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1 Rev. Bras. Reprod. Anim., Belo Horizonte, v.34, n.4, p , out./dez Disponível em Coleta e avaliação de sêmen de pumas (Puma concolor Linnaeus, 1771) adultos mantidos em cativeiro Collection and semen evaluation of captive adult cougars (Puma concolor Linnaeus, 1771 T. Deco S 1, T.A.R. Paula 2,4, D.S. Costa 3, G.R. Araújo 1, R.M. Garay 1, G.S.C. Vasconcelos 1, A.C. Csermak Junior 1, L.C. Silva 1, J.B.G. Barros 1 1 Aluno de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, MG, Brasil 2 Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, MG, Brasil 3 Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, MS, Brasil. 4 Correspondência: tarcizio@ufv.br Recebido: 21 de agosto de 2009 Aceito: 15 de dezembro de 2010 Resumo A coleta e a avaliação de sêmen, embora procedimentos básicos para a reprodução assistida, são pouco estudadas em animais silvestres devido às dificuldades inerentes às espécies e, em especial, à raridade de espécimes disponíveis. O presente trabalho objetivou descrever um protocolo de coleta de sêmen por eletroejaculação e as características do ejaculado de pumas (Puma concolor) adultos (n = 5), mantidos em cativeiro. Após contenção química e previamente ao procedimento de coleta de sêmen, procedeu-se ao esvaziamento e à lavagem da bexiga para se evitar a contaminação do ejaculado com urina. O protocolo de eletroejaculação consistiu na aplicação de um máximo de quatro séries de 10 estímulos com 16V. O protocolo proposto mostrou-se eficiente, com obtenção de ejaculados em 100% das coletas realizadas (n = 5), todos livres de contaminação com urina e com elevada concentração espermática (205 ± 141,77 x 10 6 espermatozóides/ml). Embora com uma média elevada de espermatozóides patológicos (53,88 ± 15,50%), apenas um indivíduo dentre os pumas avaliados apresentou menos de 40% de espermatozóides morfologicamente normais, sendo assim considerado teratospérmico. As alterações mais freqüentemente observadas foram: cauda fortemente dobrada ou enrolada (29,13 ± 13,70%), cauda dobrada ou enrolada (8,13 ± 2,10%) e cauda enrolada na cabeça (6,63 ± 5,34%). Palavras chave: andrologia, eletroejaculação, felinos, morfologia espermática. Abstract The collection and semen evaluation, although basic procedure for assisted reproduction, are not well studied in wild animals due to the inherent difficulties to the species and especially to the rarity of available specimens. The aim of this study was to describe the semen s collection protocol used for adult captive cougars (Puma concolor; n = 5), and characterize the semen collected from those animals. After chemical restraint, and prior to semen collection procedure, the bladder was washed to prevent contamination of the ejaculate with urine. The eletroejaculation protocol proposed was efficient, obtaining 100% of semen in the collections taken (n = 5), all they free of contamination with urine and with high sperm concentration (205 ± 141,77 x 10 6 spermatozoa/ml). Although with high average of pleiomorphic spermatozoids (53.88 ± 15,50%), only one individual showed less than 40% of normal spermatozoa and thus was considered teratospermic. The alterations more frequently observed were strongly bent or coiled tail (29,13 ± 13,70%), bent or coiled tail (8,13 ± 2,10%) and tail coiled in the head (6,63 ± 5,34%). Keywords: andrology, electroejaculation, felines, spermatic morphology. Introdução Os felinos silvestres estão entre as espécies mais ameaçadas do mundo e sua população é afetada por fatores que variam geograficamente, seja pela descaracterização de habitats, disponibilidade de alimentos, forte pressão de caça ou baixa densidade populacional (Nowell e Jackson, 1996). Especificamente, o puma é classificado como Vulnerável na Lista Nacional das Espécies da Fauna Brasileira Ameaçadas de Extinção (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis - IBAMA, 2003) e é citado no apêndice II da Convenção Internacional sobre Intercâmbio de Espécies Ameaçadas de Extinção (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora - CITES, 2009). A conservação das espécies está intrinsecamente ligada à manutenção da variabilidade genética. Quando uma população é isolada e fica sujeita à uniformidade genética, alguns fatores, como a maior susceptibilidade a doenças e a redução da fertilidade, se somam para desencadear ou mesmo acelerar o processo de extinção (Wildt et al., 1987; Munson et al., 1996).

2 A ação ideal para se manter ou mesmo aumentar a variabilidade genética das populações é preservar seu hábitat (Loi et al., 2001). Tal ação, no entanto, nem sempre é suficiente para a propagação e manutenção de uma adequada variabilidade genética em pequenas populações (Comizzoli et al., 2000). Assim, estratégias de conservação ex situ objetivam auxiliar na manutenção de uma população geneticamente viável por meio de programas de reprodução assistida e criopreservação de fontes genéticas (Andrabi e Maxwell, 2007). As espécies silvestres apresentam características fisiológicas e genéticas particulares, que estão potencialmente relacionadas com sua sobrevivência na natureza. Estudos sobre as características reprodutivas destas espécies, portanto, são de suma importância como base de dados para o desenvolvimento de programas de reprodução assistida espécie específicos, que visem a conservação de espécies ameaçadas de extinção (Wildt et al., 1986). Até o presente momento, no entanto, são raros os estudos com coleta e caracterização de sêmen de pumas, sendo que nenhum destes foi realizado com subespécies encontradas no Brasil (Wildt et al., 1988; Miller et al., 1990; Pukazhenthi et al., 2001). Amostras de sêmen a serem utilizadas em programas de reprodução assistida em felinos podem ser obtidas por meio de vagina artificial (Zambelli e Belluzzi, 1998), eletroejaculação (Howard et al., 1986) ou coletadas diretamente do epidídimo ou ductos deferentes (Axnér, 1998). Dentre estas, a eletroejaculação pode ser considerada a mais apropriada para felinos silvestres, uma vez que pode ser realizada em animais anestesiados. Protocolos de eletroejaculação desenvolvidos por Howard et al. (1986) e Wildt et al. (1983) têm sido utilizados como modelo para coleta de sêmen em várias espécies de felinos selvagens, inclusive pumas (Miller et al., 1990; Morato et al., 1998; Baudi, 2005). Porém, na maioria destas espécies, são relatadas baixas concentrações de espermatozóides, com freqüente contaminação com urina. Morais (1999) e Queiroz (2003) relatam que em jaguatiricas esta contaminação com urina é observada em 69 a 75% dos procedimentos de eletroejaculação realizados. Visto que a urina é tóxica aos espermatozóides e pode provocar redução na motilidade espermática (Griggers et al., 2001), é de suma importância o aprimoramento destas técnicas de forma a reduzir as taxas de contaminação do ejaculado com urina durante as coletas, mantendo boas concentrações e volumes espermáticos. Nesse sentido, o presente experimento objetivou a avaliação andrológica de pumas em cativeiro, por meio da descrição de um protocolo de coleta de sêmen por eletroejaculação, bem como a caracterização física e morfológica do sêmen. Material e Métodos Foram utilizados cinco pumas machos, adultos, mantidos em cativeiro no Centro de Reabilitação de Animais Silvestres do Mato Grosso do Sul (CRAS-MS). A presente experimentação foi aprovada pela Comissão de Ética do Departamento de Veterinária - UFV (registro nº 21/2008) e autorizada pelo IBAMA (processo nº de 17/04/2008). Coleta de sêmen e avaliação andrológica Foi realizada uma coleta em cada animal. Para obtenção do sêmen, os animais foram contidos quimicamente pelo uso de dardos anestésicos e mantidos sob anestesia. Utilizou-se como protocolo anestésico a associação, via intramuscular, de cloridrato de quetamina (10 mg/kg, Dopalen, Vetbrands, SP-Brasil) e cloridrato de xilazina (1,2 mg/kg. Anasedan, Vetbrands, SP-Brasil). Nos casos em que o animal não entrou em plano anestésico adequado, uma dose reforço de 4 mg/kg de cloridrato de quetamina e 0,4 mg/kg de cloridrato de xilazina foi aplicada por via intramuscular. Os animais tiveram seus parâmetros vitais aferidos e avaliados, por um médico veterinário, durante e após o procedimento, sendo monitorados até que conseguissem manter-se em estação, garantindo uma recuperação pós-anestésica segura. Após a contenção química, foi realizado o exame andrológico, para o qual se avaliaram a consistência testicular, classificada como firme, elástica, ligeiramente flácida, flácida e muito flácida, e as características das espículas penianas, avaliadas quanto ao comprimento da região ocupada pelas espículas e ao tamanho destas. O tamanho das espículas foi avaliado subjetivamente por comparação com espécies de felinos anteriormente estudados pela equipe e dentre o próprio plantel de pumas utilizados no presente estudo. A biometria testicular dos animais foi mensurada utilizando-se um paquímetro digital, e para pesagem dos animais utilizou-se balança digital. Para a biometria testicular, foram considerados o comprimento, a largura e a espessura, assim como a prega dupla de pele de ambos os testículos. Para o cálculo do volume testicular, foi descontado das mensurações o valor da prega dupla de pele, para se obter a mensuração exata do testículo. O volume dos testículos foi calculado a partir da fórmula do elipsoide v = 4/3 x п x C/2 x L/2 x E/2, em que V representa o volume testicular, C o comprimento, L a largura e E a espessura, todos apresentados em centímetros. Utilizando-se o volume testicular e considerando-se a densidade testicular (próximo de 1), os valores obtidos de volume (ml) foram extrapolados para gramas para se calcular o índice gonadossomático, que se refere à massa corpórea alocada em massa testicular. A fórmula utilizada para o cálculo do índice gonadossomático (IGS) foi IGS = (v D + v E ) x 100/ PC, em que V D representa o volume do testículo direito, V E o Rev. Bras. Reprod. 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3 volume do testículo esquerdo e PC o peso corporal do animal em gramas. Previamente à coleta de sêmen, foi feito o esvaziamento da bexiga com sonda uretral estéril e seringa de 10 ml e posterior lavagem da bexiga com solução fisiológica estéril. O sêmen foi coletado com auxílio de um aparelho de eletroejaculação (Eletrogen SA200, Santa Lydia, SP-Brasil) à bateria, equipado com um transdutor retal de 2,5 cm de diâmetro com três eletrodos longitudinais. O transdutor foi devidamente lubrificado, e uma extensão de aproximadamente 12 cm foi introduzida no reto do animal com os eletrodos posicionados ventralmente sob leve pressão. O pênis foi exposto e aproximado a um tubo graduado de 1,5 ml (tipo Eppendorf), previamente aquecido à temperatura de 38ºC, o qual foi substituído a cada série de estímulos. Foram aplicados no máximo 4 séries de 10 estímulos de 16V com intervalos de um minuto entre as séries. Cada estímulo levou aproximadamente um segundo para ir de 0V à 16V, permanecendo por dois a três segundos, seguido por um retorno abrupto a 0V, sendo o intervalo entre os estímulos de dois a três segundos. Para uma aferição mais precisa do volume do ejaculado, utilizou-se uma micropipeta de volume ajustável. Avaliação espermática Após as coletas, os ejaculados foram analisados quanto aos aspectos físicos (volume e cor). Imediatamente após esta análise, uma gota do sêmen foi colocada em uma lâmina que foi coberta com lamínula, ambas previamente aquecidas a 38ºC, a fim de se evitar choque térmico. Em seguida, sob aumento de 100x ao microscópio de luz monocular portátil (Artificial inseminaton Handycope, Freedom & Challenge, Coreia do Sul), o sêmen foi avaliado quanto à motilidade espermática progressiva e ao vigor, este numa escala de zero a cinco. Posteriormente, estes valores foram utilizados no cálculo do índice espermático (IE = [M+ (Vi x 20)]/2, em que M representa a motilidade e Vi o vigor espermático), que consiste na média entre vigor e motilidade espermático, na qual ambos têm a mesma significância (Howard et al., 1993). Para a determinação da concentração espermática do ejaculado, utilizou-se uma lâmina especial, contendo uma câmara de 10-6 ml, fornecida pelo fabricante do microscópio portátil utilizado. Depois de pipetada uma alíquota de 10 μl e avaliados os parâmetros de vigor e motilidade espermáticos, como descrito anteriormente, aguardou-se um tempo para que os espermatozóides morressem para se iniciar a sua contagem na área determinada. A concentração da solução equivale ao número de espermatozóides contados multiplicado por A partir destes valores, foi calculado o total de espermatozóides por ejaculado (sptz/ejaculado = volume x concentração) e o total de espermatozoides móveis por ejaculado (sptz móveis/ejaculado = volume x concentração x motilidade / 100). Para a avaliação das características morfológicas dos espermatozoides, uma alíquota de sêmen foi colocada em formol salino tamponado e observada em microscópio de contraste de fase sob um aumento de 1000x, sendo computadas 200 células de cada amostra de sêmen. Foi computada uma patologia por espermatozóide, e as patologias foram classificadas de acordo com as recomendações do Colégio Brasileiro de Reprodução Animal - CBRA (Manual..., 1998). Os resultados obtidos foram descritos quanto à média e ao respectivo desvio padrão por meio da função estatística do programa Excel Windows XP. Resultados O volume testicular médio observado foi de 7,59 ± 2,18 ml para o testículo direito e 7,49 ± 1,66 ml para o testículo esquerdo, o que define um investimento de cerca de 0,03% do peso corporal alocado em gônadas (índice gonadossomático; Tab. 1). Dentre os animais avaliados, apenas os animais 3 e 4 apresentaram alterações nas consistências testiculares, sendo que no animal 4 esta foi unilateral. As espículas penianas foram consideradas pequenas em todos os animais estudados (Tab. 1). O protocolo de eletroejaculação mostrou-se eficiente em 100% dos animais, não havendo contaminação com urina em nenhuma das coletas. O volume de sêmen coletado variou de 0,4 a 0,5 ml (0,45 ± 0,06), com uma concentração 205 ± 141,77 x 10 6 espermatozóides por mililitro de sêmen, vigor espermático 3,50 ± 0,58 e motilidade espermática progressiva de 75 ± 13% (Tab. 3). O animal 3 apresentou qualidade espermática muito aquém dos demais animais, não sendo computado na média geral para os parâmetros espermáticos. Os demais parâmetros espermáticos estão apresentados na Tab. 2. Quanto aos aspectos morfológicos, o sêmen de puma apresentou 46,13 ± 15,50% de espermatozóides normais, sendo que as alterações mais comumente observadas foram: cauda fortemente dobrada ou enrolada (29,13 ± 13,70%), cauda dobrada ou enrolada (8,13 ± 2,10%) e cauda enrolada na cabeça (6,63 ± 5,34%), e as alterações menos observadas foram estreito na base (0,25 ± 0,50%), cabeça isolada normal (0,25 ± 0,50%) e acrossoma ausente (0,38 ± 0,75%; Tab. 3). Devido aos valores indesejáveis de vigor, motilidade e concentração do sêmen coletado do puma 3, este não foi avaliado quanto à morfologia. Rev. Bras. Reprod. Anim., Belo Horizonte, v.34, n.4, p , out./dez Disponível em 254

4 Tabela 1. Biometria testicular, índice gonadossomático e características das espículas de pumas adultos mantidos em condições de cativeiro. Média ± DP Parâmetros Puma 1 Puma 2 Puma 3 Puma 4 Puma 5 (CV)* Testículo direito Biometria testicular Comprimento (mm) 34,60 34,60 27,30 38,30 33,10 Largura (mm) 23,30 26,60 19,80 24,70 25,00 Espessura (mm) 27,00 29,00 22,90 28,00 26,20 Volume testicular (ml) 7,67 9,92 4,32 9,13 6,92 33,58 ± 4,00 (11,91) 23,88 ± 2,56 (10,74) 26,62 ± 2,33 (8,76) 7,59 ± 2,18 (28,70) Testículo esquerdo Comprimento (mm) 35,20 33,70 27,30 33,00 33,70 Largura (mm) 24,40 24,60 21,70 24,40 23,00 Espessura (mm) 28,90 29,80 24,50 28,60 26,40 Volume testicular (ml) 8,91 9,09 5,19 7,81 6,44 Prega cutânea (mm) 3,40 3,20 2,90 3,80 4,20 Índice gonadossomático (%) 0,03 0,04 0,01 0,03 0,03 Consistência testicular firme firme flácida testículo esquerdo levemen te mais firme Comprimento da região com espículas (mm) 8,20 8,00 7,55 10,00 7,30 32,58 ± 3,06 (9,39) 23,62 ± 1,25 (5,29) 27,64 ± 2,15 (7,80) 7,49 ± 1,66 (22,23) 3,50 ± 0,51 (14,57) 0,03 ± 0,01 (36,35) firme.. 8,21 ± 1,06 (12,94) Característica de espículas normais normais normais normais normais.. *DP desvio padrão; CV coeficiente de variação. Tabela 2. Volume do ejaculado e características do sêmen de pumas adultos mantidos em condições de cativeiro. Parâmetro Média ± DP (CV)* Variação Volume total (ml) 0,45 ± 0,06 (12,83) 0,4 0,5 Concentração espermática (sptz x10 6 /ml) 205 ± 141,77 (69,16) Total de espermatozóides por ejaculado (x10 6 ) 93,50 ± 73,71 (78,83) Motilidade espermática (%) 75 ± 13 (17,21) Vigor (0-5) 3,50 ± 0,58 (16,50) 3 4 Índice espermático (%) 72,50 ± 11,90 (16,42) Espermatozóides móveis/ ejaculado (x10 6 ) 66,95 ± 50,28 (75,10) *DP desvio padrão; CV coeficiente de variação. Rev. Bras. Reprod. Anim., Belo Horizonte, v.34, n.4, p , out./dez Disponível em 255

5 Tabela 3. Patologias espermáticas observadas em sêmen de pumas adultos mantidos em condições de cativeiro. Patologia (%) Média ± DP (CV)* Espermatozóides patológicos 53,88 ± 15,50 (28,78) Espermatozóides normais 46,13 ± 15,50 (33,61) Acrossoma ausente 0,38 ± 0,75 (200,00) Estreita na base 0,25 ± 0,50 (200,00) Contorno anormal 1,00 ± 0,41 (40,82) Cabeça isolada normal 0,25 ± 0,50 (200,00) Formas teratológicas 0,88 ± 0,85 (97,59) Cauda enrolada na cabeça 6,63 ± 5,34 (80,67) Cauda dobrada ou enrolada 8,13 ± 2,10 (25,80) Cauda fortemente dobrada ou enrolada 29,13 ± 13,70 (47,02) Gota protoplasmática distal 0,75 ± 0,87 (115,47) Gota protoplasmática proximal 0,38 ± 0,48 (127,66) Fratura 2,00 ± 1,41 (70,71) Edema 0,50 ± 0,58 (115,47) Dag defect 1,50 ± 2,12 (141,42) Gigante, curto, largo, pequeno, normal 2,13 ± 2,21 (104,12) *DP desvio padrão; CV coeficiente de variação. Discussão As espículas no pênis são características dos felídeos e, por serem características sexuais secundárias, cujo crescimento é andrógeno dependente, podem ser utilizadas como preditor da capacidade androgênica individual (Aronson e Cooper, 1967). No presente experimento, observou-se que todos os animais possuíam espículas penianas com aspectos semelhantes e, embora pequenas quando comparadas a outras espécies de felídeos, como a jaguatirica e o gato doméstico, foram consideradas características fisiológicas para pumas adultos. O protocolo proposto para coleta de sêmen em puma mostrou-se eficiente, uma vez que todos os animais responderam com ereção peniana e ejaculação de amostras de sêmen turvas a translúcidas. Wildt et al. (1988) coletaram ejaculados de puma com maior volume (3,4 ± 0,6 ml), menor concentração (22,00 ± 7,3 x 10 6 sptz/ml de ejaculado) e menos espermatozóides por ejaculado (74,8 x10 6 sptz/ejaculado) em comparação com o presente trabalho; já Miller et al. (1990) obtiveram ejaculados com volume variando de 0,37 a 1,52 ml e concentração de 4 a 27 x 10-6 sptz/ml, valor muito inferior ao do presente trabalho, ambos utilizando protocolos de eletroejaculação descritos por Wildt et al. (1983) e Horward et al. (1986). Os protocolos de eletroejaculação descritos por Wildt et al. (1983) e Horward et al. (1986) têm sido utilizados em várias espécies de felídeos selvagens, como tigre (Panthera tigris, Donoghue et al., 1990), onça parda (Puma concolor, Miller et al., 1990), jaguatirica (Leopardus pardalis, Baudi, 2005), onça pintada (Panthera onca, Morato et al., 1998). Na maioria destas espécies, no entanto, são relatadas baixas concentrações de espermatozóides, com freqüente contaminação com urina. Queiroz (2003) e Morais (1999) relataram que em jaguatiricas uma grande contaminação com urina é observada (69 a 75% das amostras coletadas), podendo provocar redução na motilidade espermática e diluição do ejaculado (Griggers et al., 2001). Em vista destes resultados, no presente estudo, optou-se pelo esvaziamento e pela lavagem da bexiga com solução fisiológica estéril, previamente às coletas, as quais eliminaram a contaminação do sêmen com a urina. Além disso, o protocolo de eletroejaculação proposto utilizou uma voltagem maior e uma menor quantidade de estímulos que a descrita na literatura. Desta forma, estas diferenças, no volume do ejaculado e em sua concentração, possivelmente ocorreram devido ao fato de o protocolo convencional para coleta de sêmen de felídeos se basear em uma grande quantidade de estímulos elétricos em intensidades crescentes, sem o esvaziamento e a lavagem prévia da bexiga, o que pode diluir o sêmen por conseqüência do excesso de estímulo às glândulas acessórias ou mesmo pela contaminação com urina (Áxner e Linde-Forsberg, 2002). A degeneração testicular é a principal causa de redução de fertilidade em mamíferos domésticos. Quando no início, a degeneração se apresenta com flacidez testicular e tamanho da gônada normal a levemente reduzido; em casos mais avançados, o órgão se torna diminuído de volume, com consistência firme à palpação, resistente ao corte, podendo até ocorrer mineralização dos túbulos seminíferos. Dependendo da gravidade da lesão, o ejaculado pode conter baixa concentração espermática e elevada taxa de espermatozóides Rev. Bras. Reprod. Anim., Belo Horizonte, v.34, n.4, p , out./dez Disponível em 256

6 morfologicamente anormais, sendo que, em casos mais graves, pode ocorrer azospermia (Nascimento e Santos, 2003). Os testículos dos animais avaliados no presente experimento mostraram-se em geral com consistência elástica, exceto o puma 3, que apresentou testículos com consistência flácida, e o puma 4, com o testículo esquerdo levemente mais firme. Dentre os animais avaliados, o puma 3 apresentou valores de vigor e motilidade muito aquém do esperado (vigor 1 e motilidade 10%) o que, junto com a avaliação da consistência testicular, permitiu diagnosticar presença de degeneração testicular bilateral e, portanto, os valores de vigor e motilidade deste indivíduo foram descartados do cálculo da média geral. O animal 4 possivelmente não apresentou alteração significativa na qualidade espermática por apresentar alteração unilateral na consistência testicular. Em outros estudos com pumas, Wildt et al. (1988) observaram média de motilidade espermática inferior à encontrada no presente estudo (64,3 ± 6,6%), porém vigor médio semelhante (3,6 ± 0,2), enquanto Miller et al. (1990) obtiveram motilidade espermática variando de 40 a 50% e vigor entre 2,5 e 3, ambos inferiores aos encontrados no presente trabalho. O índice espermático considera ao mesmo tempo o vigor e a motilidade espermáticos, e nos pumas avaliados o valor médio observado foi de 72,5 ± 11,9%; valores descritos na literatura para esta mesma espécie estão entre 50 e 68,15% (Wildt et al., 1988; Miller et al., 1990). Neste sentido, também a média de espermatozóides móveis por ejaculado foi superior no presente experimento (66,95 ± 50,28 x10 6 ) aos descritos por Wildt et al. (1988; 44,2 x10 6 ). A urina é tóxica aos espermatozóides e, quando amostras de sêmen são contaminadas durante o procedimento de eletroejaculação, os parâmetros de vigor declinam drasticamente (Griggers et al., 2001). Desta forma, possivelmente os reduzidos valores de índice espermático e total de espermatozóides móveis, observados nos demais trabalhos com pumas, estão relacionados com contaminação dos ejaculados com urina durante a eletroejaculação, uma vez que os autores utilizaram protocolos convencionais de coleta de sêmen em felídeos, sem o esvaziamento e a lavagem da bexiga. A média de espermatozóides morfologicamente anormais observados no sêmen dos pumas estudados foi de 53,88% ± 15,50, variando de 35 a 72%, demonstrando que, em pumas mantidos em cativeiro, observam-se elevadas variações individuais entre as taxas de espermatozóides anormais. A média de espermatozóides morfologicamente anormais foi inferior à relatada por Wildt et al. (1988) de 73,5% ± 4,9, por Miller et al. (1990) de 82 a 99% e por Pukazhenthi et al. (2001) de 91,4%. A teratospermia é caracterizada como sendo uma porcentagem menor que 40% de espermatozóides normais presentes no ejaculado e freqüentemente está associada a ejaculados de felídeos, incluindo certos gatos domésticos (Pukazhenthi et al., 2001; Neubauer et al., 2004). No presente experimento, apenas o puma 4 apresentou ejaculado com menos de 40% de espermatozóides morfologicamente normais, sendo assim considerado como teratospérmico. Estudos in vitro mostraram correlações negativas entre a proporção de defeitos e a habilidade de penetração em oócitos, embora ejaculados com alta proporção de espermatozóides anormais possam apresentar boa fertilidade in vivo (Axnér e Linde-Forberg, 2007). São poucos os estudos que correlacionam morfologia espermática com fertilidade em felídeos (Donoghue et al., 1992; Wildt et al., 1993; Axnér et al., 1998). Em um estudo com gatos domésticos, Axnér e Linde-Forsberg (2007) correlacionaram diferentes alterações morfológicas com a fertilidade in vivo. Neste estudo, somente as alterações de cabeça foram relacionadas com baixa fertilidade, e em contraste com os resultados em bovinos (Barth e Oko, 1989), um animal com elevadas proporções de gota citoplasmática proximal se mostrou fértil. Em um estudo em pumas, Miller et al. (1990) observaram que, mesmo ejaculados com elevada incidência de espermatozóides pleiomórficos (82 a 99%) foram capazes de fertilizar ovócitos maturados in vitro. No presente estudo, as alterações mais freqüentemente observadas foram cauda fortemente dobrada ou enrolada (29,13% ± 13,70), cauda dobrada ou enrolada (8,13% ± 2,10) e cauda enrolada na cabeça (6,63% ± 5,34). Wildt et al. (1988) registraram maiores porcentagens de peça intermediária dobrada com gota citoplasmática (24% ± 6,5), cauda fortemente enrolada (20% ± 4,4) e cauda fortemente dobrada sem gota citoplasmática (11% ± 3,8). Já Miller et al. (1990) observaram elevadas porcentagens de espermatozóides com cauda fortemente enrolada (18 a 66%). A etiologia das anormalidades específicas assim como seu impacto sobre a fertilidade ainda são controversos (Howard et al., 1986; Wildt et al., 1987), porém dificilmente espermatozóides com defeitos maiores na cabeça, danos acrossomais ou cauda fortemente dobrada podem participar da fertilização (Wildt et al., 1988). Howard et al. (1993) observaram que a zona pelúcida representa uma barreira para espermatozóides com defeitos na cabeça e, segundo Thundathil et al. (2000), espermatozóides com acrossoma anormal não possuem capacidade de aderir ao ovócito in vitro e, conseqüentemente, não apresentam fertilidade. Em conclusão, o protocolo proposto para coleta de sêmen em pumas (Puma concolor) adultos mantidos em cativeiro mostrou-se eficiente, com obtenção de ejaculados livres de contaminação com urina, em concentração e total de espermatozóides superiores ao relatado na literatura e com índice espermático satisfatório, sendo assim recomendado a ser utilizado em programas de reprodução assistida desta espécie. Embora com altas taxas de espermatozóides com patologias, apenas um indivíduo dentre os pumas avaliados mostrou-se teratospérmico. As patologias mais frequentemente observadas foram cauda fortemente dobrada ou enrolada, cauda dobrada ou enrolada e cauda enrolada na cabeça. Rev. Bras. Reprod. Anim., Belo Horizonte, v.34, n.4, p , out./dez Disponível em 257

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