Comunicado 171 Técnico

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1 Comunicado 171 Técnico ISSN Novembro, 2011 Fortaleza, CE Ilustração: Hilton César Rodrigues Magalhães Otimização da Extração de Compostos Voláteis por Microextração em Fase Sólida em Headspace: Exemplo da Aguardente de Cana Deborah dos Santos Garruti 1 Talita Macedo dos Santos 2 Bruna Lima Gomes 3 Hilton César Rodrigues Magalhães 4 Introdução A aguardente de cana é o destilado mais consumido no país e ocupa o segundo lugar entre as bebidas alcoólicas, ficando atrás somente da cerveja. A aguardente de cana produzida exclusivamente no Brasil é denominada cachaça (BRASIL, 2002) e possui características sensoriais peculiares. O aroma e sabor de um alimento ou bebida são determinadas por compostos voláteis como álcoois, ésteres, ácidos graxos, aldeídos e outros, que estão presentes em pequenas quantidades (THOMAZINI; FRANCO, 2000). As diferentes classes químicas de compostos da aguardente de cana já vêm sendo estudadas há algum tempo (NASCIMENTO et al., 1997; NASCIMENTO et al., 1998; BOSCOLO et al., 2000; CARDOSO et al., 2003), porém antes do trabalho de Janzantti (2004) não existia, na literatura, um estudo sobre o perfil de voláteis dessa bebida, abrangendo todas as classes químicas presentes. Para tanto, a autora desenvolveu um método para análise dos voláteis da aguardente por meio de extração em fase sólida, onde a amostra líquida é passada através de um polímero (Lichrolut) que retém os compostos voláteis, posteriormente eluídos com metanol. O método mostrou-se simples e rápido, obtendo um extrato com aroma representativo da amostra original. A microextração em fase sólida (SPME solid phase microextraction) também é um método bastante prático, fácil e rápido, além de ser livre de solventes (PAWLISZYN et al., 1997; KATAOKA et al., 2000). SPME é uma técnica de preparação de amostra, isenta de solvente, que integra extração e concentração de compostos voláteis em uma fibra de sílica fundida recoberta por polímero, um sólido adsorvente ou uma combinação dos dois, numa única etapa de extração (ALPENDURATA, 2000). A técnica é constituída basicamente de duas etapas: extração dos voláteis pela fibra e transferência do material da 1 Engenheira de Alimentos, D. Sc. em Ciência de Alimentos, pesquisadora da Embrapa Agroindústria Tropical, Rua Dra. Sara Mesquita, 2.270, Pici, CEP , Fortaleza, CE, deborah@cnpat.embrapa.br. 2 Engenheira de Alimentos, mestranda da Universidade Federal do Ceará (UFC). 3 Farmacêutica, mestranda da Universidade de São Paulo (USP). 4 Farmacêutico-Bioquímico, analista da Embrapa Agroindústria Tropical, Fortaleza, CE.

2 2 Otimização da Extração de Compostos Voláteis por Microextração em Fase Sólida em Headspace: Exemplo da Aguardente de Cana fibra para o injetor do cromatógrafo, para a análise cromatográfica. Segundo Valente e Augusto (2000), as seguintes condições de análise devem ser otimizadas para cada tipo de amostra: Seleção do modo de extração As opções são extração direta e extração no headspace (espaço vazio acima da amostra em um recipiente fechado). A SPME direta não se aplica a matrizes aquosas contendo particulados e matrizes sólidas, enquanto que a SPME no headspace é indicada para analitos de média e alta volatilidade. Seleção do tipo e espessura da fibra As sugestões gerais de uso para as fibras comercialmente disponíveis indicadas pelo fabricante são úteis como ponto de partida, mas devem ser conferidas experimentalmente. Deve-se determinar qual fibra extrai maior quantidade dos analitos e se sofre influência de fatores como umidade, por exemplo. Seleção da técnica de agitação A otimização do modo (agitação magnética, movimentação circular do frasco, sonicação, etc.) e da velocidade de agitação é fundamental para abreviar o tempo de extração. Adição ou não de sal à amostra A saturação da matriz com cloreto de sódio diminui a solubilidade de compostos hidrofóbicos na fase aquosa, favorecendo a extração dos analitos. Esse efeito é conhecido como salting-out. Otimização do volume do headspace e tempo de equilíbrio O volume do headspace vai influenciar o tempo necessário para a formação de um equilíbrio entre a fase sólida/líquida da matriz e a fase gasosa. Otimização da temperatura de extração O aumento da temperatura do sistema aumenta a volatilização dos compostos, facilitando sua saída da matriz e reduzindo o tempo necessário para atingir o equilíbro. No entanto, alguns produtos como frutas in natura, possuem compostos voláteis extremamente termolábeis ou suscetíveis a rearranjos, ciclizações e outras reações químicas decorrentes do aumento de temperatura, resultando num perfil de voláteis diferente de sua composição original (FRANCO, 2003). Otimização do tempo de exposição da fibra (adsorção) Após a formação do equilíbrio no headspace o amostrador de SPME é inserido no frasco e a fibra é exposta para adsorver os compostos presentes na fase de vapor. Nessa fase, deve-se determinar o tempo necessário para atingir a condição de saturação da fibra. Otimização do tempo de dessorção Com a fibra colocada no centro da zona aquecida do injetor, usando-se um liner de pequeno diâmetro interno, determina-se o tempo necessário para completar a dessorção dos compostos adsorvidos na fibra e sua transferência para a coluna cromatográfica. O objetivo deste trabalho foi apresentar um exemplo do desenvolvimento sistemático de um método de SPME para extração dos voláteis do headspace, com a aguardente de cana, bem como da determinação das condições para sua análise por cromatografia gasosa. Procedimento Experimental Para a realização dos testes, utilizou-se uma única garrafa de aguardente comercial. Uma alíquota de 10 ml foi transferida para um frasco de 40 ml, âmbar, selado com septo de teflon para a introdução da fibra. Os compostos foram separados em cromatógrafo Varian 3380, com hidrogênio como gás de arraste (1,5 ml/min), injetor a 250 C no modo splitless e detector FID a 250 C. Foram estudados os seguintes parâmetros: Tipo de fibra (PDMS/DVB; PDMS/DVB/CAR; DVB/CAR). Coluna cromatográfica (DB-5 e Carbowax), padrão interno e programação da temperatura da coluna. Diluição da amostra (10%, 20% e 40% de etanol). Níveis de agitação (com e sem). Concentração de NaCl (0% e 30% p/v). Temperatura de extração (25 o C e 50 o C). Tempo de equilíbrio para formação do headspace (0 a 60 min); Tempo de exposição da fibra (5 a 35 min). Os critérios de escolha da melhor condição de extração foram número de picos e contagem de área total do cromatograma. Os resultados foram submetidos à ANOVA e teste de Tukey para comparação das médias, utilizando o programa SAS.

3 Otimização da Extração de Compostos Voláteis por Microextração em Fase Sólida em Headspace: Exemplo da Aguardente de Cana 3 Resultados Inicialmente foram testadas as fibras DVB/CAR e PDMS/DVB, sendo escolhida esta última, a qual apresentou número de picos e área total do cromatograma estatisticamente maiores. Assim todo o experimento foi realizado com a PDMS/DVB. Ao final desse experimento, tínhamos mais uma fibra disponível no laboratório (PDMS/DVB/CAR) a qual foi testada contra a PDMS/DVB, mostrando desempenho superior. Na Figura 1 são apresentados os cromatogramas obtidos com as duas colunas testadas. Observase que a Carbowax apresentou maior resolução, sendo então escolhida para a análise dos voláteis de aguardente. O padrão interno escolhido foi 3-octanol (1 g/l em etanol), sendo adicionados 10 µl na alíquota de 10 ml de amostra. Essa quantidade foi suficiente para que o pico do padrão interno apresentasse altura intermediária em relação aos demais picos do cromatograma dos compostos voláteis da aguardente. A programação de temperatura foi otimizada em 40 C por 5 min, 3 C/min até 145 C, 10 C/min até 200 C, mantidos por 10 min. Observa-se na Tabela 1, que os melhores resultados de extração de voláteis foram obtidos com a amostra diluída em 20% de etanol. Isso se deve ao fato de que, se por um lado, uma grande quantidade de etanol no headspace atrapalha a adsorção de outros compostos, por outro, em uma solução muito diluída a concentração de voláteis no seu headspace também será baixa. A agitação favoreceu o desprendimento dos voláteis, enquanto que o sal não apresentou o efeito esperado do salting-out. Figura 1. Cromatogramas dos compostos voláteis do headspace da aguardente. A = coluna DB-5; B = coluna Carbowax.

4 4 Otimização da Extração de Compostos Voláteis por Microextração em Fase Sólida em Headspace: Exemplo da Aguardente de Cana Observa-se ainda nessa Tabela, que a elevação da temperatura de 25 o C para 50 o C provocou uma redução significativa na quantidade de picos e na área total do cromatograma, corroborando com os resultados obtidos por Morés (2009) para ésteres. Por sua vez, o aumento do tempo para formação do headspace (tempo de equilíbrio) não aumentou significativamente a área total e o número de picos (Tabela 1), mostrando que não é necessário se fazer um tempo de equilíbrio antes da extração. No entanto, o tempo de exposição da fibra apresentou grande efeito na extração dos compostos voláteis do headspace da aguardente (Tabela 2). Esse tempo de exposição foi otimizado em 30 min, pois apesar de não aumentar significativamente o número de picos em relação ao tempo 25 min, observou-se uma maior extração dos compostos, representada pela maior área total do cromatograma. Tabela 1. Efeito das condições da amostra nos compostos adsorvidos por SPME. Parâmetro Nível N o picos Concentração etanol (%) (25 o C, 0 min equilíbrio, sem agitação, sem sal, 10 min exposição) Agitação (25 o C, 20% etanol, 0 min equilíbrio, sem sal, 10 min exposição) Concentração sal (p/v) (25 o C, 20% etanol, 0 min equilíbrio, com agitação, 10 min exposição) Temperatura ( o C) (20% etanol, 0 min equilíbrio, com agitação, sem sal,10 min exposição) Tempo equilíbrio (25 o C, 20% etanol, com agitação, sem sal, 10 min exposição) Área (milhões) ab 9.47 b a a b 5.05 c sem 118 b b com 136 a a a a a b a a b 9.46 b a a a a a a a a a a Valores acompanhados de mesma letra nas colunas, não diferem estatisticamente entre si (p > 0.05). Tabela 2. Efeito do tempo de exposição da fibra de SPME. Parâmetro Nível N o picos Área (milhões) d f c e Tempo exposição (25 o C, 20% etanol, 0 min equilíbrio, com agitação, sem sal) b d b c a b a a a a Valores acompanhados de mesma letra nas coluna diferem estatisticamente entre si (p > 0.05).

5 Otimização da Extração de Compostos Voláteis por Microextração em Fase Sólida em Headspace: Exemplo da Aguardente de Cana 5 Conclusões As melhores condições de extração dos compostos voláteis do headspace de aguardente foram fibra PDMS/DVB/CAR; amostra diluída até 20% de etanol; temperatura de 25 C, com agitação, sem adição de sal; sem espera para formação do headspace (tempo de equilíbrio) e 30 min de exposição da fibra. Para análise desses compostos por cromatografia gasosa recomenda-se usar coluna Carbowax, utilizando-se 3-octanol (1g/L em etanol) como padrão interno, na concentração de 10 μl em 10 ml de amostra. Referências ALPENDURATA, M. F, Solid-phase microextraction: a promising technique for sample preparation in environmental analysis, Journal of Chromatography A, v. 889, p. 3-14, BOSCOLO, M.; BEZERRA, C. W. B.; CARDOSO, D. R.; LIMA NETO, B. S.; FRANCO, D. W. Identification and dosage by HRGC of minor alcohols and esters in Brazilian sugar cane spirit. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 11, p , BRASIL. Decreto no 4062 de 21.dezembro Define as expressões cachaça e cachaça do Brasil como indicações geográficas e dá outras providências. Diário Oficial da União. Brasília, DF, 3 de janeiro de Disponível em: < planalto.gov.br/ccivil_03/decreto/2001/d4062.htm>. Acesso em: 12 jul CARDOSO, D. R.; BETTIN, S. M.; RECHE, R. V.; LIMA NETO, B. S., FRANCO, D. W. HPLC-DAD analysis of ketones as their 2,4-dinitrophenylhydrazones in Brazilian sugar cane spirits and run. Journal of Food Composition and Analysis, v. 16, p , FRANCO, M. R. B. Aroma e sabor de alimentos: temas atuais. São Paulo: Varela, p. JANZANTTI, N. S. Compostos voláteis e qualidade de sabor da cachaça f. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos) FEA UNICAMP, Campinas. KATAOKA, H.; LORD, H.; PAWLISZYN, J. Applications of solid-phase microextraction in food analysis. Journal of Chromatography A, v. 880, p , MORÉS, S. Determinação de compostos voláteis em cachaça por microextração em fase sólida p. Dissertação (Mestrado em Química) Departamento de Química UFSC, Florianópolis. NASCIMENTO, R. F.; MARQUES, J. C.; DE KEUKELEIRE, D; LIMA NETO, B. S.; FRANCO, D. W. Qualitative and quantitative high-performance liquid chromatographic analysis of aldehydes in Brazilian sugar cane spirits and other distilled alcoholic beverages. Journal of Chromatography, v. 782, p , NASCIMENTO, R. F.; CARDOSO, D. R.; D.; LIMA NETO, B. S.; FRANCO, D. W. Determination of acids in Brazilian sugar cane spirits and other distilled alcoholic beverages by HRGC-SPE. Chromatographia, v. 48, p , PAWLISZYN, J; PAWLISZYN, B; PAWLISZYN, M. Solid Phase Microextraction (SPME). The Chemical Educator, v. 2, n. 4, p. 1-7, THOMAZINI, M.; FRANCO, M. R. B. Metodologia para análise dos constituintes voláteis do sabor. Boletim da SBCTA, v. 34, p , VALENTE, A.L.P.; AUGUSTO, F. Microextração por fase sólida. Química Nova, v. 23, p , Comunicado Técnico, 171 Exemplares desta edição podem ser adquiridos na: Embrapa Agroindústria Tropical Endereço: Rua Dra. Sara Mesquita 2270, Pici, CEP Fortaleza, CE Fone: (0xx85) Fax: (0xx85) / vendas@cnpat.embrapa.br 1 a edição (2011): on-line Comitê de Publicações Expediente Presidente: Antonio Teixeira Cavalcanti Júnior Secretário-Executivo: Marcos Antonio Nakayama Membros: Diva Correia, Marlon Vagner Valentim Martins, Arthur Cláudio Rodrigues de Souza, Ana Cristina Portugal Pinto de Carvalho, Adriano Lincoln Albuquerque Mattos e Carlos Farley Herbster Moura. Revisão de texto: Lucas Almeida Carneiro Editoração eletrônica: Arilo Nobre de Oliveira Normalização bibliográfica: Rita de Cassia Costa Cid