Restrição hídrica na inoculação artificial de Fusarium verticillioides em sementes de milho

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1 SCIENTIA PLENA VOL. 10, NUM Restrição hídric n inoculção rtificil de Fusrium verticillioides em sementes de milho L. S. Brros 1 ; S. C. Guimrães 1 ; L. Kobysti 1 ; E. A. F. Mendonç 1 1 Deprtmento de Fitossnidde, Progrm de Pós-Grdução em Agricultur Tropicl, Fculdde de Agronomi, Medicin Veterinári e Zootecni, , Cuibá-MT, Brsil Agrlilinebrros@yhoo.com.br (Recebido em 25 de novembro de 2013; ceito em 30 de junho de 2014) A restrição hídric tem sido utilizd nos meios de cultur com o objetivo de inibir ou retrdr germinção ds sementes e permitir mior exposição desss um inóculo, desde que o potencil osmótico do meio restrinj germinção ds sementes e não prejudique o desenvolvimento ds colônis do ptógeno. Visndo inoculção de Fusrium verticillioides em sementes de milho, form vlidos os efeitos d restrição hídric em meio BDA (btt-dextrose-ágr) +KCl e BDA+NCl nos potenciis de -0,6; -0,8; -1,0; -1,2; MP, sobre o crescimento micelil e produção de conídios de F. verticillioides, porcentgem de sementes infectds, germinção ds sementes inoculds e trnsmissão do fungo em milho. Não houve diferenç significtiv pr produção de conídios de F. verticillioides e germinção de sementes inoculds. O meio BDA+KCl entre -0,6 e -1,0 MP e, BDA+NACl de -0,6 e -0,8 MP fvorece o crescimento micelil de F. verticillioides. A técnic de restrição hídric utilizndo os solutos NCl e KCl é eficiente n inoculção rtificil de sementes de milho com F. verticillioides. O meio BDA+NCl e BDA+KCl, mbos no potencil de -1,2 MP, permite 90% de trnsmissibilidde de F. verticillioides de sementes inoculds pr colmos e rízes de milho. Plvrs-chve: Ze mys, condicionmento osmótico, trnsmissão. Wter Restriction on rtificil inocultion for Fusrium verticillioides in corn seeds Wter restriction hs been used in the culture medi in order to inhibit or dely germintion to llow for greter exposure to n inoculum, s long s the osmotic potentil of the medi restricts seed germintion nd is not detrimentl to the development of pthogen colonies. To chieve the inocultion of Fusrium verticillioides in corn seeds the effects of wter restriction using PDA (potto dextrose gr) + KCl nd PDA + NCl t concentrtion producing osmotic potentils of -0,6; -0,8; -1,0 nd -1,2 MP, on mycelil growth nd conidil production of F. verticillioides, percentge of infected seeds, germintion of seeds nd trnsmission of the fungus to the corn ws evluted. There ws no significnt difference for conidil production of F. verticillioides nd seeds germintion. The PDA + KCl medium with osmotic potentil between -0,6 nd -1,0 MP nd PDA + NCl with osmotic potentil of -0,6 nd -0,8 MP fvors the mycelil growth of F. verticillioides. The technique of using wter restriction with NCl nd KCl solutes is effective in rtificil inocultion of mize seeds with F. verticillioides. The PDA +NCl nd PDA + KCl medium, both in the osmotic potentil of -1,2 MP, llows 90% of trnsmissibility of F. verticillioides inoculted seeds to the corn stems nd roots. Key words: Ze mys, osmotic conditioning, trnsmission 1. INTRODUÇÃO O milho é um cultur de grnde importânci econômic no Brsil e, devido o umento de produtividde, tem se observdo mior interesse dos pesquisdores no controle de ptógenos que são comumente encontrdos n cultur, dentre esses, o Fusrium verticillioides. Esse ptógeno é considerdo um dos principis responsáveis pelo podrecimento ds sementes, bixos índices de vigor e germinção, celerção do processo de deteriorção durnte o rmzenmento [6, 7], lém d produção de micotoxins que cusm doençs denominds micotoxicoses qundo os grãos contmindos são ingeridos [4]. Em diversos estudos de epidemiologi fz-se necessário o uso de sementes infectds com ptógenos, em diferentes grus de contminção. Pr isso, tem sido usdos métodos de inoculção em plnts dults, imersão de sementes em suspensão de conídios e contto de sementes com colôni de fungos em desenvolvimento, porém, esses métodos têm sido questiondos por permitirem bixos índices de trnsmissibilidde do ptógeno ou mesmo

2 L. S. Brros, et l., Scienti Plen 10, (2014) 2 resultr em germinção ds sementes, ind em contto com o fungo durnte o período de inoculção rtificil, devido o período de tempo de exposição ds mesms o inóculo do fungo [2]. Além dos métodos menciondos, o uso d restrição hídric ou condicionmento fisiológico em meio de cultur de Btt-Dextrose-Ágr (BDA) tem sido utilizdo pr inoculção de lguns fungos em sementes com vntgem de permitir mior exposição desss o inóculo, desde que o potencil osmótico do meio restrinj germinção ds sementes e não prejudique o desenvolvimento ds colônis do ptógeno [7]. A técnic d restrição hídric em meio de cultur já foi comprovd como sendo eficz pr inoculção de vários fungos fitoptogênicos em diverss culturs [2, 7]. No entnto, o potencil osmótico e s substâncis utilizds pr promover restrição hídric, são vriáveis entre espécies de fungos e de sementes. Pr tnto, o objetivo desse trblho, foi vlir eficáci d técnic d restrição hídric em meio BDA com utilizção de NCl e KCl n inoculção rtificil de sementes de milho com F. verticillioides e su trnsmissão. 2. MATERIAIS E MÉTODOS As sementes de milho utilizds form do híbrido AS1590YG, obtidos pel Empres Monsnto e o fungo F. verticillioides foi isoldo de sementes de milho e mntido em plc de Petri contendo meio BDA. O delinemento experimentl utilizdo foi inteirmente csulizdo em esquem ftoril 5 x 2 (cinco potenciis e dois solutos) pr vlição d germinção de sementes de milho, crescimento micelil, quntificção de conídios e snidde, e ftoril 6 x 2 (cinco potenciis + semente não inoculd e dois solutos) pr vlição d trnsmissibilidde. Pr inoculr s sementes, o meio de cultur utilizdo foi o meio sólido BDA utilizndo NCl e KCl seprdmente nos potenciis de -0,6; -0,8; -1,0; -1,2 MP, obtido por meio d fórmul de Vn t Hoff, citdo por Slisbury e Ross [11], mis testemunh BDA (-0,35 MP = águ pur), sem dição dos restritores. Form retirdos discos de 0,5 cm de diâmetro ds bords ds colônis de F. verticillioides e trnsferids pr o centro de plcs de Petri de 9 cm de diâmetro contendo BDA+trtmento. Esss plcs form incubds 25 C em fotoperíodo de 12 hors. Após sete dis, s sementes de milho form desinfestds em solução de hipoclorito de sódio 2% por 1 minuto, enxguds em águ destild esterilizd, e colocds em contto com plc de Petri contendo o fungo desenvolvido em meio contendo o restritor (BDA+trtmento). As sementes form colocds em cmd únic por tod plc de Petri onde permnecerm té que pelo menos um semente inicisse o processo de germinção, que ocorreu em 24; 25; 25,5; 28 e 29 h pr os respectivos potenciis osmóticos de -0,35; -0,6; -0,8; -1,0 e -1,2 MP utilizndo o soluto KCl e 24 h pr o potencil de -0,35, 26 h pr -0,6; -0,8; -1,0 e 27h pr o potencil de -1,2 MP. Após os períodos de exposição, ests sementes já inoculds, form colocds pr secr sobre folhs de ppel filtro por 24 h, em condições sséptics. Pr vlição d germinção, s sementes inoculds form condicionds em ppel tolh tipo germitest, n form de rolo, umedecidos com águ destild n quntidde de 2,5 vezes mss do ppel, sendo qutro repetições de 50 sementes por trtmento. Os rolos form levdos germindor reguldo com tempertur de 25 C por qutro dis [1], qundo form observds s plântuls normis, plântuls normis e sementes não germinds. O crescimento micelil foi vlido utilizndo meio BDA+NCl e BDA+KCl, nos potenciis de -0,6; -0,8; -1,0; -1,2 MP, mis testemunh BDA puro (-0,35 MP). Form retirdos discos de 0,5 cm de diâmetro ds bords ds colônis de F. verticillioides e trnsferids pr o centro de plcs de Petri de 9 cm de diâmetro contendo BDA+trtmento e mntidos té que 50% ds prcels de lgum dos trtmentos tomsse 3 / 4 d plc. Form utilizds qutro repetições por trtmento, sendo cd repetição um plc. A vlição diári foi relizd por meio d medição dos diâmetros ds colônis nos dois sentidos perpendiculres, tomndo-se como vlor de crescimento médi dos dois eixos.

3 L. S. Brros, et l., Scienti Plen 10, (2014) 3 Pr quntificção do número de conídios nos diferentes meios, form diciondos 10 ml de águ destild à plc de Petri. A suspensão de conídios obtid foi filtrd em dupl cmd de gze. Três repetições form utilizds pr determinr concentrção de conídios, cd repetição foi representd por três líquots de cd plc e contgem foi feit com uxílio de câmr de Neubuer e microscópio. Pr snidde ds sementes inoculds, form utilizds oito repetições de 25 sementes, desinfestds com hipoclorito de sódio 2% por um minuto e enxguds em águ destild e esterilizd ntes d incubção 25 C pelo método Blotter Test em regime lterndo de 12 hors de luz por sete dis. A presenç do fungo foi vlid com uxílio de microscópio estereoscópio. O teste de trnsmissibilidde foi relizdo em cs-de-vegetção por meio do plntio ds sementes inoculds rtificilmente, em vsos de 2,5 L de solo estéril. As plnts form mntids por 26 dis pós germinção. Ests então form coletds, feit seprção de colmo e rízes com uxílio de tesour e desinfestção superficil de todo mteril com álcool, hipoclorito de sódio 2% e águ destild esterilizd. Depois form incubds em câmr úmid ± 25 ºC por 7 dis com 12 h de fotoperíodo pr identificção d colôni fúngic formd, pós esporulção do ptógeno, com uxilio de microscópios estereoscópio e ótico. A testemunh foi constituíd por sementes não submetids o processo de inoculção. Form utilizds qutro repetições, sendo cd repetição compost por três vsos com dus plnts cd. Os resultdos form submetidos nálise de vriânci pelo teste F e s médis dos trtmentos form comprdos pelo teste Scott-Knott (P 0,05). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Não houve redução n germinção ds sementes inoculds sugerindo que qulquer potencil utilizdo com BDA+NCl ou BDA+KCl, pode ser utilizdo sem cusr dnos à semente, concordndo com os resultdos de Mchdo et l. [7] com inoculção de F. moniliforme em sementes de milho em solução de mnitol. Porém, Teixeir e Mchdo [13] observrm redução n germinção o utilizr BDA+Mnitol com -1,2 MP n inoculção de Acremonium strictum qundo semente de milho foi expost por mis de 72 h à colôni fúngic. N snidde ds sementes inoculds (Figur 1), observou-se que com o uso de BDA+KCl, infecção pelo fungo foi lcnçd de form grdtiv e crescente, pois nos potenciis de -1,0 e - 1,2 MP, obteve-se 86 e 90,5% de sementes de milho infectds. Pr BDA+NCl, porcentgem de sementes infectds diferiu pens d testemunh. A diferencição entre os meios+solutos ocorrerm nos potenciis de -0,6 e -0,8 MP, ocorrendo mior infecção qundo utilizdo NCl.

4 Crescimento micelil de F. verticillioides (cm) Sementes de milho infectds com F. verticillioides (%) L. S. Brros, et l., Scienti Plen 10, (2014) A A Bb Bb Ad Ac Ad BDA+KCl BDA+NCl 0 0,35 0,6 0,8 1,0 1,2 Potencil osmótico (MP) Figur 1. Porcentgem de sementes de milho infectds com Fusrium verticillioides em diferentes níveis de potencil osmótico nos meios de cultur btt-dextrose-ágr+ncl e btt-dextrose-ágr+kcl. UFMT, Cuibá, MT, T = testemunh. Médis seguids de mesm letr minúscul comprm potencil osmótico, letr miúscul compr btt-dextrose-ágr+soluto, e não diferem entre si pelo teste Scott Knott 5% de probbilidde Mesmo sem restrição hídric houve inoculção de 59% ds sementes. Isso sugere que o ptógeno present crescimento rápido e penetr fcilmente nos tecidos protetores d semente [7]. Houve comportmento diferencido do crescimento micelil de F. verticillioides em relção o potencil osmótico e solutos utilizdos enqunto que pr produção de conídios, não houve diferenç significtiv entre os trtmentos. Verificou-se que os miores crescimentos miceliis ocorrerm nos meios BDA+KCL de -0,6-1,0 MP e BDA+NCl em -0,6 e -0,8 MP (Figur 2). 4 A Ac Bc Bb A B 3 2 BDA+KCl BDA+NCl 1 0 T 0,6 0,8 1,0 1,2 Potencil osmótico (MP) Figur 2. Crescimento micelil (cm) de Fusrium verticillioides em meio de cultur btt-dextrose-ágr (BDA) modificdo com os solutos KCl e NCl. UFMT, Cuibá, MT, T = testemunh. Médis seguids de mesm letr minúscul comprm potencil osmótico, letr miúscul comprm bttdextrose-ágr+soluto e não diferem entre si pelo teste Scott-Knott 5% de probbilidde Pr cd microrgnismo existe um fix dequd de potencil hídrico pr o seu crescimento e meios de cultur osmoticmente modificdos, pois estes diferem n hbilidde de bsorver águ do mbiente [2, 3]. Os potenciis entre -0,6 e -1,0 MP estimulrm o desenvolvimento d colôni fúngic de F. verticillioides qundo utilizdo BDA+KCl. No potencil de -1,2 MP o crescimento micelil foi de 4,14 cm, semelhnte utilizção de BDA pdrão que obteve 4,09 cm. Já pr BDA+NCl, os miores crescimentos ocorrerm nos potenciis de -0,6 e -0,8 MP. Semelhnte os resultdos encontrdos por [8] qundo F. oxysporum f. sp. vsinfectum foi estimuldo, visto que,

5 Trnsmissibilidde de F. verticillioides pr colmo e riz (%) L. S. Brros, et l., Scienti Plen 10, (2014) 5 no meio sem restrição hídric, o índice do crescimento micelil foi menor que nos demis potenciis. O crescimento de F. verticillioides foi fvorecido no meio BDA+KCl entre os potenciis de - 0,8 à -1,2 MP, já pr Bipolris sorokinin, o crescimento micelil foi estimuldo té -0,8 MP utilizndo o mesmo soluto [5]. A trnsmissão de F. verticillioides prtir ds sementes inoculds obteve resultdo significtivo pens entre os potenciis osmóticos (Figur 3) b T 0,6 0,8 1,0 1,2 Potencil osmótico (MP) Figur 3. Trnsmissibilidde de Fusrium verticilioides, vi semente inoculd rtificilmente nos meios de cultur btt-dextrose-ágr+ncl e btt-dextrose-ágr+kcl, em diferentes potenciis hídricos, pr colmo e riz de milho. UFMT, Cuibá, MT, T= testemunh (semente sem inoculção). Médis seguids de mesm letr não diferem entre si pelo teste Scott-Knott 5% de probbilidde No potencil de -1,2 MP foi observdo 90% de trnsmissibilidde de F. verticillioides ds sementes pr os colmos e rízes ds plnts de milho, diferindo pens d testemunh. O ptógeno estv presente ns prtes vegetis não presentndo sintom visul e nenhum dno no desenvolvimento d plnt no período estuddo. Provvelmente com evolução d doenç, os tecidos dos nós do colmo poderim ser colonizdos, cusndo podridão d bse do colmo [12]. No ptossitem Colletotrichum lindemuthinum e feijoeiro, [9] verificrm 80% de trnsmissão e s plnts presentrm sintoms visuis no sistem rdiculr, enqunto [13] observrm 73% de trnsmissibilidde de Acremonium strictum e 99% ds plnts obtiverm o ptógeno no colmo e rízes de milho, com sintoms visuis prtir de 28 dis de idde. 4. CONCLUSÕES O meio BDA+KCl entre -0,6 e -1,0 MP e, BDA+NACl de -0,6 e -0,8 MP fvorece o crescimento micelil de F. verticillioides. A técnic de restrição hídric utilizndo os solutos NCl e KCl é eficiente n inoculção rtificil de sementes de milho com F. verticillioides. O meio BDA+NCl e BDA+KCl, mbos no potencil de -1,2 MP, permite 90% de trnsmissibilidde de F. verticillioides de sementes inoculds pr colmos e rízes de milho. 1. Brsil. Ministério d Agricultur e Reform Agrári. Regrs pr Análise de Sementes. Brsíli, p. Disponível em: 2. Crvlho JCB. Uso d restrição hídric n inoculção de Colletotrichum lindemuthinum em sementes de feijoeiro (Phseolus vulgris L.). Lvrs, f. Dissertção (Mestrdo em Agronomi) Universidde Federl de Lvrs. 3. Coutinho WM; Mchdo JC; Guimrães MG; et l. Uso d restrição hídric n inibição ou retrdmento d germinção de sementes de rroz e feijão submetids o teste de snidde em meio

6 L. S. Brros, et l., Scienti Plen 10, (2014) 6 ágr-águ. Revist Brsileir de Sementes, Brsíli. 2001; 23(2): Disponível em: 4. Embrp. Reção de Cultivres com Relção á Produção de Grãos Ardidos em Milho. Sete Lgos, p. (Boletim Técnico, 144). Disponível em: 5. Fris CRJ; Del Ponte EM; Corre CL; et l. Crescimento rdil de Bipolris sorokinin em respost indução de restrição hídric por solutos osmóticos em meio grizdo. Revist Brsileir Agrociênci, Pelots. 2004; 4(4): Disponível em: 6. Goulrt ACP; Filho WFB. Incidênci e controle de Fusrium moniliforme Sheldon em sementes de milho. Revist brsileir de Sementes, Brsíli. 1999; 21(1): Disponível em: 7. Mchdo JC; Oliveir JA; Vieir MGGC; et l. Uso d restrição hídric n inoculção de fungos em sementes de milho. Revist Brsileir de Sementes, Brsíli. 2001; 23(2): Disponível em: 8. Mchdo JC. Uso d restrição hídric n inoculção de fungos em sementes de lgodoeiro (Gossypium hirsutum L.). Revist Brsileir de Sementes, Brsíli. 2004; 26(1): Disponível em: 9. Rey MS; Lim NB; Sntos J; et l. Trnsmissão semente plântul de Colletotrichum lindemuthinum em feijão (Phseolus vulgris). Arquivos do Instituto Biológico, São Pulo. 2011; 76(3): Disponível em: Reis HF; Goulrt ACP. Associção de Cercospor kikuchii com sementes de soj com "mnch púrpur". Fitoptologi Brsileir, Brsíli. 1998; 23:274. Disponível em: Slisbury FB; Ross CW. Plnt physiology. 4. ed. Belmont: Wndworth, p. 12. Srtori AF; Reis, EM; Cs RT. Quntificção de trnsmissão de Fusrium moniliforme de sementes pr plântuls de milho. Fitoptologi Brsileir, Brsíli. 2004; 29(4): Disponível em: Teixeir H; Mchdo JC. Trnsmissibilidde e efeito de Acremonium strictum em sementes de milho. Ciênci e Agrotecnologi, Lvrs. 2003; 27(5): Disponível em: