistência (POOLE, 2011). Considerados organismos oportunistas, raramente estão associados a infecções comunitárias em indivíduos saudáveis, porém apresentam alta prevalência de envolvimento em indivíduos imunossuprimidos, principalmente em ambiente hospitalar (ROSAY et al., 2015). Dentre as espécies de BGNNF, a Pseudomonas aeruginosa configura-se como a mais prevalente em isolados clínicos de natureza hospitalar. As infecções causadas por P. aeruginosa podem variar desde infecções superficiais de pele a septicemia grave, podendo causar infecção aguda pela produção de toxinas e infecção crônica pela ação da camada espessa que consiste no seu biofilme, podendo resultar ainda no somatório dos tipos de infecção pela ação concomitante destes componentes. São bactérias dotadas de mecanismos de virulência extremamente complexos (produção de leucocidinas, alginato, fosfolipases, etc.) que contribuem de forma positiva para um aumento crescente do número de agravos infecciosos principalmente no ambiente hospitalar (PIER et al., 2005). Descrito pela primeira vez em 1894, por Walter Friedrich August Emil Migula, botânico dedicado à taxonomia vegetal, o gênero Pseudomonas figura-se como um dos gêneros bacterianos mais variáveis e ubíquos, cujas espécies têm sido isoladas em diversos ambientes, desde a Antártica aos Trópicos, presentes no solo, sedimentos e água de rios e lagos, plantas, fungos e em amostras clínicas (PEIX, RAMÍREZ-BAHENA, 2009). As espécies que constituem esse gênero, com o decorrer do tempo, vêm passando por várias reclassificações e, atualmente, totalizam 128 espécies, sendo a Pseudomonas aeruginosa a principal espécie de interesse clínico e também um dos principais patógenos de infecção hospitalar (EUZÉBY, 2010). É notável o aumento da resistência aos antimicrobianos por P. aeruginosa, sendo

14 14 esse microrganismo um exemplo de como as bactérias podem manter e expressar novas informações genéticas que conferem resistência a uma ou a várias drogas (WALSH et al., 2008). Mecanismos de resistência intrínsecos ou adquiridos desempenham um papel crucial. A resistência a vários antibióticos por essa bactéria é, muitas vezes, resultante da combinação de uma baixa permeabilidade da membrana externa, a indução ou desrepressão de enzimas β-lactamases do tipo AmpC e super expressão intrínseca ou induzida de bombas de efluxo. (POOLE, 2011). Dentre os diferentes mecanismos de resistência desenvolvidos por espécies de P. aeruginosa a produção de enzimas beta-lactamases é o mecanismo mais importante. Penicilinas, cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenêmicos podem ser hidrolisados por este grupo de enzimas e a interação entre essas enzimas e seus substratos resultam em compostos inativos que permitem a sobrevida da célula bacteriana (BUSH, 2001). Entre as amostras de P. aeruginosa, a produção de AmpC, ESBLs (Beta-lactamases de espectro estendido) e as metallo-betalactamases desempenham papel importante na resistência à antimicrobianos utilizados para o tratamento de infecções causadas por estes agentes (JACOBY et al., 2005). Considerando a gravidade das infecções causadas por P. aeruginosa e da limitação de antimicrobianos disponiveis para eliminá-las, determinar o perfil de resistência dessa bactéria poderá contribuir para direcionar de forma adequada o uso de antimicrobianos. No estado do Rio Grande do Norte há poucos estudos relacionados a esse P. aaeruginosa, seus mecanismos de resistência, bem como a disseminação destes mecanismos. Trata-se de um estudo inédito a ser realizado no estado do RN, o qual serve como base, e evidencia a importância de conhecer presença de P. aeruginosa com padrões de resistência a fim de auxiliar a pratica clínica e de controlar a transmissão desta resistência no estado do Rio Grande do Norte.

15 15 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Gênero Pseudomonas Descrito em meados de 1894 por Migula, o gênero Pseudomonas é composto por bacilos Gram negativos não fermentadores de carboidratos. Esse grupo de microrganismos oportunistas coloniza plantas, animais e seres humanos (PALLERONI, 2003). Pseudomonas spp. são bastonetes Gram-negativos aeróbios não-formadores de esporos que apresentam-se retos ou ligeiramente curvos, medindo de 0,5 a 1,0 mm por 1,5-5,0 mm. Eles são geralmente móveis, com um ou vários flagelos polares, possuem um metabolismo respiratório estritamente aeróbio com o oxigênio como o receptor de elétrons, em alguns casos, o nitrato pode ser utilizado como aceitador de elétrons alternativo que permite o crescimento anaeróbio. A maioria das espécies de interesse clínico é oxidase positiva (exceto Pseudomonas luteola e Pseudomonas oryzihabitans). Pseudomonas spp. são catalase positiva (HENRY; SPEERT, 2011). A P. aeruginosa é nutricionalmente versátil, não necessitando de muitos fatores de crescimento orgânico. Cresce a 37 C e também a 42 C, mas não a 4 C (ZAVASCKI, 2005). O gênero Pseudomonas é o mais frequente entre isolados de BGNNF. A espécie P. aeruginosa representa em média 75% dos isolados de amostras clínicas, essa alta incidência pode ser justificada pelo fato desse microrganismo ser ubíquo e possuir predileção por ambientes úmidos, podendo ser encontrado no solo, matéria orgânica em decomposição, água e vegetais. Além disso, apresenta pouca exigência para o crescimento e grande versatilidade nutricional (KISKA ; GILLIGAN, 2003). P. aeruginosa é a principal espécie do gênero, e apresenta-se como citocromooxidase positiva e móvel com flagelo monotríquio polar. Além disso, produzem colônias características de morfologia variada, com ou sem odor característico (NEVES et al., 2011). Essa espécie bacteriana possui a capacidade de sintetizar diversos pigmentos hidrossolúveis, dentre esses podemos citar a pioverdina, piocianina, piorrubina e piomelanina. A pioverdina é um composto fluorescente também produzido por P. fluorescens e P. putida, já a piocianina é um pigmento azul fenazínico específico da P. aeruginosa, que quando combinado com a pioverdina

16 16 gera uma coloração verde brilhante característica. Os outros dois pigmentos citados são mais raros, sendo a piorrubina de cor vermelha e a piomelanina de coloração marrom (KISKA;GILLIAN, 2003; FREITAS;BARTH, 2004). Essas substâncias, cuja produção é favorecida por temperaturas abaixo de 37 C e na presença de ferro no meio, têm demonstrado possuir atividade antibiótica e efeito sobre a integridade do epitélio respiratório (TODAR, 2009; KONG et al., 2006) Identificação e Características Bioquímicas A identificação da P. aeruginosa é relativamente simples devido a sua facilidade em se desenvolver em diversos meios de cultura. P. aeruginosa possui crescimento aeróbico e não fermenta carboidratos. Entretanto, não é facilmente distinguível de outros bacilos Gram-negativos não fermentadores no exame direto. Possui um odor característico doce, semelhante à uva, que provém de suas colônias em meios de culturas, sendo essa uma característica específica da espécie aeruginosa. Se usado como base suas características bioquímicas, P. aeruginosa pode ser identificada por vários métodos automatizados. Em alguns casos esses sistemas não diferenciam as espécies não-aeruginosas, o que pode necessitar de diferentes oxidações de açúcares, crescimento a 42 C e coloração de flagelos (POLLACK, 2003; ZAVASCKI, 2005). A morfologia da colônia, produção de pigmentos e testes bioquímicos são alguns dos meios diagnósticos de rotina para identificação da P. aeruginosa. Essa bactéria é comumente isolada em meios de cultivo enriquecido, como ágar McConkey, ágar sangue e/ou meio seletivo e diferencial como o ágar pseudomonas e cetiltrimetil cloreto de amônio (cetrimide), ágar cetrimide é um meio específico para a P. aeruginosa devido à particularidade deste microrganismo resistir aos compostos de amônia quaternária, como o cetrimide (JACOME, 2012). A morfologia da colônia (Ex., O tamanho da colônia, atividade hemolítica, pigmentação, odor) e os resultados de uma variedade de testes bioquímicos rápidos (Ex., reação de oxidase positivo) são suficientes para a identificação preliminar de estirpes. A P. aeruginosa cresce rapidamente e formam colônias achatadas, com bordas irregulares, β-hemólise em ágar sangue, pigmentação verde relacionado à síntese de piocianina azul, fluoresceína amarelo, e um odor característico doce semelhante a uvas. (PALLERONI, 2003). Além disso, no processo de identificação,

17 17 realiza-se a coloração de Gram, e uma bateria de testes bioquímicos que tem como resultado: fermentação de açúcares negativa, oxidação da glicose em meio basal (oxidase positivo), utilização de citrato como única fonte de carbono (citrato positivo), inabilidade de descarboxilar a lisina (lisina negativo) e incapacidade de utilização do aminoácido triptofano (indol negativo) (WINN et al.,2008). Embora a identificação final de P. aeruginosa seja relativamente simples, uma vasta gama de parâmetros fisiológicos para identificar outras espécies do género Pseudomonas é necessária Epidemiologia e Prevalência das Infecções por P. aeruginosa. Segundo dados de programas de vigilância epidemiológica a partir de amostras de países da América Latina, Pseudomonas aeruginosa é o primeiro agente em pneumonias e encontra-se entre os cinco patógenos mais isolados em infecções de corrente sanguínea. (GALES et al.,2012). Uma grande variedade de doenças tem sido relacionada à P. aeruginosa, incluindo bacteremias, infecções de tecidos moles, doenças pulmonares, especialmente entre indivíduos portadores de fibrose cística, infecções urinárias nosocomiais, endocardites, infecções em decorrência de queimaduras ou trauma e, em alguns casos, pode acometer o sistema nervoso central, incluindo meningites (HENRY; SPEERT, 2011). O trato respiratório inferior é o sítio mais comum de infecção por esse agente. Dados do National Nosocomial Infection Surveillance (NNIS), nos EUA, de relatou P. aeruginosa como a segunda causa mais comum de pneumonia (18,1%), a terceira causa mais comum de infecção do trato urinário (16,3%) e o oitavo patógeno mais isolado da corrente sanguínea (3,4%) (GAYNES;EDWARDS, 2005). Embora a proporção global de infecções causadas por P. aeruginosa tenha se mantido estável durante , a proporção de isolados resistentes tiveram aumentos alarmantes em 2003 em comparação com 1998 e 2002 (NNIS, 2004). Além do trato respiratório, a P. aeruginosa, também está envolvida em infecções hospitalares do trato urinário, de queimados, de corrente sanguínea e de sítio cirúrgico. Na América Latina, é o terceiro patógeno mais isolado em infecções de pele (GALES et al., 2012) e é a segunda bactéria mais isolada de infecções nosocomiais de pele e tecidos moles (10,8%) na América do Norte (RENNIE; JONES; MUTNICK; 2003). No Brasil, é o segundo agente causador de infecções do trato urinário (12,6% dos casos), o segundo agente mais isolado em infecções de

18 18 sítio cirúrgico (10,5%) e o sexto (7,5%) em infecções de corrente sanguínea (SADER; GALES; PFALLER; 2001). Uma pesquisa realizada nos EUA entre 2003 e 2004, envolvendo 104 unidades de queimados, foi realizado um levantamento através de uma pesquisa quantitativa e qualitativa a partir de dados do sistema de vigilância nacional do país, além de entrevistas com especialistas do controle de infecção dos hospitais avaliados, onde 44% das instituições identificaram P. aeruginosa como o patógeno Gram-negativo mais prevalente, seguida por Acinetobacter baumannii e Enterococcus spp. (HODLE, et al., 2006). A elevada incidência de P. aeruginosa nas instituições de saúde contribuiu para o mau estado de saúde dos pacientes, principalmente devido à alta taxa de cepas resistentes a múltiplas drogas em enfermarias de hospitais, e ao uso prévio de antibióticos de largo espectro, que contribuíram com o aumento da resistência a antimicrobianos nesses microrganismos (OTTER et al., 2011 ). Embora as taxas variem entre os estudos e as instituições, a Pneumonia Associada a Ventilação (PAV) geralmente demonstra a maior mortalidade, cerca de 30% (WILLIAMS et al., 2010 ). Os pacientes com PAV muitas vezes sofrem de um epitélio rompido induzido pela inserção do tubo endotraqueal, que pode servir como um reservatório para P. aeruginosa a qual cresce em biofilme na superfície de plástico (WILLIAMS et al., 2010 ). Estes biofilmes são difíceis de remover, assim como as bactérias associadas ao biofilme exibem aumento da resistência aos antibióticos e desinfetantes. Isto, em parte, explica o êxito relativo dos regimes de tratamento com antibióticos que são iniciados antes da formação de biofilmes em comparação com a persistência de infecções por P. aeruginosa após o desenvolvimento do biofilme (GELLATLY e HANCOCK, 2013). A resistência a antimicrobianos de amplo espectro em isolados multidroga resistentes (MDR), limita significativamente as opções terapêuticas eficazes. Comumente, os agentes de último recurso para os organismos MDR incluem os aminoglicosídeos e as polimixinas. Diversos estudos evidenciaram que estes agentes podem ou não ser tão eficazes como agentes de primeira linha, mas também podem estar associados com efeitos adversos mais significativos (isto é, nefrotoxicidade, ototoxicidade e neurotoxicidade) (HARTZELL, et. al. 2009; LI, et al.,2006). Isso contribui para a dificuldade em avaliar se patógenos MDR estão realmente associados a piores desfechos clínicos. Dados clínicos sugerem que

19 19 infecções por P. aeruginosa MDR podem estar associadas a piores prognósticos, no entanto estas investigações são muitas vezes confundidas com definições variadas de resistência a múltiplas drogas (RIBERA et al., 2015) Potencial de Patogenicidade Pseudomonas aeruginosa é um agente patogênico oportunista, presente em muitas e diversas configurações ambientais e que pode ser isolado a partir de várias fontes vivas, incluindo plantas, animais e seres humanos. A capacidade de P. aeruginosa para sobreviver com as necessidades nutricionais mínimas e de tolerar uma variedade de condições físicas permitiu a este organismo persistir em ambos os contextos comunitários e hospitalares (LYCZAK et al.,2000).. No hospital, P. aeruginosa pode ser isolado a partir de uma variedade de fontes, incluindo equipamentos de terapia respiratória, antissépticos, sabão, pias, esfregões, medicamentos e piscinas de hidroterapia e fisioterapia. A sua adaptabilidade e alta resistência intrínseca aos antibióticos lhe permite sobreviver em uma ampla gama de regulações naturais e artificiais, incluindo as superfícies em instalações médicas. Em sua maioria, as infecções nosocomiais por P. aeruginosa são muitas vezes sérias, e quase todos são associados com as defesas do hospedeiro comprometidas, tais como neutropenia, em queimaduras graves, ou em casos de fibrose cística (LYCZAK et al.,2000). As opções terapêuticas são cada vez mais limitadas devido ao surgimento contínuo e disseminação de cepas resistentes aos antimicrobianos. Como resultado, infecções por P. aeruginosa apresentam alta morbidade e mortalidade. Nos Estados Unidos, P. aeruginosa está entre os patógenos hospitalares mais prevalentes e é o segundo patógeno mais frequentemente isolado de pacientes com pneumonia associada à ventilação mecânica (HIDRON et al.,. 2008). A patogênese do ponto de vista microbiológico está associada à capacidade invasiva e toxigênica dessa bactéria. Basicamente, o processo infeccioso da P. aeruginosa pode ser dividido em três fases: 1) adesão e colonização; 2) invasão local; e 3) disseminação e doença sistêmica. Nenhuma das fases se desenvolve sem que a anterior tenha ocorrido, embora o processo possa se limitar a qualquer uma delas (ZAVASCKI, 2005).

20 Fatores de Virulência P. aeruginosa é considerada a espécie mais virulenta dentre os bacilos Gram negativos não fermentadores como resultado da produção de uma grande variedade de fatores de virulência celulares e extracelulares. Dentre os fatores celulares se destacam os pilli, apêndices superficiais que promovem a aderência do microrganismo a receptores de gangliosídeo GM-1 presentes na superfície das células epiteliais do hospedeiro; os flagelos, que também participam da aderência; e a endotoxina (lipopolissacarídeo da parede celular; LPS); responsável pela síndrome séptica através da ativação e liberação de mediadores de vasodilatação, como interleucina 1 e fator de necrose tumoral, da ativação do complemento e da deflagração de coagulação intravascular disseminada, entre outros mecanismos (BALASUBRAMANIAN et al.,2013). No que concerne à invasão de tecidos por P. aeruginosa, é promovida pela produção de elastase, proteases alcalinas, hemolisinas (fosfolipase e lecitinase), citotoxinas (leucocidina), sideróforos com os seus sistemas de captação, e pigmento piocianina difusível. As elastases secretadas por P. aeruginosa clivam IgG, IgA, e proteínas do complemento. Além disso, as elastases rompem a integridade da barreira epitelial aos desregular junções de células epiteliais, interferindo com a depuração mucociliar. A elastase da P. aeruginosa também degrada proteínas surfactantes A e D (SP-A e SP-D), os quais têm um papel importante na imunidade inata (MARIENCHECK, et al.,2003). As proteases alcalinas promovem a lise da fibrina, interferindo com a formação de fibrina, e inativando proteínas de defesa do hospedeiro importantes, tais como anticorpos, proteínas do sistema complemento, IFN-γ, e citocinas. A leucocidina é uma proteína formadora de poros que tem efeitos citotóxicos nas células hospedeiras. Fosfolipase e lecitinase são hemolisinas que agem sinergicamente para quebrar lipídios e lecitina. Estas proteínas promovem a invasão e provocam efeitos citotóxicos nas células hospedeiras (BALASUBRAMANIAN et al.,2013). A maioria das estirpes de P. aeruginosa segregam piocianina (N-metil-1- hydroxyphenazine), o pigmento que dá cor azul-esverdeada para as colônias bacterianas. Altas concentrações de piocianina são detectados nas secreções pulmonares de pacientes com fibrose cística, onde exerce um efeito pró-inflamatório, perturba o epitélio brônquico, e prejudica a função ciliar. A piocianina também

21 21 interfere nas defesas antioxidantes do pulmão e facilita o dano oxidativo ao epitélio pulmonar através da inibição da atividade da catalase ( O MALLEY, et. al. 2003a; 2003b). P. aeruginosa pode causar dano tecidual direto e necrose, muitas vezes consequência da produção de exotoxina A. Exotoxina A é uma enzima de ribosilação de ADP (Adenosina Difosfato) excepcionalmente potente que entra nas células eucarióticas por endocitose mediada por receptor e catalisa a ribosilação do ADP inibindo o fator de alongamento do EF-2 na célula eucariótica. A consequência disso é a inibição da síntese de proteínas, em última análise conduzindo à morte celular (YATES, et. al. 2001). O Lipopolissacarídeo (LPS) é outro componente importante da P. aeruginosa e outras bactérias Gram-negativas. As cadeias antigênicas O-laterais de LPS foram a base dos sistemas de tipagem sorológicas, historicamente usados para estudos epidemiológicos em P. aeruginosa, antes dos métodos de tipagem genômicas estarem disponíveis. (ERNST ; MILLER, 2000). O LPS está associado com o aumento da imunogenicidade, embora deva notar-se que em P. aeruginosa é muito menos imunogênico e evoca uma resposta de citocinas mais modesta a partir de macrófagos em comparação com outras bactérias como Escherichia coli ou Salmonella (ERNST et al., 2000). A produção de alginato é outro mecanismo de virulência muito importante em P. aeruginosa, o qual trata-se de um polissacarídeo capsular que permite a aderência às superfícies epiteliais pulmonares com a formação de grandes conglomerados bacterianos, biofilme que protege a bactéria da ação dos antibióticos e do sistema imunológico do hospedeiro; este fator de virulência é hiperproduzido pelas cepas de P. aeruginosa e é responsável por infecções pulmonares em pacientes com fibrose cística (HEAD et al.,2004). 2.2 RESISTÊNCIA BACTERIANA AOS ANTIMICROBIANOS A resistência aos antibióticos, entre os vários gêneros bacterianos, representa um problema de saúde pública mundial. Para alguns estudiosos a situação atual caminha para o que foi vivenciado na era pré-antibiótico, uma vez que o surgimento

22 22 de novos recursos terapêuticos não acompanha a evolução dos mecanismos de resistência bacterianos (PATERSON, 2006). Os Bacilos Gram-negativos aeróbios, incluindo a família Enterobacteriaceae e BGNNF como a Pseudomonas e Acinetobacter spp, são as principais causas de infecções hospitalares A taxa de resistência aos antibióticos entre esses patógenos acelerou dramaticamente nos últimos anos e atingiu escala pandêmica. Já não é incomum encontrar infecções por bactérias Gram-negativas que são intratáveis por antibióticos convencionais em pacientes hospitalizados. (GALES et al., 2012). As mutações que conferem resistência a antibióticos para bactérias são evolutivamente antigas e difundidas na natureza, tendo surgido em resposta a pressões seletivas que antecedem a atividade humana (D COSTA et al., 2011; NESME et al.,2014). Estes mecanismos de resistência tem encontrado um nicho permissivo no ambiente hospitalar, em que uma alta densidade de pacientes suscetíveis, a intensa pressão seletiva para resistência aos antibióticos, e múltiplas oportunidades para a transmissão se cruzam. As taxas de resistência são mais altas na UTI por causa do uso excessivo de antibióticos, práticas de isolamento imperfeitas, e internamentos prolongados de pacientes que são altamente suscetíveis a infecções nosocomiais por causa de comorbidades e o uso de dispositivos de longa permanência, como sonda endotraqueal e nasogástrica, cateteres urinários, e cateteres centrais venosos (VINCENT et al.,2009). A propagação clonal de organismos resistentes entre as regiões geograficamente distantes adicionou um novo impulso para o aumento explosivo na resistência aos antibióticos nos últimos anos (CANTÓN et al.,2012; PETTY et al.,2014). Essa disseminação global da resistência antimicrobiana é alimentada pela falta de higiene e uso comum de antibióticos nos países em desenvolvimento, práticas veterinárias do uso excessivo de antibióticos em animais de corte para consumo humano, bem como a frequência das viagens internacionais (LANDERS et al.,2012; World Health Organization, 2014). Os bacilos Gram-negativos são a causa mais comum de infecções hospitalares e a causa mais comum de infecção na UTI (VINCENT et al.,2009) incluindo a maioria dos casos de pneumonia e infecções do trato urinário, infecções hospitalares e 25% a 30% de infecções do sangue e do sítio cirúrgico (ROSENTHAL et al. 2012; ZARB et al. 2012)

23 23 Um subconjunto de bacilos Gram-negativos, as Enterobacteriaceae, fazem parte da microbiota comensal normal do intestino humano e, no contexto de doença aguda, de forma assintomática, colonizam o trato aerodigestivo superior e da pele em pacientes hospitalizados e quase todos os indivíduos criticamente doentes. Uma vez estabelecidos como colonizadores, estes organismos causam infecções hospitalares por microaspiração ou devido a sua introdução em sítios estéreis. Além disso, as bactérias que colonizam são progressivamente substituídas por estirpes resistentes aos antibióticos na UTI (TABLAN et al. 2004). Os bacilos Gram-negativos possuem vários modos de resistência a antibióticos e são altamente eficientes em transferi-los horizontalmente entre as espécies. O aumento dramático na resistência a antibióticos entre bactérias Gram-negativas nas últimas décadas foi identificada pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças entre as ameaças mais importantes para a saúde humana em todo o mundo (Centers for Disease Control and Prevention, 2013). O aparecimento de resistência a múltiplas drogas tornou-se uma grande ameaça para o tratamento atual de infecções hospitalares causadas por P. aeruginosa em todo o mundo (MUDAU et al., 2013; MURAKI et al., 2013). As opções terapêuticas disponíveis para o tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa são limitadas a um pequeno número de compostos que pertencem a três grandes classes de antimicrobianos: β-lactâmicos anti-pseudomonas, fluoroquinolonas anti-pseudomonas e aminoglicosídeos (HONG et al, 2013). De acordo com o estudo de vigilância conduzido pela International Nosocomial Infection Control Consortium (INICC) em 36 países da América Latina, Ásia, África e Europa, 47,2% casos de P. aeruginosa isoladas foram relatadas como sendo resistentes a imipenem (ROSENTHAL et al., 2012 ). Da mesma forma, dois programas de vigilância na China, nomeados Surveillance by Etest and Agar Dilution of Nationwide Isolate Resistance (SEANIR) e Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends (SMART), informaram que 32,4% de P. aeruginosa isoladas no período de apresentaram resistência à ceftazidima ( XIAO et al., 2012 ). O SCOPE Brasil (Vigilância e Controle de patógenos de importância epidemiológica) constatou que 35,8%, 36,8% e 36,6% de P. aeruginosa isolados foram resistentes ao meropenem, imipenem e ceftazidima, respectivamente (MARRA et al., 2006 ). É bem sabido que a resistência antimicrobiana é um determinante importante que mantem

24 24 P. aeruginosa no ambiente hospitalar, mas os mecanismos de virulência deste microrganismo são muito importantes. (JIMENEZ et al., 2012 ). Em P. aeruginosa, podemos citar quatro principais mecanismos de resistência predominantes os quais podem estar sozinhos ou associados, são eles: mudança no sítio ativo das PBPs (Protein Bilding Penicilin), diminuição da expressão de porinas (Outer Membrane Proteins - OMPs), aumento da expressão de bombas de efluxo e produção de enzimas betalactamases (BABIC; HUJER; BONOMO, 2006) Alteração das PBP s As modificações em PBPs podem acontecer por mutações, hiperexpressão ou redução da afinidade. Todas essas modificações reduzem a atividade do antimicrobiano β-lactâmico na inibição da síntese da parede celular conferindo resistência a esses agentes. É um mecanismo muito importante em Gram-positivos como Streptococcus pneumoniae resistente à penicilina, e Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). Na maioria dos Gram-negativos a mutação em PBPs tem menor importância que os demais mecanismos (SAUVAGE et al.,2008) Perda de Porinas A diminuição da expressão de porinas (OprD) é um mecanismo de resistência prevalente em P. aeruginosa. Para acessar as PBPs no interior da membrana plasmática, os antibióticos devem se difundir na parede (o que é muito difícil, já que são moléculas pouco lipofílicas) ou atravessar canais chamados de porinas. Algumas bactérias apresentam resistência aos carbapenêmicos devido à perda destas OprD. A perda de porinas também está associada à resistência ao imipenem e meropenem em Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii (JACOBY; MILLS; CHOW, 2004; BABIC; HUJER; BONOMO, 2006). As mutações pontuais ou a presença de sequências de inserção nos genes que codificam as porinas podem produzir proteínas com função diminuída e, portanto, resultar em menor permeabilidade aos antimicrobianos. É importante ressaltar, no entanto que, apenas a deficiência da porina não é suficiente para produzir o fenótipo de resistência,

25 25 sendo normalmente encontrada combinada à produção de β-lactamases (POOLE, 2004B). A perda ou alteração da proteína de membrana OprD, ou porina, é considerado o mecanismo mais comum de resistência aos carbapenêmicos (incluindo imipenem) em P. aeruginosa (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al., 2009; WANG et al., 2010). Em comparação com a produção de enzimas do tipo MBL, esse mecanismo não é visto como promotor de alto nível de resistência, mas associado a outros mecanismos como super expressão de bombas de efluxo (GUTIERREZ et al.,2007;. RODRIGUEZ-MARTINEZ et al.,2009; TOMAS et al., 2010 ; WANG et al., 2010 ), ou produção de enzimas inativadoras de antibióticos, como AmpC, pode ser considerado como o principal determinante da resistência aos carbapenêmicos não mediada por beta-lactamases (GUTIERREZ et al., 2007; TOMAS et al., 2010; WANG et al., 2010) Sistema de efluxo Outro mecanismo de grande importância em Gram negativos não fermentadores, em especial P. aeruginosa, tem sido as bombas de efluxo, que atuam em conjunto com outros mecanismos de resistência e proporcionam altos níveis de resistência nessa espécie bacteriana. As bombas de efluxo são capazes de exportar uma grande variedade de substratos do periplasma para o meio ambiente. Essas bombas são um importante determinante da multirresistência em muitos microrganismos Gram-negativos, especialmente P. aeruginosa e Acinetobacter spp. e funcionam expulsando os antimicrobianos do espaço periplásmico para fora da célula, conferindo resistência à bactéria. (SHAHID et al.,2009). As Bombas de efluxo bacterianas foram classificados em cinco famílias, sendo elas a superfamília ATP-Binding Cassette (ABC) (Lubelski et al.,2007), a Major Facilitator Superfamily (MFS), (PAO et al.,1998), a família Multidrug and Toxic Compound Extrusion (MATE) ( (KURODA et al.,2009), a família Small Multidrug Resistance (SMR) (JACK et al.,2001), e a superfamília Resistance Nodulation Division (RND) (SEEGER et al. 2008) em especial, os exportadores de drogas pertencente à família RND desempenham um papel-chave na resistência

26 26 clinicamente relevante em bactérias Gram-negativas, que parecem ser os contribuintes mais significativos para a resistência antimicrobiana em P. aeruginosa (POOLE, 2004A, 2007 ). Em P. aeruginosa, o aumento da expressão do sistema de bombas de efluxo MexAMExB-OprD em combinação com a baixa permeabilidade de membrana externa pode resultar em redução da susceptibilidade a penicilinas e cefalosporinas, mas também a antimicrobianos de outras classes como quinolonas, tetraciclina e cloranfenicol. (DRAWZ et al.,2010) Produção de enzimas inativadoras de antimicrobianos β-lactamases Compostos β-lactâmicos são produzidos por diversos microrganismos presentes no solo e provavelmente sua produção pode representar uma vantagem competitiva pelo nicho ecológico. De modo análogo, a produção de β-lactamases pode representar uma vantagem adaptativa para garantir a integridade da parede celular e, portanto existe no ambiente, resultado de uma adaptação natural (DRAWZ et al.,2010). Não é surpresa, portanto, que a primeira β-lactamase a ser descrita tenha sido identificada em um isolado de E.coli mesmo antes do uso generalizado da penicilina na prática clínica (KIRBY, 1944). A origem dessa enzima parece estar relacionada com as próprias PBPs bacterianas, a partir de uma estrutura primordial e de um ponto de vista evolutivo, sugerindo que aquela proteína possa apresentar um ancestral comum com bactérias primitivas produtoras de antibióticos (HALL ; BARLOW, 2004). Hoje em dia, elas já estão amplamente distribuídas entre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e, configura como principal mecanismo de resistência em P. aeruginosa (LIVERMORE, 1995). Essas enzimas são codificadas por genes chamados bla, que podem estar presentes no cromossomo bacteriano ou em plasmídeos. A expressão dos genes bla pode ser induzida pela presença dos β-lactâmicos ou estar continuamente ativada. Assim, as β-lactamases podem estar presentes de forma induzível ou constitutiva (LIVERMORE, 1995).

27 27 O seu mecanismo de ação em Gram-negativos ocorre no espaço perliplasmático e se caracteriza pela hidrólise do anel β-lactâmico presente no núcleo estrutural das penicilinas, o ácido 6-aminopenicilâmico, provocando assim a formação do ácido peniciloíco que é desprovido de atividade antimicrobiana. (TAVARES, 2001). Primeiramente, a enzima associa-se de forma não covalente ao anel β-lactâmico do antimicrobiano. Então, o radical hidroxila livre do resíduo de serina presente no sítio ativo da enzima, ataca o anel β-lactâmico, formando uma ligação covalente acil-éster. A hidrólise do éster formado libera a enzima ativa e os antimicrobianos hidrolisados e inativos como mostra a FIGURA 1 (LIVERMORE, 1995). É importante ressaltar que algumas β-lactamases utilizam o zinco como cofator enzimático ao invés da serina. Entretanto a maioria age via éster de serina. De forma similar, ocorre com a hidrólise das cefalosporinas e dos carbapenêmicos. Figura 1. Mecanismo de ação das β-lactamases com serina no sítio ativo Fonte: Adaptado de LIVERMORE, β-lactamases de Espectro Estendido (ESBL) O primeiro isolado clínico, expressando ESBL, foi identificado por Knothe, na Alemanha, em 1983 em uma cepa de Klebsiella ozanae (KNOTHE et al.,1983). O gene responsável por esse fenótipo apresentava uma única mutação quando comparado à sequência da enzima SHV-1 (intrínseca a este gênero), o que aumentava consideravelmente seu espectro de ação, passando a ter a capacidade

28 28 de hidrolisar cefalosporinas de terceira geração; essa enzima foi denominada SHV-2 (KLIEBE et al.,1985). Atualmente, o número de ESBLs caracterizadas já passa de 500, e as pesquisas que as relatam têm origem em mais de 30 países do mundo, o que demonstra sua ampla distribuição (PATERSON, 2006; GNIADKOWSKI, 2008). As primeiras ESBLs descritas eram derivadas de β-lactamases do tipo SHV (primeiro caso descrito na literatura) e do tipo TEM, a partir de mutações em seu sítio ativo. Essas β-lactamases eram importantes apenas no ambiente hospitalar (BRADFORD, 2001). Da mesma forma, as ESBLs do tipo OXA são derivadas de OXA não ESBLs por mutações (NAAS; NORDMANN, 1999). A família CTX-M, no entanto, ao contrário das ESBLs citadas anteriormente, não são derivadas de β- lactamases de espectro restrito (LIVERMORE et al.,2007) e desde os seus primeiros relatos em 1989, vem ganhando cada vez mais importância, tornando-se endêmica em continentes como a América do Sul, Europa, Ásia e Oceania. (CÁNTON; COQUE, 2006). A grande parte das beta-lactamases de espectro ampliado (ESBL) encontramse enquadradas no grupo molecular A de Ambler (AMBLER, 1980; BARLOW, 2005), enquanto que na classificação funcional de Bush e Jacoby, a maioria está situada no grupo 2be. Estas enzimas são capazes de hidrolisar penicilinas, cefalosporinas (incluindo as de amplo espectro) e monobactâmicos, mas são ineficazes em relação aos inibidores de β-lactamases (clavulanato, tazobactam), carbapenêmicos e cefamicinas (cefoxitina e cefotetan). Todavia, a resistência as cefamicinas pode ocorrer em cepas produtoras de ESBL, quando houver uma diminuição de porinas de membrana reduzindo sua permeabilidade. (BUSH; JACOBY, 2010). Os carbapenêmicos, por sua vez, apresentam-se ineficazes quando existem mecanismos de resistência diferentes das ESBLs associados a elas ou quando o mecanismo de resistência for a produção de carbapenemases, enzimas que serão discutidas mais adiante (QUEENAN; BUSH, 2010). Já os inibidores de β- lactamases, mostram-se ineficientes quando enzimas conhecidas como IRT (TEM resistentes a inibidores), pertencentes ao grupo 2br de Bush e Jacoby, estão atuantes. As últimas emergiram do tipo TEM-1 e TEM-2, mas também são encontradas na família SHV devido a mutações que comprometeram a afinidade destas pelos inibidores de β-lactamases (BABIC; HUJER; BONOMO, 2006).

29 29 Muitas definições já foram atribuídas às β-lactamases de espectro estendido, mas a fim de simplificar esse conceito foi proposta uma definição durante a conferência ESCMIC (European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases), a qual, em suma, afirma que toda ESBL é uma β-lactamase, ordinariamente adquirida e na sua grande maioria, não inerente às espécies, as quais podem hidrolisar rapidamente, ou conferir resistência a oximino-cefalosporinas (não carbapenêmicos), ou uma β-lactamase mutante, dentro de uma família que tenha habilidade em fazê-lo. (LIVERMORE, 2008) Metallo-β-lactamase Beta-lactamases de classe B ou metallo-beta-lactamase (MBLs) são enzimas que requerem íon zinco como um co-factor de metal para a atividade como carbapenemase. Essas MBL são capazes de conferir resistência aos carbapenêmicos em uma ampla variedade de bactérias Gram-negativas (JACOBY, 2005; LEE, et al. 2008; WALSH, 2008; SIARKOU et al.,2009). A primeira MBL foi descrita em 1966, em um isolado de Bacillus cereus (KUWABARA; HUSSAIN et al.,1985). Devido sua facilidade de propagação, através de plasmídeos e sua capacidade de hidrolisar todos os beta-lactâmicos, com exceção do Aztreonam, essa enzima tem se tornado um sério problema de saúde pública, no Brasil e no mundo (SADER et al. 2005). Enzimas do tipo MBL, são um motivo de preocupação, porque elas são capazes de hidrolisar a maioria dos beta-lactâmicos, incluindo o imipenem e meropenem, consideradas drogas de reserva para o tratamento de estirpes Gramnegativas multirresistentes (MAGALHÃES et al., 2005; YAN et al. 2001). Além disso, as MBL são codificadas nos genes associados aos elementos móveis, uma condição que facilita a sua propagação entre diferentes espécies bacterianas e gêneros (MAGALHÃES et al. 2005; GALES et. al. 2003). Ultimamente, tem havido um aumento dramático na detecção e propagação de famílias adquiridas e transferíveis destas metallo enzimas (IMP, VIM, SPM, GIM, SIM e AIM) (FRANCO et. al. 2010). Cepas de P. aeruginosa produtoras de MBLs têm sido relatadas como causadoras de pequenos surtos nosocomiais (LAGATOLLA, et al. 2006). Diferentes tipos de MBL (IMP, VIM, SPM-1, GIM-1, 1-

30 30 SIM, NDM-1 e MIF-1) têm sido encontrados em P. aeruginosa (CORNAGLIA et al., 2011; POLLINI et al., 2013 ). As MBL possuem disseminação lenta, entretanto crescente, dentro dos hospitais, causando surtos e/ou situações hiperendêmicas em vários centros, principalmente no Extremo Oriente e no sul da Europa (TSAKRIS et al. 2009; LAGATOLLA, et al., 2006; PEÑA et al., 2007). Vários estudos identificaram fatores de risco para a aquisição de MBL, como distúrbios respiratórios, idade acima de 40 anos, tempo de internação maior que 20 dias e uso inadequado de antimicrobianos (HORIANOPOULOU et al., 2006; MARRA et. al. 2006) bem como o resultado de infecções causadas por P. aeruginosa produtores de MBL (LEE et al., 2004). O aumento da incidência de infecções nosocomiais por estirpes de P. aeruginosa possuindo MBL compromete severamente a seleção de tratamentos adequados e está, portanto, associada à significativa morbidade e mortalidade (TSAKRIS et al., 2000) AmpC As AmpC são serino beta-lactamases pertencentes a Grupo 1, segundo classificação de Bush-Jacoby-Medeiros (Bush-Jacoby-Medeiros, 1995), e de Classe C, de acordo com a classificação de Ambler (AMBLER et al., 1991). Elas também são chamadas cefalosporinases embora o seu espectro de ação hidrolítico não só inclua as cefalosporinas (JUAN et al.,2005). Certas Enterobacterias têm, naturalmente, beta-lactamases AmpC, como é o caso da Enterobacter spp., Providencia spp., Morganella morganii, Serratia marcescens, freundii Citrobacter e Hafnia (SUÁREZ et. al. 2006) bem como bacilos Gram-negativos não fermentadores de importância clínica como Pseudomonas aeruginosa (VILA; MARCO, 2002). A AmpC produzida pelos microrganismos supracitados são de natureza cromossômica induzível e explicam a resistência natural a aminopenicilinas, cefalosporinas de 1ª geração, cefamicinas (cefoxitina, cefotetan) e Aminopenicilinas combinado com inibidores de beta-lactamase (amoxicilina ácido clavulânico, ampicilina-sulbactam), expressa por estes agentes bacterianos (SUÁREZ et. al. 2006). E. coli, Shigella spp. e Acinetobacter baumannii, também possuem beta-lactamase AmpC cromossômica, porém constitutiva (não indutíveis) (VILA; MARCO, 2002). Por outro lado, há plasmídeos que codificam AmpC que pode ser induzível ou não (SCHMIDTKE;

31 31 HANSON, 2006). Uma característica das enzimas AmpC é que elas não têm efeito, por si só, contra cefalosporinas de 4ª geração, ou em carbapenems, sendo este último beta-lactâmicos de escolha em cepas produtoras de AmpC (PAI et al., 2004; PEREZ-PEREZ; HANSON, 2002) Além disso, AmpC não são inibidas pelos clássicos inibidores de beta-lactamase (ácido clavulânico, sulbactam, tazobactam) (PETROSINO, et. al. 2002), embora algumas possam ser inibida por sulbactam ou tazobactam (BUSH, et al.,1993). As enzimas tipo AmpC são um tipo de beta-lactamases que ao contrário das ESBLs não possuem atualmente um método padronizado pelo Standards Institute Laboratory (CLSI) para detecção fenotípica. Este fato, juntamente com a dificuldade para elucidar fenotipicamente se existe presença de uma AmpC cromossômica ou plasmidial, e a ausência de inibidores de AmpC para utilização in vivo, fazem considerar estas enzimas como um emergente problema terapêutico (MARTINEZ, 2009) Produção de enzimas inativadoras de aminoglicosídeos Os aminoglicosídeos são comumente utilizados no tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa (por exemplo, tobramicina, gentamicina, amicacina; BARTLETT, 2004), especialmente para tratamento de infecções pulmonares em pacientes com fibrose cística (FC), onde amicacina e, em particular, tobramicina são rotineiramente empregadas (TACCETTI et al.,2008). Seu uso é, no entanto, ligada ao desenvolvimento de resistência devido a produção de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (Modifying Enzymes Aminoglycosides - AMEs) e metilases rrna, além da elaboração de mecanismos de efluxo endógenas. (POOLE, 2005). A modificação do Aminoglicosídeo, que leva a inativação do antibiótico, normalmente envolve a fosforilação (por aminoglicosídeos fosforiltransferases, APHS), acetilação (por aminoglicosídeos acetiltransferases, AACS), ou adenilação (por aminoglicosídeos Nucleotidiltransferases, ANTs; aminoglicosídeo adeniltransferase, AAD). As AMEs são determinantes comuns de resistência a aminoglicosídeo em P. aeruginosa exceto em isolado de Fibrose cistica onde estes mecanismos são quase desconhecidos (HENRICHFREISE et al.,2007 ; ISLAM et al., 2009 ). Genes para AMEs são normalmente encontrados em integrons com

32 32 outros genes de resistência (POOLE, 2005 ; RAMIREZ E TOLMASKY, 2010 ) e, como tal, isolados AME são frequentemente multirresistente Resistência a Fluoroquinolonas As fluoroquinolonas (FQS), especialmente ciprofloxacina, são comumente utilizadas no tratamento de infecções por P. aeruginosa. A resistência a esses agentes é predominantemente mediada por mutações na DNA girase e Topoismerase IV, enzimas que são alvo das FQS, embora o sistema de efluxo contribua significativamente (JACOBY, 2005 ; DRLICA et al., 2009 ), muitas vezes em combinação com mutações no local alvo (HENRICHFREISE et al.,2007 ;. REJIBA et al.,2008 ;. TAM et al.,2010 ). A classe das FQ age nas topoisomerases bacterianas [topoisomerase II (aka gyrase) e topoisomerase IV], que são responsáveis pela introdução e/ou remoção de superenovelamento, bem como encadeamento/ desencadeamento de DNA e, assim, desempenham um papel essencial na replicação, transcrição, recombinação e reparação do DNA (DRLICA e ZHAO, 1997). Em bactérias Gram-negativas, a girase é o alvo preferido de FQS, dessa forma, mutações nesse sitio são comuns de ocorrer, além de mutações adicionais em topoisomerase IV, visto em alguns isolados altamente resistentes (JACOBY, 2005). A DNA-girase (GyrA e GyrB) e topoisomerase (ParC e pare) são, cada um, compostos por duas subunidades. Mutações que promovam resistência a FQ ocorrem tipicamente na chamada "região determinante de resistência à quinolona" (QRDR) de GyrA e/ou ParC (JACOBY, 2005 ;. DRLICA et al.,2009 ). Tais mutações são comuns em P. aeruginosa (LEE et al., 2005 ; MURAMATSU et al., 2005 ; HENRICHFREISE et al.,2007 ;. REJIBA et al., 2008 ) em isolados altamente resistentes que transportem mutações múltiplas em gyra e/ou parc (LEE et al.,2005 ; MURAMATSU et al.,2005 ), com mutações em gyrb (LEE et al.,2005 ; MURAMATSU et al.,2005 ; SCHWARTZ et al.,2006 ) e pare (LEE et al.,2005 ;. REJIBA et al.,2008 ), menos comum. Outro mecanismo de resistência comum a essa classe de antimicrobianos é a hiper expressão de bombas de efluxo. Quatro membros da família RND de sistemas de efluxo para múltiplos fármacos, MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-oprN, e MexXY-OprM são conhecidos por reconhecer e expulsar antibióticos da classe das

33 33 FQs (POOLE, 2000), consequentemente estes sistemas de efluxo estão intimamente relacionados com a resistência a FQ em isolados clínicos (POOLE, 2000; REINHARDT et al.,2007 ). Os plasmídeos também pode produzir diretamente resistência às fluoroquinolonas. Por muito tempo se pensou não existir resistência às FQs mediada por plasmídeo, até que foi descoberto, em um isolado clínico de K. pneumoniae no Alabama, um plasmídeo que poderia transferir resistência de baixo nível para quinolonas a E. coli e outras bactérias Gram-negativas (MARTÍNEZ- MARTÍNEZ; PASCUAL; JACOBY, 1998). O plasmídeo aumentou a MIC para todas as quinolonas testadas, com exceção da Coumermycin A1, uma quinolona inibidora de função da GyrB. Uma vez que o plasmídeo não afetou as concentrações intracelulares de quinolonas ou expressão de porina da membrana externa e porque continuava a aumentar a resistência em estirpes de E. coli com gyra, gyrb, Parc, ompf, ompc, ou Marr mutações, um novo mecanismo de resistência foi sugerido (MARTÍNEZ-MARTÍNEZ et al. 2003) Resistência à Polimixina Devido ao aumento da prevalência de P. aeruginosa multi-resistente, os antimicrobianos Polimixina B e colistina (também chamado de polimixina E), pertencente a uma família de antimicrobianos oligopeptideos cíclicos, voltaram a atuar como uma opção de tratamento de último recurso, embora estes agentes tenham efeitos colaterais fortes (por exemplo, nefrotoxicidade) com alta incidência (POOLE, 2011). Muito recentemente, as Concentrações de Prevenção de Mutantes (MPC) a polimixina para P. aeruginosa mostraram-se muito elevada ( 64 ng/ml), mesmo para isolados sensíveis (ou seja, com concentração inibitória mínima (MIC) intervalos de 1-2 mg/ml; CHOI e KO, 2013). Nos estudos de MPC, a mutação de resistência a polimixina aparentemente pode resultar de uma única mutação ( CHOI e KO, 2013 ). O mecanismo de ação das polimixinas envolve uma fase inicial de interação com o lipídio A do Lipopolissacarídeo (LPS), conduzindo à absorção auto-promovida de polimixinas através da membrana, seguido de morte celular (FERNANDEZ et al.,2013. ). O mecanismo mais comum de resistência à polimixina surge a partir da

34 34 modificação do lipídio LPS A com 4-amino- L -arabinose, um processo que tem sido observado tanto em mutantes selecionados in-vitro quanto em isolados de Fibrose cística ( MILLER et al.,2011. ; POOLE, 2011 ;. MOSKOWITZ et al.,2012 ). Tais alterações podem ser alcançados por meio de modificações covalentes do lipídio A do LPS por meio da adição de fosfoetanolamina (PETN) e modificação da 4-amino- 4-desoxi-L-arabinose (L-Ara4N), através da desacilação, hidroxilação e palmitoilação por PAgP (palmitoilação não contribuem para a resistência polimixina) (RAETZ et al.,2007 ). Outras estratégias incluem a utilização de uma bomba de efluxo e formação de cápsula (PADILLA et al., 2010 ). A modificação da L-Ara4N é a mais eficaz das duas modificações devido à natureza da alteração de carga. A carga positiva líquida resultante do LPS modificado reduz a sua ligação a polimixinas, conduzindo à resistência (OLAITAN et al. 2014).

35 35 3 OBJETIVOS 3.1 GERAL: - Avaliar o perfil de resistência a antimicrobianos de Pseudomonas aeruginosa isoladas em três centros de referência localizados na cidade do Natal/RN. 3.2 ESPECÍFICOS: - Identificar os principais sítios de isolamento das amostras de P. aeruginosa isoladas; - Determinar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos através do método de disco difusão; - Avaliar a presença de cepas produtoras de β-lactamases do tipo AmpC e Metalloβ-Lactamase.

36 36 4 METODOLOGIA 4.1 CARACTERÍSTICAS DO ESTUDO Trata-se de um estudo exploratório e descritivo, de abordagem quantitativa. No presente estudo foram avaliados 113 isolados de P. aeruginosa. Todos os isolados de P. aeruginosa utilizados foram provenientes de Centro de saúde, sendo previamente identificados de material clínico e encaminhados dos Laboratórios Dr. Almino Fernandes (LACEN-RN), Laboratório de Análises Clínicas do HUOL e Laboratório de Análise Clínicas do Hospital Giselda Trigueiro (HGT) ao Laboratório de Micobactérias (LABMIC), da Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN. O critério de inclusão utilizado nesse estudo foram a espécies bacterianas de P. aeruginosa. 4.2 LOCAL E PERÍODO DO ESTUDO As análises foram realizadas entre o período de Janeiro de 2013 a Junho de 2014 no Laboratório de Micobactérias (LABMIC) da UFRN. 4.3 CONFIRMAÇÃO DA IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS DE P. aeruginosa As amostras de Pseudomonas aeruginosa avaliadas neste estudo foram identificadas, inicialmente, nos laboratórios de origem. A partir da verificação da pureza das culturas foram feitas, em todas as amostras, testes fenotípicos confirmatórios de sua identificação no LABMIC. Os testes fenotípicos utilizados na identificação de P.aeruginosa incluíram: prova da oxidase, metabolismo OF-glicose, motilidade, produção de pigmento, descarboxilação dos aminoácidos lisina, arginina e ornitina, prova do indol, hidrólise da uréia, redução do nitrato, hidrólise da esculina, crescimento em Caldo NaCl 6,5%, crescimento a 42 C e utilização do citrato. Estes testes foram executados seguindo as recomendações de Koneman et al., (1997) As espécies foram repicadas para Ágar MacConkey (HIMEDIA, Pennsylvania, EUA) e incubadas por 18h a 35ºC em estufa bacteriológica.

37 37 A Cepa de P. aeruginosa ATCC foi utilizada como controle dos meios de cultura. Após a confirmação da espécie P. aeruginosa através das provas bioquímicas supracitadas, as amostras foram submetidas a Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA). 4.4 TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS O teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi realizado, na ocasião do isolamento das bactérias, no Laboratório de Micobactérias da UFRN, por disco de difusão, seguindo as recomendações, vigentes na época do isolamento, do Clinical and Laboratory Standard Institute 2013 (CLSI 2013). Para preparação de uma suspensão bacteriana com turvação aproximada de 0,5 na escala de McFarland (Dade Behring, MicroScan Turbidity Meter) foi feita uma suspensão de 2 a 5 colônias em solução de salina, e em seguida o semeio, em placas de Ágar Muller- Hinton. Após 10 minutos aplicaram-se os seguintes discos de antibióticos (13 discos por placa): Imipenem, Meropenem, Ticarcilina-Ácido Clavulânico, Cefepime, Ceftazidima, Piperacilina-Tazobactam, Amicacina, Tobramicina, Ciprofloxacina, Ofloxacina, Norfloxacina, Aztreonam e Polimixina B. Após incubação da placa, a 37 C por 18 horas, foram mensurados os diâmetros dos halos de inibição para cada antibiótico. Os resultados obtidos foram interpretados de acordo com o CLSI 2013/ DETECÇÃO FENOTÍPICA DA PRODUÇÃO DE BETA-LACTAMASE DO TIPO AMPC As amostras de P. aeruginosa foram submetidas à avaliação da produção de AmpC por meio do método de disco aproximação (DUNNE; HARDIN 2005) com antibióticos isolados e combinados conforme desenho esquemático na Figura 2. Em placas contendo meio de ágar Mueller-Hinton foram dispostos os discos, sendo o Imipenem (10µg) utilizado como indutor, e Ceftazidima (30µ), Piperacilina + Tazobactam (110/10µg), dispostos equidistantes de 20 a 25 mm do indutor

38 38 (distância medida de centro a centro). Depois de incubadas por 24 h a 37 C, é caracterizado como teste positivo a presença de um antagonismo entre o indutor e um dos substratos caracterizado pela forma de um D (MARTINEZ, 2009). Figura 2. Representação esquemática da disposição dos discos de antimicrobianos utilizados no teste fenotípico de detecção de AmpC * PIT= Piperacilina + Tazobactam, CAZ= Ceftazidima, IMP= Imipenem. 4.6 CONFIRMAÇÃO FENOTÍPICA DA PRODUÇÃO DE METALO-BETA- LACTAMASES (MBL) As bactérias que se mostraram resistentes a pelo menos um dos carbapenêmicos (Imipenem ou meropenem) foram submetidas ao teste confirmatório de MBL pelo método de bloqueio enzimático. Em uma placa de Ágar Mueller-Hinton HIMEDIA, Pennsylvania, EUA), seguindo a escala de turbidez 0,5 McFarland (Dade Behring, MicroScan Turbidity Meter), foi semeada a cepa suspeita por toda a extensão da placa, conforme padronizado pelo CLSI para realização do teste de sensibilidade aos antimicrobianos por disco difusão (CLSI 2014). Em seguida, dois discos, um com Meropenem (10µg) (OXOID) e outro com Imipenem (10µg) (OXOID), foram posicionados paralelos a outros dois discos de Meropenem (10µg) (OXOID) e Imipenem (10µg) (OXOID) ambos acrescidos de 10µL de EDTA (0,1M), seguindo

39 39 recomendações da Nota Técnica nº01/2013 da ANVISA. Os discos combinados com EDTA foram preparados no dia do teste e aplicados nas placas somente após sua secagem. Para interpretação, os halos de substrato com e sem EDTA foram comparados, em amostras produtoras de MBL é observado aumento do halo de inibição de crescimento da bactéria-teste na região do ágar onde ocorreu a difusão do EDTA, e o achado de diferença maior ou igual a 7 mm no halo de substrato/ EDTA em relação ao substrato sozinho foi considerado positivo para MBL (YAN et al., 2004). Já em testes negativos, não se espera alteração no halo de inibição de crescimento da bactéria testada. Figura 3. Representação esquemática da disposição dos discos de antimicrobianos utilizados no teste fenotípico de detecção de MBL. *IMP Imipenem, MPM - Meropenem

40 40 5 RESULTADOS 5.1 Amostras bacterianas: Fontes de isolamento Um total de 113 cepas de Pseudomonas aeruginosa foram caracterizadas à nível de espécie e susceptibilidade a antibacterianos no LABMIC-UFRN. A Tabela 1 mostra a distribuição das 113 P. aeruginosa avaliadas. Observou-se que 72 (63,7%) foram provenientes do trato respiratório inferior. Tabela 1. Distribuição de 113 amostras de P. aeruginosa de origem clínica, de acordo com o sítio de isolamento. Fonte de Isolamento n de amostras (%) Secreções¹ 72 (63,7%) Urina 24 (21,2%) Sangue 7 (6,1%) Líquidos de punção² 2 (1,7%) Ponta de cateter 2 (1,7%) Outros sítios³ 6 (5,3%) Total 113 (100%) ¹ Inclui: secreções de feridas, de drenos, oculares, de vesícula, de ouvido, intrabdominais, do trato respiratório inferior e outras. ² Inclui: Líquor ³ Inclui: Fragmento de pleura e raspado de lesão 5.2 Determinação do padrão fenotípico de resistência a antimicrobianos. A Tabela 2 mostra a frequência da resistência aos 13 antimicrobianos testados. As maiores taxas de resistência foram verificadas frente às Fluoroquinolonas. Todas as amostras avaliadas foram sensíveis a Polimixina B.

41 41 Tabela 2. Distribuição da frequência de resistência a 13 antimicrobianos, de 113 amostras de P. aeruginosa, de acordo com os resultados do teste de disco difusão. Classe de antimicrobianos Antimicrobianos n (%) de Amostras Resistentes Ofloxacina 65 (57,5%) Fluoroquinolonas Ciprofloxacina 63 (55,7%) Norfloxacina 63 (55,7%) β-lactâmico + Inibidor Ticarcilina Ácido Clavulânico 49 (43,3%) de β lactamase Piperacilina-tazobactam 32 (28,3%) Cefalosporinas de 3ª Ceftazidima 47 (41,5%) e 4ª Geração Cefepime 44 (38,9%) Carbapenêmicos Meropenem 45 (39,8%) Imipenem 41 (36,2%) Monobactâmico Aztreonam 44 (38,9%) Aminoglicosídeos Tobramicina 41(36,2%) Amicacina 32 (28,3%) Polimixina Polimixina B 0 (0%) 5.3 Detecção da Produção de β-lactamases do tipo AmpC O índice de positividade para produção de AmpC correspondeu a (40,7%, n=46) do total de 113 amostras testadas. Na figura 3 observa-se o resultado positivo apresentado por uma amostra de P. aeruginosa. Figura 4. Método de disco aproximação para detecção fenotípica de beta-lactamases AmpC induzíveis.

42 Produção de Metallo β-lactamase Das 113 amostras avaliadas neste estudo, 50 (44%) apresentaram resistência a, pelo menos, um dos carbapenêmicos pela técnica de disco difusão, e estas foram submetidas ao teste de detecção fenotípica para produção de MBL. Das 50 amostras com resistência a carbapenêmicos, 21 (42%) apresentaram teste fenotípico positivo para produção de metallo β-lactamase a partir do teste de bloqueio enzimático, sendo presuntivamente consideradas produtoras de MBL. A Figura 4 ilustra dois resultados positivos conforme observado no teste empregado para detecção de MBL. Figura 5. Amostras positivas para produção de MBL no teste fenotípico bloqueio enzimático com EDTA A) Imipenem e Imipenem + EDTA, Meropenem e Meropenem + EDTA e Aztreonam. B) Imipenem + EDTA e Imipenem

43 43 6 DISCUSSÃO O estudo avaliou o perfil fenotípico de cepas de P. aeruginosa além de caracteriza-la quanto à presença de dois dos principais mecanismos de resistência apresentados por essa bactéria. A maioria das amostras de P. aeruginosa estudadas foi isolada de espécimes de secreções, em grande parte proveniente do trato respiratório inferior e de urina. De um modo geral, estas são as fontes de isolamento mais frequentes, como verificado pelos estudos de Freitas e Barth (2004), analisando amostras isoladas de pacientes atendidos em hospitais de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, e por Santos Filho e colaboradores (2002), com amostras de origem comunitária e hospitalar isoladas em laboratórios clínicos da cidade de João Pessoa, na Paraíba. A resistência intrínseca de P. aeruginosa aos antimicrobianos é bem conhecida, mas a aquisição de novos mecanismos de resistência a antimicrobianos anti-pseudomonas, como constatado na rotina laboratorial, é um grande desafio. A alta mortalidade (48,1%) entre os pacientes com infecções por P. aeruginosa resistente aos carbapenêmicos pode ser reflexo da falta de opções de terapias antimicrobianas (ZAVASCKI et al.,2005). No presente estudo, todas as amostras isoladas foram avaliadas quanto à susceptibilidade aos antimicrobianos utilizando o teste de difusão em ágar. Entre os antibióticos testados, a Ciprofloxacina, Ofloxacina e Norfloxacina apresentaram as maiores taxas de resistência. Esses resultados apontam um alto índice de resistência a essa classe de antimicrobianos, e corroboram com estudos ao redor do mundo que apontam um crescimento da resistência as fluoroquinolonas. Um estudo prospectivo de quatro anos realizado por Omigie e colaboradores (2009) procurou determinar a incidência e taxa de desenvolvimento de resistência às fluoroquinolonas de patógenos comuns responsáveis por infecções do trato urinário na Nigéria. Os resultados evidenciaram elevada resistência às quinolonas entre estirpes de P. aeruginosa (43,4%), E. coli (26,3%), e Proteus spp. (17,1%). Durante os quatro anos do estudo, observou-se um aumento da resistência a estes antimicrobianos em P. aeruginosa (14,2%), Proteus spp. (8,8%) e E. coli (9.7%). Atualmente dois mecanismos diferentes são considerados principais determinantes da resistência às Quinolonas: mutação da DNA Girase/Topoisomerase IV, e alteração nos genes reguladores de bomba de

44 44 efluxo mexr e nfxb como os mecanismos mais comuns encontrados como promotores da resistência a essa classe de antimicrobianos (HOOPER, 1999). Um estudo realizado por Hu e colaboradores (2013) através da análise genômica de espécies de Pseudomonas resistentes a ciprofloxacina, utilizando pirosequenciamento 454, sugere que há três regiões no genoma da P. aeruginosa com alto potencial de variabilidade associada à resistência a ciprofloxacina. Somase a esses fatores, o uso em alta escala desses antimicrobianos no âmbito hospitalar, gerando uma pressão seletiva, e predispondo ao desenvolvimento de resistência a essa classe de antibióticos. Os β-lactâmicos associados aos inibidores de beta-lactamase, Piperacilina- Tazobactam e Ticarcilina-Ácido Clavulânico apresentaram taxas de resistência também elevadas, em especial a ticarcilina associada ao clavulanato. Para Piperacilina-Tazobactam, a taxa de resistência detectada nesse trabalho foi semelhante à encontrada por Soares (27,8%) em 2005 e Almeida (25%) em 2012 entre amostras isoladas no Rio de Janeiro e no estado do Pará, respectivamente, e ligeiramente inferior à detectada por Figueiredo et. al. (33,9%) em Para ticarcilina-ácido clavulânico, a taxa de resistência detectada neste trabalho foi semelhante à relatada por Soares (50,6%) em Porém bem inferiores à detectada por Almeida (91,6%), no ano de 2012, em 12 isolados de origem hospitalar em Belém do Pará. Um estudo retrospectivo, conduzido na China por Xu e colaboradores, realizado entre os anos de 2003 a 2011, demonstrou associação entre o uso de antimicrobianos e o desenvolvimento de resistência ao longo desse período. O estudo mostrou um aumento significativo, nas taxas de resistência de P. aeruginosa a Ticarcilina-ácido clavulânico de 18% e piperacilina-tazobactam de 36,2% no período de 2003 a 2011 (XU et. al., 2013). Os resultados discrepantes apresentados na classe dos β-lactâmicos associados aos inibidores de beta-lactamase, pode ser justificada pela melhor eficiência do tazobactam como inibidor de beta-lactamases em Gram-negativos, em relação ao clavulanato. Além disso, Beta-lactamases do tipo AmpC são enzimas que não sofrem a ação dos inibidores de beta-lactamases, especialmente ácido clavulânico, e seus genes são de origem cromossomal, no entanto podem

45 45 apresentar superexpressão induzível aumentando até cerca de 1000 vezes sua expressão quando na presença de antibióticos (MELETIS,BAGKERI, 2013). As taxas de resistência a ceftazidima e cefepime foram superiores às encontradas por Soares (2005) (31,9% e 33,3%, respectivamente) no Rio de Janeiro, e Carvalho (2004) (22,9% e 26,2%) em São Luís do Maranhão. Por outro lado, um estudo realizado no Recife/PE por Figueiredo et al., em 2007 mostraram taxas de resistência superiores (70% e 51,4%, respectivamente) às detectadas nesse estudo. Esses resultados apontam um alto índice de resistência em uma classe de antimicrobianos que não é considerada uma droga de primeira escolha, e segue recomendação de restrição no seu uso como medida de prevenção da disseminação de P. aeruginosa produtoras de metallo-beta lactamases (FIQUEIREDO et al., 2007). Fatores como a utilização inadequada dessa classe de antimicrobianos podem levar ao aumento de resistência por P. aeruginosa. Além disso, foi observada resistência à ceftazidima com sensibilidade à cefepime, o que pode, ao menos em parte, ser atribuído à produção de AmpC cuja ação é mais efetiva sobre a ceftazidima (LIVERMORE, 1995). Estas discrepâncias mostram que os resultados de resistência ou sensibilidade encontrados in vitro para uma destas cefalosporinas não podem ser extrapolados para a outra, sendo, portanto, necessário avaliar a susceptibilidade de ambos antimicrobianos. Outros mecanismos associados como a super expressão de bombas de efluxo e produção de enzimas como as MBL, também podem ser determinantes de resistência nessa classe de antimicrobianos (HONG et al., 2013). Em relação ao meropenem e imipenem, as taxas de resistência encontradas neste estudo foram semelhantes à detectada por Figueiredo e colaboradores (41,8% e 42,3%, respectivamente) em 2007, e Jacome (37,7% e 36%, respectivamente) em 2012, porém superiores às encontradas por Pires e colaboradores (20,7% e 18,2%) em Carbapenêmicos são drogas de última escolha para tratamento de infecções de P. aeruginosa, entretanto, devido ao uso indiscriminado desses antimicrobianos, há várias descrições de resistência a essas drogas em hospitais. Um estudo multicêntrico na América Latina observou diminuição da sensibilidade ao

46 46 meropenem em 53,8%, 46,7%, 33,3%, e 28,8% dos isolados da Argentina, Brasil, Chile, e México, respectivamente (GALES et al., 2012). P. aeruginosa pode adquirir resistência aos carbapenêmicos pela produção de carbapenemases, principalmente metallo-beta-lactamases e AmpC, que são bastante comuns nessa espécie bacteriana (LISTER et al., 2009). Além disso, outros mecanismos também podem estar envolvidos na resistência a essa classe de antimicrobianos, como a perda de porinas, OprD, ou super expressão de bombas de efluxo (FERNANDEZ;HANCOCK, 2012). Para o Aztreonam, obtivemos taxa de resistência de 38,9%, valor superior ao descrito por Soares (27,8%) em 2005, Pires et. al., (25,6%) em 2009 e Jacome (29,5%) em Por outro lado, outros autores reportam taxas de resistências em concordância com nosso estudo, podemos citar o estudo de Carvalho (37,9%) em 2004 e Figueiredo e colaboradores (40,2%) em Um dos principais mecanismos de resistência ao monobactâmico Aztreonam é a produção da cefalosporinase AmpC, outros mecanismos associados são, provavelmente, a hiper expressão de bombas de efluxo, combinado com o baixo número de porinas e a presença de poros muito pequenos, impedindo a passagem da droga para o interior da membrana (GALES et al.,2003). O perfil de resistência a amicacina, dos isolados avaliados, foi de (28,3%), demonstrando ser o antibiótico mais efetivo contra P. aeruginosa além da Polimixina B, que destacaremos mais adiante. Esse resultado é semelhante aos dados obtidos por Soares (2005) (32,1%) entretanto foram inferiores as encontradas por Pires et. al. (2009) (40,6%) e Figueiredo e colaboradores (2007) (44%). Na América do Norte, Hoban e colaboradores (2003) constataram que o antimicrobiano mais susceptível para a P. aeruginosa em seus estudos foi a amicacina com 93,7% de sensibilidade. Em relação à Tobramicina, a taxa de resistência foi de 36,2%, esse resultado está em concordância com estudos de Pires et. al. (2009) (38,9%) e Almeida (2012) (41,6%), mas superior à encontrada por Casal et. al. (2012) (4,58%), na Espanha e Bosso et al., (2013) (10%) nos EUA. Dentre os aminoglicosídeos, a amicacina é mais utilizada para infecções causadas por essa bactéria, porque, como foi observado, os isolado de P. aeruginosa que apresentaram resistência à amicacina exibem altos índices de resistência a outros aminoglicosídeos como a tobramicina (TORRES et al., 2000).

47 47 A resistência a aminoglicosídeos em P. aeruginosa está relacionada principalmente a inativação enzimática da molécula do antibiótico devido à produção de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos, a nucleotidiltransferase, fosfotransferase e acetiltransferases. Outros mecanismos também estão relacionados com a resistência a essa classe de antimicrobianos, são esses a redução da permeabilidade da membrana através diminuição de porinas na membrana da célula bacteriana, e modificação do sítio de ligação no ribossomo (POOLE, 2005). Todos os isolados deste estudo foram susceptíveis a polimixina B, assim como relatado em outros estudos (GALES et al.,2002; LOUREIRO et al.,2002), e, por esta razão, as polimixinas podem ser uma alternativa no tratamento contra P. aeruginosa multirresistentes, embora esses compostos sejam consideravelmente tóxicos. P. aeruginosa pode causar um grande número de falhas terapêuticas, e representa um desafio clínico significativo se esses mecanismos de resistência permanecem despercebidos. Portanto, a identificação precoce das infecções causadas por estes microrganismos é necessária para que o tratamento adequado possa reduzir a propagação destas cepas resistentes, bem como reduzir a mortalidade em pacientes hospitalizados. Isto enfatiza a necessidade de vigilância de isolados que produzem estas enzimas para evitar falhas terapêuticas e de surtos nosocomiais (KUMAR et al., 2012). O estudo evidenciou elevada taxa de produção de beta-lactamase da classe C de Ambler, AmpC (40,7%), corroborando estudos de outros autores (DUNNE E HARDIN, 2005; PARVEEN et al.,2010; KUMAR et. al., 2012). As beta-lactamases do tipo AmpC são cefalosporinases que são mal inibidas pelo ácido clavulânico. Elas podem ser diferenciadas de outras ESBLs pela sua capacidade de hidrolisar cefamicinas (cefoxitina, cefotetan), bem como outras cefalosporinas de amplo espectro (JACOBY, 2009). Embora as orientações atuais do CLSI não descrevam qualquer método para a detecção de isolados que produzem beta-lactamases AmpC, optou-se por seguir o método de disco aproximação (Imipenem/Ceftazidima/Piperacilna-Tazobactam) para detectar beta-lactamases AmpC.

48 48 Um estudo realizado por Dunne e colaboradores em 2005, avaliou a produção de AmpC em 200 amostras que incluíram Enterobacter spp., Serratia spp., Citrobacter spp., e Pseudomonas aeruginosa usando uma variedade de combinações de antibióticos indutor/substrato, semelhante ao realizado no estudo. As combinações examinadas incluíram cefoxitina-piperacilina, imipenem-cefotaxima, imipenem-ceftazidima, imipenempiperacilina-tazobactam, e imipenem-cefoxitina. No total, 85,5% dos isolados mostraram-se indutível para a produção de AMPc, por um ou mais combinações de indutores/substrato e 11% de todos os isolados foram estavelmente desreprimida para a expressão de AmpC. De todas as combinações, o imipenem/piperacilinatazobactam e imipenem/ceftazidima forneceram maior sensibilidade (100%) em P. aeruginosa, demonstrando ser um excelente método para detecção fenotípica da produção de AmpC nessa espécie bacteriana. A propagação global de bacilos Gram-negativos produtores de carbapenemases, como as metallo-β-lactamase, na última década é uma séria ameaça à saúde pública, e limitadas opções de tratamento estão disponíveis para tais infecções (PATEL; RASHEED; KITCHEL, 2009). A prevalência de MBLs, entre P. aeruginosa, é elevada em todo o mundo e é um problema significativo, que limita as opções terapêuticas para o tratamento de pacientes (MALTEZOU, 2009). A detecção rápida e precisa de mecanismos de resistência é essencial para determinar as medidas de terapia e controle de infecção antimicrobiana. P. aeruginosa produtoras de MBL têm sido relatadas como importante causa de infecções hospitalares. O aparecimento das MBL e sua disseminação entre bactérias patogênicas são questões de grande importância no que diz respeito ao futuro da terapêutica antimicrobiana (MARRA et al.,2006). A frequência de 44% na produção de MBL detectada neste estudo é superior às encontradas por Torres e colaboradores em Fortaleza (2003) de 9,4%, e Pellegrino e colaboradores (2002) em amostras isoladas em hospitais do Rio de Janeiro (18,5%), por Lee e colaboradores (2003) na Coréia (11,4%), por Lagatolla e colaboradores (2004) na Itália (20%) e Scheffer (2008), no Paraná. Os resultados apresentados no estudo são de extrema importância para que a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) possa aplicar medidas e cuidados para evitar a disseminação da resistência. A disseminação das linhagens de P. aeruginosa

49 49 produtoras de MBL no hospital exige atenção especial sendo importante observar se os cuidados para a prevenção de infecção estão sendo tomados, como a lavagem correta das mãos, uso de luvas esterilizadas e não-esterilizadas de maneira adequada, aplicação e manutenção correta de cateteres, cuidados pré-, intra- e pós operatórios e esterilização do instrumental hospitalar. Em razão dos inúmeros relatos de bactérias produtoras de MBLs em diferentes regiões do mundo, houve a necessidade de desenvolver testes simples, práticos e de baixo custo, para tornar possível o rastreamento de bactérias produtoras de MBLs nos laboratórios de rotina microbiológica. As MBLs necessitam de íons divalentes, como o Zn++, que funcionam como co-fator para a reação de hidrólise do b-lactâmico, portanto, estas enzimas podem ser identificadas por testes fenotípicos com auxílio de agentes quelantes de zinco, como o EDTA. Entre as metodologias possíveis, a técnica de disco-combinado vem se mostrando efetiva na detecção de MBL, assim como demonstrado por Young e colaboradores em 2002 em amostras de P. aeruginosa, utilizando discos de imipenem + EDTA com 95,7% de sensibilidade especificidade. Outro estudo realizado por Tsakris e colaboradores em 2010, demonstrou 100% de sensibilidade e especificidade utilizando discos de meropenem + EDTA. É importante destacar que todas as amostras produtoras de MBL foram isoladas em um período curto, de janeiro de 2013 a junho de 2014, em três laboratórios avaliados, indicando possivelmente um evento de caráter pontual, sendo necessário prosseguir com novas avaliações verificar tendência à disseminação de estirpes com tal característica. Estudos nacionais (SADER et al., 2001; FREITAS;BARTH, 2004; LOUREIRO et al., 2002; PELLEGRINO et al., 2002) e internacionais (FLUIT et al., 2001; MATHAI et al., 2001; PFALLER et al., 2001) têm demonstrado isolados de P. aeruginosa com elevadas taxas de resistência aos antimicrobianos e a emergência de alguns multirresistentes. Entretanto, no estudo, foi observada uma taxa de 9,7% de resistência simultânea a 12 dos 13 antimicrobianos testados. Outros estudos encontraram taxas menores ou semelhantes de resistência simultânea, 3,2% em Hospitais de Porto Alegre (FREITAS; BARTH, 2004) e de 10% em Hospitais da Grécia (TASSIOS et al., 1998), enquanto Pellegrino e colaboradores (2002)

50 50 detectaram um elevado percentual de resistência simultânea em 5 hospitais do Rio de Janeiro (40%). A alta resistência simultânea aos antibióticos testados aponta um perfil de multirresistência e limita as opções terapêuticas elevando as taxas de morbimortalidades em hospitais. P. aeruginosa possui resistência intrínseca a várias classes de antimicrobianos, aliado a isso, vários mecanismos de resistência já foram descritos como a super expressão de bombas de efluxo, produção de enzimas inativadoras de antibióticos, diminuição de porinas, além de vários fatores de virulência como produção de biofilmes, liberação de exotoxinas e produção de piocianina, dentre outros fatores que dificultam a terapia antimicrobiana. A utilização indiscriminada ou inadequada de antimicrobianos parece favorecer a seleção de microrganismos multirresistentes (ALOUSH et al., 2006). Dados da literatura descrevem relação significativa entre utilização prévia de antimicrobianos e desenvolvimento de multirresistência (LODISE et al., 2007a). A exemplo disto, Paramythiotou et al. (2004) relataram uso prévio de drogas antipseudomonas como importante fator de risco para o desenvolvimento de cepas multirresistentes. No estudo, apenas a polimixina B manteve-se ativa contra todos os isolados resistentes aos carbapenêmicos. Vários estudos descrevem esta droga como única opção terapêutica para alguns isolados multirresistentes (GALES et al.,2003; SADER et al.,2005; ZAVASCKI et al.,2005). Entretanto, o aumento da descrição de amostras resistentes à polimixina B é proporcional ao aumento da sua utilização na rotina, principalmente em UTIs (LANDMAN et al.,2005). Vale salientar ainda que P. aeruginosa possui resistência intrínseca a vários antibióticos além da habilidade de adquirir novos genes de resistência, como os que conferem para as MBLs, assim como possuem constitutivamente beta-lactamases do tipo AmpC, características essas que tornam as infecções causadas por essas bactérias praticamente intratáveis. Além disso, P. aeruginosa são bactérias que geralmente causam infecção oportunista, em pacientes que já possuem a saúde debilitada sendo, desta maneira, muito importante conhecer quais beta-lactamases estão presentes no hospital. Os resultados obtidos revelaram um perfil de resistência em P. aeruginosa, bem como dois dos principais mecanismos de resistência associados a esse

51 51 microrganismo. É sabido que essa bactéria é o principal não-fermentador responsável por infecção hospitalar, e que adapta-se rapidamente a condições ambientais diversas (HILL; HENRY; SPEERT, 2007). Com isso, estudos dessa natureza tornam-se cada vez mais importantes para identificar mecanismos de resistência disseminados no hospital, para que assim possam ser implantadas medidas de vigilância mais adequadas para conter a disseminação destas bactérias.

52 52 7 CONSIDERAÇÕES FINAIS As cepas de P. aeruginosa avaliadas nesse trabalho mostraram que esse microrganismo é mais frequentemente encontrado em isolados de secreção e de urina. O padrão fenotípico de resistência das amostras analisadas mostrou altas taxas de resistência, principalmente a fluoroquinolonas, seguida por beta-lactâmicos associados aos inibidores de β-lactamases, cefalosporinas e carbapenêmicos. Também foi observada uma alta frequência na detecção de enzimas do tipo AmpC e metallo-β-lactamases, resultado esse que chama a atenção, visto que esses mecanismos de resistência inviabilizam diversas terapias antimicrobianos e dificultam o tratamento de infecções causadas por esse patógeno. A partir dos dados obtidos conclui-se que, muito embora a compreensão sobre P. aeruginosa ao longo do tempo tenha avançado, esta bactéria continua a ser um flagelo em hospitais, causando infecções virulentas e devido a sua capacidade de desenvolver resistência as mais variadas classes de antimicrobianos, torna-se muito difícil o tratamento de pacientes acometidos. Os resultados evidenciam a importância da detecção de mecanismos de resistência como a produção de beta-lactamases, assim como o estabelecimento de critérios para utilização de antibióticos a fim de minimizar os riscos de desenvolvimento de resistência. Trata-se de um estudo pioneiro no Estado do Rio Grande do Norte que de certa forma servirá como base para estudos mais aprofundados no que refere à resistência a antimicrobianos em espécies de P. aeruginosa. A identificação precoce de patógenos e a análise da resistência de microrganismos aos antimicrobianos constituem importante ferramenta para auxiliar os clínicos no tratamento de infecções. Dessa forma, conhecer o perfil de susceptibilidade aos antibióticos de P. aeruginosa pode nortear a escolha de terapia empírica. Além disso, o conhecimento dos mecanismos de resistência deste agente, presentes em cada instituição é de extrema importância para conter a disseminação de microrganismos multirresistentes reduzindo morbi-mortalidade de pacientes internados em nossos hospitais.

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72 ARTIGO Título do Artigo: Perfil de Resistência de Cepas de Pseudomonas aeruginosa em três Centros de Saúde do Estado do RN *Jenielly N. F¹. Castro, Renato M. Neto¹ 1 Laboratório de Micobactérias, Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal , RN-Brasil * Autor correspondente: Jenielly de Noronha Ferreira de Castro Tel.: jenielly@hotmail.com

73 73 Resumo No presente estudo avaliou-se o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos em isolados de P. aeruginosa provenientes de três grandes centros de referência do Estado do Rio Grande do Norte. A espécie de P. aeruginosa foi identificada inicialmente nos laboratórios de origem e confirmada, através de testes fenotípicos, no Laboratório de Micobactérias (LABMIC) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN. A determinação da susceptibilidade aos antimicrobianos deu-se através do Teste de Disco Difusão. Do total de 113 isolados 67,2% (n = 76) apresentaram perfil de resistência a, pelo menos, uma classe de antimicrobianos. Todas as cepas de P. aeruginosa foram susceptíveis a Polimixina B. As maiores taxas de resistência foram verificadas frente à Ofloxacina (57,5%), Ciprofloxacina (55,7%), Norfloxacina (55,7%), Ticarcilina-ácido clavulânico (43,3%), Ceftazidima (41,5%). Quarentas e seis isolados (40,7%) apresentaram resultados fenotípicos positivos para produção de β-lactamases do tipo AmpC. Vinte e um isolados apresentaram teste fenotípico positivo para produção de metallo-β-lactamase, através do teste de bloqueio enzimático com discos combinados com EDTA, sendo presuntivamente consideradas produtoras de MBL. Os dados obtidos, demonstram elevada produção de β-lactamases do tipo ampc e Metallo-βlactamases. Também foi observada elevada taxa de resistência a antimicrobianos, especialmente em quinolonas e carbapenêmicos. Este estudo confirma que a identificação precoce de patógenos e a análise da resistência de microrganismos aos antimicrobianos constituem importante ferramenta para auxiliar os clínicos no tratamento de infecções. Palavras-Chave: Pseudomonas aeruginosa. Resistência. MBL. AmpC.

74 74 INTRODUÇÃO Os Bacilos Gram Negativos não Fermentadores (BGNNF) de carboidratos são organismos versáteis, apresentam baixa necessidade nutricional e boa tolerância a uma série de condições físicas adversas, devido a sua resistência intrínseca a desinfetantes, degermantes e múltiplas classes de antimicrobianos, além da resistência adquirida devido a mutações cromossômicas e aquisição de genes de resistência (POOLE, 2011). Considerados organismos oportunistas, raramente estão associados a infecções comunitárias em indivíduos saudáveis, porém apresentam alta prevalência de envolvimento em indivíduos imunossuprimidos, principalmente em ambiente hospitalar (ROSAY et al., 2015). Dentre as espécies de BGNNF, a Pseudomonas aeruginosa configura-se como a mais prevalente em isolados clínicos de natureza hospitalar. As infecções causadas por P. aeruginosa podem variar desde infecções superficiais de pele a septicemia grave, podendo causar infecção aguda pela produção de toxinas e infecção crônica pela ação da camada espessa que consiste no seu biofilme, podendo resultar ainda no somatório dos tipos de infecção pela ação concomitante destes componentes. São bactérias dotadas de mecanismos de virulência extremamente complexos (produção de leucocidinas, alginato, fosfolipases, etc.) que contribuem de forma positiva para um aumento crescente do número de agravos infecciosos principalmente no ambiente hospitalar (PIER et al., 2005). Considerando a gravidade das infecções causadas por P. aeruginosa e da limitação de antimicrobianos disponíveis para eliminá-las, determinar o perfil de resistência dessa bactéria poderá contribuir para direcionar de forma adequada o uso de antimicrobianos. Na região Nordeste do Brasil, estudos sobre resistência bacteriana em BGNNF são escassos e não se conhece quais formas de resistência são mais frequentes em P. aeruginosa. No estado do Rio Grande do Norte essa limitação é ainda maior, com poucos estudos relacionados a esse patógeno, seus mecanismos de resistência, bem como a disseminação destes mecanismos. Trata-se de um estudo inédito a ser realizado no estado do RN, o

75 75 qual serve como base, e evidencia a importância de conhecer presença de P. aeruginosa com padrões de resistência a fim de auxiliar a pratica clínica e de controlar a transmissão desta resistência no estado do Rio Grande do Norte. O objetivo desse trabalho foi avaliar o perfil de resistência a antimicrobianos e produção de β-lactamases do tipo AmpC e Metallo-β-Lactamase de Pseudomonas aeruginosa, em três centros de referência localizados na cidade do Natal/RN

76 76 MATERIAIS E MÉTODOS Trata-se de um estudo exploratório e descritivo, de abordagem quantitativa. Neste estudo foram avaliados 113 isolados de P. aeruginosa. Todos os isolados de P. aeruginosa utilizados nesse estudo foram provenientes de Centro de saúde, sendo previamente identificados de material clínico e encaminhados dos Laboratórios Dr. Almino Fernandes (LACEN-RN), Laboratório de Análises Clínicas do HUOL e Laboratório de Análise Clínicas do Hospital Giselda Trigueiro (HGT) ao Laboratório de Micobactérias (LABMIC), da Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN. O critério de inclusão utilizado nesse estudo foram a espécies bacterianas de P. aeruginosa. O estudo não se enquadra no que normatiza a resolução 196-CNS. Não necessitando ser revisada por um comitê de ética em pesquisa. As análises foram realizadas entre o período de Janeiro de 2013 a Junho de 2014 no Laboratório de Micobactérias (LABMIC) da UFRN. As amostras de Pseudomonas aeruginosa avaliadas neste estudo foram identificadas, inicialmente, nos laboratórios de origem. A partir da verificação da pureza das culturas foram feitas, em todas as amostras, testes confirmatórios de sua identificação no LABMIC. Os testes fenotípicos usuais utilizados na identificação de BGNNF incluíram: prova da oxidase, metabolismo OF-glicose, motilidade, produção de pigmento, descarboxilação dos aminoácidos lisina, arginina e ornitina, prova do indol, hidrólise da uréia, redução do nitrato, hidrólise da esculina, crescimento em Caldo NaCl 6,5%, crescimento a 42 C e utilização do citrato. Estes testes foram executados seguindo as recomendações de Koneman et al., (1997) As espécies foram repicadas para Ágar MacConkey (HIMEDIA, Pennsylvania, EUA) e incubadas por 18h a 35ºC em estufa bacteriológica. Para cada cepa foi realizado teste confirmatório do padrão fenotípico de multirresistência segundo recomendações do CLSI A Cepa de P. aeruginosa ATCC foi utilizada como controle dos meios de cultura. Após a confirmação da espécie P. aeruginosa através das provas bioquímicas, as amostras foram submetidas a Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA).

77 77 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos O teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi realizado, na ocasião do isolamento das bactérias, no Laboratório de Micobactérias da UFRN, por disco de difusão, seguindo as recomendações, vigentes na época do isolamento, do Clinical and Laboratory Standard Institute 2013 (CLSI 2013). Para preparação de uma suspensão bacteriana com turvação aproximada de 0,5 na escala de McFarland (Dade Behring, MicroScan Turbidity Meter) foi feita uma suspensão de 2 a 5 colônias em solução de salina, e em seguida o semeio, em placas de Ágar Muller-Hinton. Após 10 minutos aplicaram-se os seguintes discos de antibióticos (13 discos por placa): Imipenem, Meropenem, Ticarcilina-Ácido Clavulânico, Cefepime, Ceftazidima, Piperacilina-Tazobactam, Amicacina, Tobramicina, Ciprofloxacina, Ofloxacina, Norfloxacina, Aztreonam e Polimixina B. Após incubação da placa, a 37 C por 18 horas, foram mensurados os diâmetros dos halos de inibição para cada antibiótico. Os resultados obtidos foram interpretados de acordo com o CLSI 2013/2014. Detecção fenotípica da produção de beta-lactamase do tipo AMPC As amostras de P. aeruginosa foram submetidas à avaliação da produção de AmpC por meio do método de disco aproximação (DUNNE ; HARDIN 2005) com antibióticos isolados e combinados conforme desenho esquemático na Figura 2. Em placas contendo meio de ágar Mueller-Hinton foram dispostos os discos, sendo o Imipenem (10µg) utilizado como indutor, e Ceftazidima (30µ), Piperacilina + Tazobactam (110/10µg), dispostos equidistantes de 20 a 25 mm do indutor (distância medida de centro a centro). Depois de incubadas por 24 h a 37 C, é caracterizado como teste positivo a presença de um antagonismo entre o indutor e um dos substratos caracterizado pela forma de um D (MARTINEZ, 2009).

78 78 Figura 6. Representação esquemática da disposição dos discos de antimicrobianos utilizados no teste fenotípico de detecção de AmpC * PIT= Piperacilina + Tazobactam, CAZ= Ceftazidima, IMP= Imipenem. Confirmação fenotípica da produção de Metalo-beta-lactamases (MBL) As bactérias que se mostraram resistentes a pelo menos um dos carbapenêmicos (Imipenem ou meropenem) foram submetidas ao teste confirmatório de MBL pelo método de bloqueio enzimático. Em uma placa de Ágar Mueller-Hinton HIMEDIA, Pennsylvania, EUA), seguindo a escala de turbidez 0,5 McFarland (Dade Behring, MicroScan Turbidity Meter), foi semeada a cepa suspeita por toda a extensão da placa, conforme padronizado pelo CLSI para realização do teste de sensibilidade aos antimicrobianos por disco difusão (CLSI 2014). Em seguida, dois discos, um com Meropenem (10µg) (OXOID) e outro com Imipenem (10µg) (OXOID), foram posicionados paralelos a outros dois discos de Meropenem (10µg) (OXOID) e Imipenem (10µg) (OXOID) ambos acrescidos de 10µL de EDTA (0,1M), seguindo recomendações da Nota Técnica nº01/2013 da ANVISA. Os discos combinados com EDTA foram preparados no dia do teste e aplicados nas placas somente após sua secagem. Em amostras produtoras de MBL é observado aumento do halo de inibição de crescimento da bactéria-teste na

79 79 região do ágar onde ocorreu a difusão do EDTA. Já em testes negativos, não se espera alteração no halo de inibição de crescimento da bactéria testada. Figura 7. Representação esquemática da disposição dos discos de antimicrobianos utilizados no teste fenotípico de detecção de MBL. *IMP Imipenem, MPM Meropenem

80 80 RESULTADOS E DISCUSSÃO Um total de 113 amostras de Pseudomonas aeruginosa foram identificadas no LABMIC-UFRN. A caracterização fenotípica desses isolados, obtida através da realização do TSA, permitiu avaliar a susceptibilidade aos antibióticos de diferentes classes. Mais da metade das amostras foi isolada de secreções 72 (63,7%), a maioria proveniente do trato respiratório inferior. Seguida por amostras de urina 24 (21,2%) e, em menor proporção de sangue 7 (6,1%), ponta cateter 2 (1,7%), líquidos de punção 2 (1,7%) e de outros espécimes variados 6 (5,3%). No presente estudo, todas as amostras isoladas foram avaliadas quanto à susceptibilidade aos antimicrobianos utilizando o teste de difusão em ágar. Entre os antibióticos testados, Ofloxacina 57,5% (n= 65), Ciprofloxacina 55,7% (n = 63), Norfloxacina 55,7% (n=63) apresentaram as maiores taxas de resistência. Esses resultados indicam um alto índice de resistência a essa classe de antimicrobianos, e corroboram com estudos ao redor do mundo que apontam um crescimento da resistência as fluoroquinolonas (OMIGIE et al., 2009; HU et al., 2013). Atualmente dois mecanismos diferentes são considerados principais determinantes da resistência às Quinolonas: mutação da DNA Girase/Topoisomerase IV, e alteração nos genes reguladores de bomba de efluxo mexr e nfxb como os mecanismos mais comuns encontrados como promotores da resistência a essa classe de antimicrobianos (ADABI et al., 2015). Um estudo realizado por Hu e colaboradores (2013) através da análise genômica de espécies de Pseudomonas resistentes a ciprofloxacina, utilizando pirosequenciamento 454, sugere que há três regiões no genoma da P. aeruginosa com alto potencial de variabilidade associada à resistência a ciprofloxacina. Soma-se a esses fatores, o uso em alta escala desses antimicrobianos no âmbito hospitalar, gerando uma pressão seletiva, e predispondo ao desenvolvimento de resistência a essa classe de antibióticos. Os β-lactâmicos associados aos inibidores de beta-lactamase, Piperacilina-Tazobactam 28,3% (n= 32) e Ticarcilina-Ácido Clavulânico 43,3% (n= 49) apresentaram taxas de resistência também elevadas, em especial a ticarcilina associada ao clavulanato. Esse resultado pode ser justificado pela

81 81 melhor eficiência do tazobactam como inibidor de beta-lactamases em Gramnegativos, em relação ao clavulanato. Além disso, Beta-lactamases do tipo AmpC são enzimas que não sofrem a ação dos inibidores de beta-lactamases, especialmente ácido clavulânico, e seus genes são de origem cromossomal, no entanto podem apresentar superexpressão induzível aumentando até cerca de 1000 vezes sua expressão quando na presença de antibióticos (MELETIS,BAGKERI, 2013). As cefalosporinas Ceftazidima 41,5% (n= 47), e Cefepime 44% (n= 38,9) também demonstraram alta taxa de resistência. Esses resultados apontam um alto índice de resistência em uma classe de antimicrobianos que não é considerada uma droga de primeira escolha, e segue recomendação de restrição no seu uso como medida de prevenção da disseminação de P. aeruginosa produtoras de metallo-beta lactamases (FIQUEIREDO et al., 2007). Fatores como a utilização inadequada dessa classe de antimicrobianos podem levar ao aumento de resistência por P. aeruginosa. Outros mecanismos associados como a super expressão de bombas de efluxo e produção de enzimas como as MBL e AmpC, também podem ser determinantes de resistência nessa classe de antimicrobianos (HONG et al., 2013). Em relação ao carbapenêmicos, as taxas de resistência encontradas neste estudo foram de 39,8% (n = 45) para o Meropenem e 36,2% (n= 41) para o Imipenem. P. aeruginosa pode adquirir resistência aos carbapenêmicos pela produção de carbapenemases, principalmente metallo-beta-lactamases e AmpC, que são bastante comuns nessa espécie bacteriana. Além disso, outros mecanismos também podem estar envolvidos na resistência a essa classe de antimicrobianos, como a perda de porinas, OprD, ou super expressão de bombas de efluxo (FERNANDEZ;HANCOCK, 2012). Carbapenêmicos são drogas de última escolha para tratamento de infecções de P. aeruginosa, entretanto, devido ao uso indiscriminado desses antimicrobianos, há várias descrições de resistência a essas drogas em hospitais. Um estudo multicêntrico na América Latina observou diminuição da sensibilidade ao meropenem em 53,8%, 46,7%, 33,3%, e 28,8% dos isolados da Argentina, Brasil, Chile, e México, respectivamente (GALES et al., 2012). Para o Aztreonam, obtivemos taxa de resistência de 38,9% (n=44). Um dos principais mecanismos de resistência ao monobactâmico Aztreonam é a

82 82 produção da cefalosporinase AmpC, outros mecanismos associados são, provavelmente, a hiper expressão de bombas de efluxo, combinado com o baixo número de porinas e a presença de poros muito pequenos, impedindo a passagem da droga para o interior da membrana (RUPPE et al., 2015). O aminoglicosídeo amicacina apresentou a menor taxa de resistência nesse estudo 28,3% (n=32), já em relação à Tobramicina, a taxa de resistência nesse estudo foi de 36,2% (n=41). Observa-se uma elevada resistência a essa classe de drogas, em especial a amicacina, que apesar de demonstrar o menor percentual de resistência entre os antibióticos testados, ainda é considerada elevada, principalmente se tratando de um fármaco que por anos é apontado como um dos antibióticos com boa eficácia contra P. aeruginosa. Entretanto, uma análise univariada realizado por Trigueros e colaboradores (2015) aponta a exposição prévia à amicacina (<3 dias), está relacionada a aquisição de resistência piperacilina-tazobactam, fluroroquinolonas e múltiplas drogas. A resistência a aminoglicosídeos em P. aeruginosa está relacionada principalmente a inativação enzimática da molécula do antibiótico devido à produção de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos, a nucleotidiltransferase, fosfotransferase e acetiltransferases. Outros mecanismos também estão relacionados com a resistência a essa classe de antimicrobianos, são esses a redução da permeabilidade da membrana através diminuição de porinas na membrana da célula bacteriana, e modificação do sítio de ligação no ribossomo (RUPPE et al., 2015). Todos os isolados deste estudo foram susceptíveis a polimixina B e, por esta razão, as polimixinas podem ser uma alternativa no tratamento contra P. aeruginosa multirresistentes, embora esses compostos sejam consideravelmente tóxicos. O presente estudo evidenciou elevada taxa de produção de betalactamase da classe C de Ambler, AmpC (40,7%). As beta-lactamases do tipo AmpC são cefalosporinases que são mal inibidas pelo ácido clavulânico. Elas podem ser diferenciadas de outras ESBLs pela sua capacidade de hidrolisar cefamicinas (cefoxitina, cefotetan), bem como outras cefalosporinas de amplo espectro (TIAN et al, 2011). Essa alta taxa de produção de AmpC pode ser o fator determinante da elevada resistência aos antimicrobianos apresentados

83 83 nesse estudo, em especial cefalosporinas, penicilinas associadas a inibidores de beta-lactamases e monobactâmicos. Embora as orientações atuais do CLSI não descrevam qualquer método para a detecção de isolados que produzem beta-lactamases AmpC, seguimos o método de disco aproximação (Imipenem/Ceftazidima/Piperacilna- Tazobactam) para detectar beta-lactamases AmpC e obtivemos resultados satisfatórios neste estudo. Cinquenta amostras (44%) apresentaram resistência a, pelo menos, um dos carbapenêmicos, e estas foram submetidas ao teste de detecção fenotípica para produção de MBL. Das 50 amostras com resistência a carbapenêmicos, 21 (42%) apresentaram teste fenotípico positivo para produção de metallo β- lactamase a partir do teste de bloqueio enzimático, sendo presuntivamente consideradas produtoras de MBL. Os resultados apresentados no presente estudo são de extrema importância para que a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) possa aplicar medidas e cuidados para evitar a disseminação da resistência. A disseminação das linhagens de P. aeruginosa produtoras de MBL no hospital exige atenção especial sendo importante observar se os cuidados para a prevenção de infecção estão sendo tomados, como a lavagem correta das mãos, uso de luvas esterilizadas e nãoesterilizadas de maneira adequada, aplicação e manutenção correta de cateteres, cuidados pré-, intra- e pós operatórios e esterilização do instrumental hospitalar

84 84 CONCLUSÃO As cepas de P. aeruginosa avaliadas nesse trabalho mostraram que esse microrganismo é mais frequentemente encontrado em isolados de secreção e de urina. O padrão fenotípico de resistência das amostras analisadas mostrou altas taxas de resistência, principalmente a fluoroquinolonas, seguida por betalactâmicos associados aos inibidores de β-lactamases, cefalosporinas e carbapenêmicos. Também foi observada uma alta frequência na detecção de enzimas do tipo AmpC e metallo-β-lactamases, resultado esse que chama a atenção, visto que esses mecanismos de resistência inviabilizam diversas terapias antimicrobianos e dificultam o tratamento de infecções causadas por esse patógeno. Os resultados apresentados nesse estudo evidenciam a importância da detecção de mecanismos de resistência como a produção de beta-lactamases, assim como o estabelecimento de critérios para utilização de antibióticos a fim de minimizar os riscos de desenvolvimento de resistência. Nosso estudo é pioneiro no Estado do Rio Grande do Norte e servirá como base para estudos mais aprofundados no que refere à resistência a antimicrobianos em espécies de P. aeruginosa. A identificação precoce de patógenos e a análise da resistência de microrganismos aos antimicrobianos constituem importante ferramenta para auxiliar os clínicos no tratamento de infecções. Dessa forma, conhecer o perfil de susceptibilidade aos antibióticos de P. aeruginosa pode nortear a escolha de terapia empírica. Além disso, o conhecimento dos mecanismos de resistência deste agente, presentes em cada instituição é de extrema importância para conter a disseminação de microrganismos multirresistentes reduzindo morbi-mortalidade de pacientes internados em nossos hospitais.

85 85 REFERÊNCIAS ADABI M, et al. Spread of Efflux Pump Overexpressing-Mediated Fluoroquinolone Resistance and Multidrug Resistance in Pseudomonas aeruginosa by using an Efflux Pump Inhibitor. Infection & Chemotherapy. [S.I.];47(2): AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANTITÁRIA. Nota técnica nº 01/2013: medidas de prevenção e controle de infecções por enterobactérias multiresistentes. Brasília, Disponível em: < fbd/microsoft+word++nota+t%c3%89cnica+enterobacterias %281%29.pdf?MOD=AJPERES>. Acesso em: 20 out COBOS-TRIGUEROS N,, et al. Acquisition of Pseudomonas aeruginosa and its resistance phenotypes in critically ill medical patients: role of colonization pressure and antibiotic exposure. Critical Care. [S.I.];19(1):218. doi: /s DUNNE WM, HARDIN DJ. Use of Several Inducer and Substrate Antibiotic Combinations in a Disk Approximation Assay Format To Screen for AmpC Induction in Patient Isolates of Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp.,citrobacter spp., and Serratia spp. Journal of Clinical Microbiology. [S.I.];43(12): , FERNANDEZ L, HANCOCK RE. Adaptive and mutational resistance: role of porins and efflux pumps in drug resistance. Clin Microbiol Rev. [S.l.], 25(4): FIGUEIREDO E.A.P, et al. Pseudomonas aeruginosa: Freqüência de resistência a múltiplos fármacos e resistência cruzada entre antimicrobianos no Recife/PE. Rev Bras Ter Intensiva [S.l.], 19: , GALES AC, et al. Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli isolated from Latin America: results from SENTRY Antimicrobial Surveillance ProGram (Latin America, ). Diagn Microbiol Infect Dis. [S.l.], 73(4):354-60, HONG M., HSU D., BOUNTHAVONG M. Ceftolozane/tazobactam: a novel antipseudomonal cephalosporin and β-lactamase-inhibitor combination. Infect. Drug Resist., [S.I.] 6, pp , 2013.

86 86 HU H.C., et al. Comparative Genome Analysis of Ciprofloxacin-Resistant Pseudomonas aeruginosa Reveals Genes Within Newly Identified High Variability Regions Associated With Drug Resistance Development. Microbial Drug Resistance [S.l.], 19(6): , KONEMAN E W, et al. Fifth edition. In: Color atlas and textbook of diagnostic microbiology. [S.I.]Lippincott. Philadelphia, MARTINEZ D. V. Betalactamasas tipo AmpC. Generalidades y métodos para detección fenotípica. Rev Soc Ven Microbiol. [S.l.];29: , MELETIS, G.; BAGKERI, M. Pseudomonas aeruginosa : Multi-Drug-Resistance Development and Treatment Options. Infection Control, [S.l.]; p , OMIGIE, O., et al. Increasing resistance to quinolones: a four-year prospective study of urinary tract infection pathogens. International Journal of General Medicine, [S.l.]2, , POOLE K. Pseudomonas aeruginosa: resistance to the max. Front. Microbiol. [S.l.]; 2: /fmicb , ROSAY, T., et al. Pseudomonas aeruginosa Expresses a Functional Human Natriuretic Peptide Receptor Ortholog: Involvement in Biofilm Formation. mbio, [S.l.]; 6(4), e , RUPPE É, WOERTHER P-L, BARBIER F. Mechanisms of antimicrobial resistance in Gram-negative bacilli. Annals of Intensive Care. [S.I.];5: TIAN G.B, et al., PME-1, an extended-spectrum β-lactamase identified in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother.[S.I.]. 55:

87 87 ANEXOS Anexo I - Descrição dos meios de cultura empregados na identificação de Pseudomonas aeruginosa. Ágar Citrato Simmons Princípio: Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono, juntamente com sais de amônia, alcalinizando o meio. Utilidade: Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores. Base para Oxidação e Fermentação - OF Princípio: Verificar a capacidade do microrganismo em utilizar os carboidratos pela via oxidativa ou fermentativa. Utilidade: Diferenciar bacilos Gram negativos quanto ao tipo de metabolismo empregado em utilizar carboidratos. Caldo Base de Moeller (Aminoácidos) Princípio: As descarboxilases são um grupo de enzimas com substrato específico, capazes de reagir com o grupo carboxila dos aminoácidos para formarem aminas alcalinas. Utilidade: Verificar a capacidade de microrganismos usarem enzimas, auxiliando na identificação. Utilizado principalmente para identificações de enterobactérias, bacilos Gram negativos não fermentadores, estafilococos.

88 88 Provas para Crescimento a 42 C Princípio: Verificar a capacidade do microrganismo crescer em altas temperaturas. Utilidade: Identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores. Prova de tolerância ao NaCl 6,5% Princípio: A tolerância ao NaCl a 6,5% é uma prova utilizada para verificar a capacidade de alguns microrganismos crescerem em presença do sal. Utilidade: Na identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores. Teste de motilidade Princípio: A bactéria é móvel através do seu flagelo. Flagelos ocorrem nos bacilos Gram negativos, poucas formas de cocos são móveis. Utilidade: Determinar se o microrganismo é o não móvel; Ágar TSI Triplo Açúcar Ferro Princípio: Este meio contém três açúcares: 0,1%glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol para detecção da fermentação de carboidratos e sulfato de ferro para detecção da produção de sulfato de hidrogênio (indicado pela cor preta na base do tubo).

89 89 Utilidade: Diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentação de carboidratos, produção de sulfato de hidrogênio e gás. Prova de Gelatinase Princípio: Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolíticas (gelatinases) que liquefaz/hidrolisa gelatina. Utilidade: Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e bacilos Gram positivos esporulados.