Pró-Reitoria Acadêmica Escola de Saúde e Medicina Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Gerontologia

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1 1 Pró-Reitoria Acadêmica Escola de Saúde e Medicina Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Gerontologia AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS micrornas, mir-1248, mir-181a E mir-151a-3p, EM IDOSOS PORTADORES DE LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA Autora: Simone Cruz Longatti Orientadora: Profa. Dra. Karla Helena Coelho Vilaça Co-Orientadora: Profa. Dra. Cintia do Couto Mascarenhas Brasília - DF 2015

2 SIMONE CRUZ LONGATTI AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS micrornas, mir-1248, mir-181a E mir-151a-3p, EM IDOSOS PORTADORES DE LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu em Gerontologia da Universidade Católica de Brasília, para obtenção do Título de Mestre em Gerontologia. Orientadora: Profa. Dra. Karla Helena Coelho Vilaça Co-Orientadora: Profa. Dra. Cintia do Couto Mascarenhas Brasília 2015

3 L848t Longatti, Simone Cruz. Avaliação da expressão dos micrornas, mir-1248, mir-181a E mir- 151a-3p, em idosos portadores de leucemia linfocítica crônica. / Simone Cruz Longatti f.: il.; 30 cm Dissertação (Mestrado) Universidade Católica de Brasília, Orientação: Profa. Dra. Karla Helena Coelho Vilaça Coorientação: Profa. Dra. Cintia do Couto Mascarenhas 1. Gerontologia. 2. Envelhecimento. 3. Leucemia linfocítica crônica. 4. mirnas. I. Vilaça, Karla Helena Coelho, orient. II. Mascarenhas, Cintia do Couto, coorient. III. Título. CDU Ficha elaborada pela Biblioteca Pós-Graduação da UCB

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5 Aos meus amados pais, Ana Ivanildes Cruz Longatti e Sidney Maurício Longatti.

6 AGRADECIMENTO Agradeço à Deus. À minha querida família por entender as constantes ausências. À minha orientadora, Karla Helena Coelho Vilaça e à minha coorientadora, Cintia do Couto Mascarenhas, pelo comprometimento, pela paciência de sempre e principalmente pelo acolhimento em vários momentos dessa jornada. Ao meu colega de bancada Manoel Benício, pela grande paciência de me ensinar os passos iniciais da rotina e os cuidados em trabalhar com RNA. Aos meus grandes e queridos amigos de trabalho da UCB, por estarem sempre ao meu lado. Aos meus amigos da pós-graduação pelos prazerosos momentos de descontração no intervalo das aulas. Aos pacientes e idosos que participaram desse trabalho, pois sem o consentimento de cada um, o estudo seria impossível. Agradeço também à banca examinadora, pela disponibilidade e tempo dispendidos na avaliação deste trabalho.

7 RESUMO LONGATTI, Simone. Avaliação da expressão dos micrornas mir-1248, mir-181a e mir-151a-3p em idosos portadores de leucemia linfocítica crônica. Dissertação (Mestrado em Gerontologia) - Programa de Pós- Graduação Stricto Senso em Gerontologia, Universidade Católica de Brasília, Brasília, O envelhecimento é um processo complexo e multifatorial que inclui alterações fisiológicas, moleculares e genéticas que levam ao declínio funcional de tecidos e órgãos, provocando o aumento da suscetibilidade às doenças e consequente elevação das taxas de mortalidade. Nesse contexto, as doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) são frequentemente encontradas em idosos, principalmente as doenças onco-hematológicas, dentre elas a leucemia linfocítica crônica (LLC). Considerada essencialmente como uma doença de idosos, a LLC é uma patologia linfóide de infiltração clonal de células B encontradas na medula óssea (MO), no sangue periférico e nos linfonodos, sendo caracterizada como o tipo mais comum de leucemia em países ocidentais. A LLC expressa níveis elevados de proteínas anti-apoptóticas e níveis diminuídos de proteínas pró-apoptóticas, o que explica o aumento exacerbado de linfócitos B maduros. Além das alterações dos níveis de proteínas, a desregulação de micrornas (mirnas) tem sido associada à LLC. Inúmeros mirnas estão associados à suscetibilidade ao câncer, sugerindo um importante papel na carcinogênese. Além disso, vários mirnas também estão envolvidos na regulação de vias relacionadas a senescência celular e têm efeitos sobre a progressão do ciclo celular, sugerindo que os mirnas podem ser considerados bons biomarcadores no processo de senescência. O objetivo do estudo foi avaliar a expressão dos mirnas mir-1248, mir-181a e mir- 151a-3p por meio da qpcr em portadores de LLC e comparar com o grupo de idosos sem a doença. A expressão do mir-181a foi significativamente reduzida nos pacientes com LLC quando comparada aos indivíduos do grupo sem LLC. No entanto, o estudo demonstrou que não houve diferença na expressão dos mirnas nos grupos em relação à idade e ao sexo. É possível sugerir que esses mirnas possam atuar como prováveis reguladores no envelhecimento,

8 porém, estudos futuros poderão determinar o mecanismo da expressão dos mesmos, bem como discutir a melhor forma de utilizá-los como ferramentas diagnósticas e terapêuticas para o envelhecimento e doenças relacionadas à idade, como por exemplo a LLC. Palavras-chave: Envelhecimento, Leucemia linfocítica crônica, mirnas.

9 ABSTRACT Aging is a complex and multifaceted process that includes physiological, molecular and genetic changes that lead to functional decline of tissues and organs, leading to increased susceptibility to disease and consequent increase of mortality rates. In this context, chronic non-communicable diseases (NCDs) are often found in the elderly, especially the onco-hematologic diseases, including chronic lymphocytic leukemia (CLL). Considered as essentially a disease of the elderly, CLL is a disease of clonal lymphoid infiltration of B cells found in the bone marrow (BM), peripheral blood and lymph nodes, and characterized as the most common type of leukemia in Western countries. LLC expresses high levels of anti-apoptotic proteins, and decreased levels of proapoptotic proteins, which explains the exaggerated increase of mature B lymphocytes. In addition to changes protein levels, deregulation of micrornas (mirnas) have been associated with the LLC. Numerous mirnas are associated with susceptibility to cancer, suggesting an important role in carcinogenesis. In addition, several mirnas are also involved in the regulation pathways related to cell senescence and have effects on cell cycle progression, suggesting that mirnas can be considered good biomarkers in the senescence process. The aim of the study was to evaluate the expression of mirnas mir- 1248, mir-181a and mir-151a-3p by qpcr in patients with LLC and compare with the elderly group without the disease. The expression of mir-181a was significantly reduced in patients with CLL compared to individuals in the group without LLC. However, the study showed no difference in the expression of mirnas in the groups with respect to age and sex. It is possible to suggest that these mirnas can act as regulators likely in aging, however, future studies will determine the mechanism of expression of the same, and to discuss how best to use them as diagnostic and therapeutic tools for aging and age-related diseases such as CLL. Keywords: Aging, Chronic lymphocytic leukemia, mirnas

10 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Prevalência das leucemias por faixa etária Figura 2 - Gráfico populacional com a transição demográfica no Brasil Figura 3 - Via IGF1-SIRT1-p53 na regulação da senescência celular Figura 4 - Incidência de LLC e outras neoplasias de células B por faixa etária Figura 5 - Citologia em sangue periférico de paciente portador de LLC Figura 6 - Análise imunofenotípica da LLC por citometria de fluxo Figura 7 - Ilustração dos mecanismos moleculares que levam a mutação da IgV H Figura 8 - Citogenética demonstrando a presença de del(11q) e del(13q) em paciente com LLC com del(11q) e del(13q) Figura 9 - Citogenética demonstrando a presença de trissomia do cromossomo 12 em um caso de LLC Figura 10 - Vias de sinalização na LLC Figura 11 - Principais fármacos utilizados no tratamento da LLC Figura 12 - Biogênese dos mirnas Figura 13 - mir-1248 e seus alvos, IL-5 e IL Figura 14 - Possíveis vias afetadas pelo mir-181a... 34

11 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Escala Perfomance Status de Karnofsk Tabela 2 - Escala Perfomance Status ECOG Tabela 3 - Sistema de estadiamento de Rai e Binet Tabela 1 (Artigo) - Descrição da sequência e localização dos mirnas estudados Tabela 2 (Artigo) - Dados demográficos e características dos pacientes com LLC Tabela 3 (Artigo) - Comparação entre o nível de expressão dos grupos avaliados... 45

12 LISTA DE ABREVIATURAS µ - Micro AKT - Serine-threonine protein kinase BCAP - Proteína adaptadora de célula B BCR - Receptor celular do antígeno B BTK - Tirosina quinase de Bruton CD - Local de diferenciação cdna - DNA complementar DAG - 1-2,diacilglicerol DNA - Ácido desoxirribonucleico DRM - Doença Residual Mínima ECOG - Eastern Cooperative Oncology Group EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético FAB - Classificação Francês-Americano-Britânico FISH - Hibridização fluorescente in situ FOXO - Forkhead box O g/dl - Gramas por decilitro Hb - Hemoglobina HBDF - Hospital de Base do Distrito Federal HCH - Hepatocarcinoma hepático IGF Insulin / insulinike growth fator IGHV - Região de Cadeia Pesada da Imunoglobulina Variável ITMAs - Imunoreceptores de ativação baseados em tirosina LLC - Leucemia Linfocítica Crônica MO - Medula Óssea mirna - microrna ml - Mililitro NF-κB - Fator nuclear κb NK - Célula natural killer ng - Nanograma PCR - Reação em Cadeia da Polimerase qpcr - Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real PFS - Sobrevida Livre de Progressão

13 PI3K - Fosfatidilinositol-3 quinase PIP2 - Fosfatidilinositol-4,5-bifosfato PIP3 - Fosfatidilinositol-4,5-trifosfato PLC-γ - Fosfolipase C-γ PS - Performance status PTEN - Fosfatase e homológo de tensina RNA - Ácido ribonucleico RNAm - RNA mensageiro TCLE - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TOR - Target of rapamycin UTR - Untranslated region (região não traduzida) ZAP-70 - Zeta Proteína Associada

14 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Envelhecimento Envelhecimento e o câncer Envelhecimento celular Leucemia linfocítica crônica (LLC) Estratificação da doença Avaliação de prognóstico Perfil gênico na LLC Vias de sinalização Tratamento mirnas mirna mirna-181a mirna-151a-3p OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos ARTIGO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXO I Parecer Cep/UCB ANEXO II Parecer Cep/FEPECS APÊNDICE I Termo de Consentimento Livre e Esclarecido... 64

15 4 1 INTRODUÇÃO O envelhecimento biológico é um processo complexo modulado por várias vias moleculares envolvidas na homeostase celular e tissular (OLIVIERI et al., 2012). Apesar das evidências de que a senescência é um importante fator de risco para doenças, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares que ligam o processo de envelhecimento às várias patologias. Portanto o grande interesse da pesquisa sobre o envelhecimento é inspirado no prolongamento do tempo de vida nas populações (KOLOVOU et al., 2014), sendo que um dos principais motivos é identificar biomarcadores moleculares que poderiam ser utilizados no diagnóstico, prognóstico e na resposta a terapia das doenças relacionadas ao envelhecimento. A investigação sobre o envelhecimento tem sido estudada a partir das vias de sinalização IGF (Insulin/insulinike growth factor) e TOR (target of rapamycin), pois são importantes vias relacionadas à divisão, proliferação e diferenciação celular. Um estudo mostrou que a inibição destas vias pode prolongar a longevidade em organismos, como o nematoide Caenorhabditis elegans (KENYON, 2010). No entanto, fatores que promovem a ativação precoce dessas vias resultam na perda da estabilidade genômica e consequente alteração dos mecanismos celulares, levando à senescência (GOROSPE; ABDELMOHSEN, 2011), sendo originalmente descrita como uma forma de envelhecimento celular causada por danos incluindo a encurtamento dos telômeros (perda das extremidades dos cromossomos por redução progressiva), a ativação de oncogenes, irradiação, defeitos no reparo de DNA e estresse oxidativo (MOWLA et al., 2014). A senescência celular está relacionada a complexas mudanças na morfologia da célula, assim como na sua estrutura e função (RODIER; CAMPISI 2011). Esse mecanismo não ocorre de maneira harmonizada em todos os tecidos, de modo que durante este processo existem meios que levam a alteração da divisão de maneira irreversível, levando a parada da divisão celular das células danificadas ou com perda de função, o que contribui para a diminuição do desenvolvimento tumorigênico. Entretanto, tal mecanismo também conduz a um acúmulo de células senescentes nos tecidos. Essas células não estão totalmente inativas, e podem promover danos teciduais (BAKER et al., 2011).

16 5 Dentre os mecanismos do envelhecimento a redução dos telômeros está associada a alterações metabólicas e a parada irreversível do crescimento nas células senescentes (BOCCARDI; HERBIG, 2012). Além disso, fatores adicionais envolvem mudanças no processamento de proteínas, expressão gênica e micrornas (mirnas). À medida que os principais fatores relacionados a senescência são esclarecidos, a disfunção dessas vias parece ocorrer em estados patológicos (DIMMELER; NICOTERA, 2013). Com o processo de envelhecimento, diversas doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) têm aumentado sua incidência, principalmente as doenças neoplásicas. Além de influenciar na biologia tumoral, a idade é um fator de risco para o desenvolvimento de câncer (NETTO, 2006). Indivíduos com mais de 65 anos têm quase 10 vezes mais chance de desenvolver neoplasias quando comparados com pessoas com idade inferior (DUARTE, 2006). Por isso e outros fatores, a geriatria oncológica está sendo amplamente explorada na elucidação dos mecanismos patológicos. Dentre as várias doenças onco-hematológicas, a leucemia linfocítica crônica (LLC) é a mais prevalente nos idosos (Figura 1). De acordo com registros do Surveillance Epidemiology and End Results (SEER), aproximadamente 75% dos pacientes diagnosticados com LLC têm mais de 65 anos de idade no momento do diagnóstico (SHANAFELT, 2013). Caracterizada por ser uma doença onco-hematológica linfóide que promove o desequilíbrio na expansão clonal de linfócitos B maduros que infiltram a medula óssea (M.O.), o sangue periférico e frequentemente os linfonodos. As células clonais da LLC apresentam um perfil imunofenotípico caracterizado por expressar os antígenos de superfície celular CD5, CD19, CD20 e CD23, além de baixos níveis de imunoglobulina (Ig) de superfície (HALLEK et al.; 2008). A taxa de sobrevida na LLC é de cerca de 5 anos, e as estratégias de tratamento são altamente individualizadas de acordo com o estadiamento da doença e a estratificação do risco em que cada paciente se encontra. Nos estágios iniciais e estáveis da doença alguns pacientes permanecem apenas em observação sem necessidade de intervenção terapêutica, outros pacientes que apresentam doença avançada ou clinicamente progressiva são submetidos a diferentes tipos de terapia (KHAN et al.; 2014).

17 6 Figura 1 Prevalência das leucemias por faixa etária. Em vermelho, a leucemia linfocítica aguda (LLA) representa a grande porcentagem de crianças diagnosticadas. Em azul, a leucemia mielóide aguda (LMA), com alta prevalência em adultos jovens. Em verde, a leucemia mielóide crônica (LMC) representando grande número de indivíduos com média de idade de 50 anos. E a leucemia linfocítica crônica (LLC), representada em azul claro, mostrando a alta prevalência em idosos. Não estão totalmente esclarecidos os mecanismos moleculares responsáveis pela expansão clonal destas células leucêmicas e o desenvolvimento da LLC, porém alguns estudos mostram que esta acumulação progressiva de linfócitos se deve a defeitos na apoptose, definida como um importante mecanismo de autodestruição celular (MEINHARDT; WENDTNER; HALLEK, 1999; MESSMER et al., 2005; RINGSHAUSEN et al., 2002). A LLC expressa níveis elevados de proteínas antiapoptóticas e níveis diminuídos de proteínas pró-apoptóticas (GAIDANO et al., 1994), o que explica o aumento exacerbado de linfócitos B maduros. Além das alterações dos níveis de proteínas, a desregulação de micrornas (mirnas) tem sido associada à LLC (STAMATOPOULOS et al., 2009). Os mirnas são moléculas de fita simples de RNAs não codificantes que possuem 18 a 25 nucleotídeos de comprimento e interferem em inúmeros processos celulares significativos, atuando na fase pós-transcricional. O processo da biogênese dos mirnas maduros é iniciado com a transcrição de precursores longos que são processados por vários complexos enzimáticos (CHEN et al.; 2004).

18 7 Suas funções reguladoras envolvem processos biológicos, incluindo desenvolvimento, diferenciação, apoptose, sobrevida, senescência e metabolismo celular (CORTEZ et al.; 2011). Várias centenas de mirnas foram identificados e estudados até o momento, porém ainda existem muitos outros mirnas cujo significado e papel em processos patológicos ainda não foram esclarecidos. Curiosamente, um número significativo de mirnas estão associados à suscetibilidade ao câncer, sugerindo um importante papel na carcinogênese (CALIN; CROCE, 2006). Porém, inúmeros mirnas também estão envolvidos na regulação de vias relacionadas a senescência celular e têm efeitos sobre a progressão do ciclo celular. Estudos relatam que alguns mirnas estão diferencialmente expressos no soro ou plasma dos indivíduos durante o envelhecimento (OLIVIERI et al. 2012; NOREN HOOTEN et al., 2013). Em outro estudo, Creemers et al. (2012) relataram que os mirnas podem circular em ambientes extravasculares como o sangue e outros fluidos biológicos e são estáveis. Isto eleva a probabilidade de que os mirnas circulantes podem ser considerados bons biomarcadores por possuírem estabilidade em fluidos biológicos, especificidade dos tecidos, além da possibilidade de quantificação por meio de técnicas simples e confiáveis. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo avaliar os níveis de expressão dos mirnas séricos, mirna-181a, mirna-1248 e mirna-151a-3p, em idosos portadores de LLC.

19 8 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ENVELHECIMENTO De acordo com o censo Brasileiro de 2010, o país possui aproximadamente 20 milhões de pessoas com 60 anos ou mais. Nas últimas décadas, o Brasil tem revelado uma nova conformação populacional com importantes modificações na estrutura etária (Figura 2). O percentual relativo dos idosos no período compreendido entre 1999 a 2009 aumentou de 9,1% a 11,3% (BRASIL, 2010). Atualmente, uma em cada dez pessoas tem 60 anos ou mais, em nível mundial e, estima-se que em 2050 essa relação aumente de 1:5, sendo que o número de centenários elevará 15 vezes de 1999 a 2050 (IBGE, 2010). Figura 2 Gráfico populacional mostrando a previsão da mudança conformacional da população brasileira no período de 2000 a Em azul, a representação da população masculina e em vermelho, a população de mulheres. É importante notar que o aspecto em pirâmide ganha uma nova forma, em diamante, com o aumento da faixa etária. Fonte: IPEA, 2013.

20 9 Segundo Kolovou et al. (2014), o envelhecimento pode ser definido como um processo multifatorial esperado que inclui a soma de alterações fisiológicas, moleculares e genéticas que ocorrem com o passar do tempo, desde a fecundação até a morte. Muitas dessas mudanças evidenciadas no envelhecimento levam a um aumento significativo no número de idosos com câncer. 2.2 ENVELHECIMENTO E O CÂNCER Estima-se que 42% de todos os casos e mais de 60% da mortalidade ocorrem devido ao câncer em pessoas com idade acima de 70 anos (PUTS et al., 2015). Em geral, a população idosa é muito heterogênea em relação à saúde e às características funcionais, psicológicas, sociais, culturais e econômicas. As funções fisiológicas, como renal, pulmonar e cardíaca, tendem a diminuir com a idade e influenciam nos riscos e benefícios do tratamento oncológico. Por isso, a decisão do tratamento para idosos com câncer é ainda mais difícil, pois frequentemente as comorbidades estão associadas ao perfil desses pacientes oncológicos. Consequentemente, essas doenças tem impacto na expectativa de vida, eficácia e tolerância do tratamento (PUTS et al., 2015). Sendo assim, em idosos oncológicos é amplamente utilizado o Performance status (PS) ou Escala de desempenho, definido como sistema de escore relacionado à avaliação do bem-estar geral dos pacientes. Utilizada principalmente na determinação da viabilidade de quimioterapia e ajuste de doses terapêuticas, dois sistemas são frequentemente usados, o Karnofsk e o Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) A escala de desempenho de Karnofsk classifica os pacientes de acordo com o nível de capacidade funcional (Tabela 1). A definição da funcionalidade do idoso é dada de acordo com uma pontuação de 100 a 0. Em ensaios clínicos oncológicos, a escala ECOG é utilizada para mensurar a qualidade de vida dos idosos. Considerada mais simples que a escala de Karnofsk, o score é de avaliação varia de 0 a 4, conforme descrito na Tabela 2.

21 10 Score Nível de capacidade funcional Definição 100 Normal, sem queixas e sem evidencias de doença. Capaz de desenvolver Capaz de desenvolver atividades atividades normais e 90 normais com sinais e sintomas discretos de doença. trabalhar. Sem necessidade de cuidados 80 Atividades normais com esforço, porém especiais com alguns sinais e sintomas de doença. Cuida de si mesmo, porém é incapaz de Incapaz de trabalhar; 70 exercer uma atividade normal ou a Capaz de desenvolver exercer trabalho ativo. atividades domésticas e Requer assistência esporádica, mas é necessidades pessoais; 60 capaz de cuidar da maioria de suas Dependente em vários necessidades. graus de necessidades Requer assistência considerável e 50 assistenciais. frequentes cuidados médicos. Incapaz, necessita de cuidados 40 especiais. Incapaz de cuidados Seriamente incapaz, com indicações pessoais; 30 hospitalares indicadas, porém se risco Requer cuidados de morte. hospitalares; Hospitalização é necessária, com Doença em atividade e 20 doença em atividade e necessidade de progressivamente rápida. suporte terapêutico constante. 10 Moribundo com rápida progressão fatal. 0 Óbito. Tabela 1 Escala Perfomance Status de Karnofsk. Fonte: Adaptado de Oken et al. (1982)..

22 11 Performance status Definição 0 Totalmente ativo; sem restrição de desempenho. Restrição de atividade física extenuante; capaz de realizar 1 atividades diárias. Capaz de cuidar de si mesmo, porém incapaz de qualquer 2 atividade diária. Limitação para cuidar de si mesmo; confinado na cama ou 3 cadeira. Completamente incapaz, sem realizar qualquer cuidado de si 4 mesmo; totalmente confinado na cama ou cadeira. Tabela 2 Escala Perfomance Status ECOG. Fonte: Adaptado de Oken et al. (1982). Sabendo que o princípio central da gerontologia compreende os mecanismos fisiopatológicos das doenças relacionadas à idade em um contexto multifatorial, que é o processo do envelhecimento, é importante entender as vias moleculares e as consequências das alterações na senescência. Apesar da importante influência dos fatores ambientais, o envelhecimento pode ser consequência de fatores genéticos relevantes que desempenham um papel definitivo na regulação da vida (Noren Hooten et al., 2013).

23 ENVELHECIMENTO CELULAR Em 1965, Hayflick descreveu que a maioria das células in vitro se divide por um número finito de vezes, depois elas entram na fase G1 do ciclo celular, levando a parada da divisão celular, esse estágio é denominado de senescência celular (HAYFLICK, 1965). Apesar de não sofrerem o processo de divisão celular as células senescentes podem permanecer viáveis e metabolicamente ativas nos tecidos por um longo período, contribuindo para o desenvolvimento de alterações metabólicas relacionadas ao avanço da idade (RODIER; CAMPISI, 2011). A senescência celular é desencadeada por inúmeros fatores que incluem danos do DNA, diminuição de telômeros, estresse oxidativo e alteração nos mecanismos de apoptose ocasionando modificações nas vias que regulam oncogenes (CAMPISI, 2005). Em relação aos fatores genéticos associados ao envelhecimento celular, os genes associados à longevidade e que estão na via da AKT/mTor, tais como o fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF1), receptor de IGF-1 (IGF1R), fosfatidilinositol-3 quinase (PI3K), fosfatase e homólogo de tensina (PTEN), AKT (serine-threonine protein kinase) e FOXO (Forkhead box O) desempenham funções importantes em processos fisiológicos como a manutenção celular (CHRISTENSEN et al., 2006). Sendo assim, os genes que atuam no envelhecimento parecem não ser afetados pela seleção natural. O envelhecimento parece ocorrer como uma consequência dos efeitos pleitrópicos de genes que estão envolvidos nos diversos processos, incluindo diferenciação e manutenção celular (PARTRIDGE; GEMS, 2002). Uma atenção especial é dada ao IGF1, que é um fator de crescimento composto por proteínas que atuam em mecanismos celulares de células normais e de câncer (MAKI, 2010). Além de desempenhar um papel mitogênico, a ativação do IGF1 leva modificação na regulação da via PI3K/AKT, intercorrendo no aumento da sobrevida, crescimento e proliferação celular (BLUME-JENSEN; HUNTER, 2001). Quando o sinal do IGF1 está aumentado, ocorre a inibição do SIRT1, uma desacetilase dependente de NAD. A redução da atividade de SIRT1 ativa o supressor tumoral p53, que promove a parada do crescimento celular e consequentemente à senescência. (TRAN et al., 2014) (Figura 3).

24 13 Figura 3 A via IGF1-SIRT1-p53 desenvolve um importante papel na regulação da senescência celular. O aumento do sinal do fator de crescimento IGF1 conduz à inibição da atividade de SIRT1, que resulta na hiperacetilação de p53, promovendo assim a parada do crescimento celular em G1. Adaptado de TRAN et al, A disfunção do p53 está relacionada com a perda do controle da atividade replicativa celular, podendo aumentar a chance de mutações gênicas e consequentemente o surgimento de câncer. Está claro na literatura a importância do gene p53 como supressor tumoral, assim como nos processos de envelhecimento e senescência celular (RODIER et al., 2007). Além disso, este gene também controla a expressão de mirnas, pequenos RNAs não codificantes, que regulam a senescência (TAZAWA et al., 2007). A desregulação dos mirnas tem sido também discutida em diferentes doenças onco-hematológicas. Uma fração significativa de mirnas mapeia as regiões relacionadas à suscetibilidade ao câncer, sugerindo uma relevante atuação dos mirnas à carcinogênese (CALIN; CROCE, 2006). Em 2002, Calin et al. identificaram os mirnas, mir15-a e mir16-1 como potenciais na patogênese da LLC. Esses mirnas estão localizados na região cromossômica 13q14.3 e frequentemente estão deletados ou menos expressos na leucemia linfocítica crônica (LLC) (CALIN et al., 2002), mostrando que os mirnas podem ser importantes na tumorigênese (AQEILAN et al., 2010).

25 LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA (LLC) A LLC é uma patologia linfoide definida como a expansão clonal de pequenas células B que infiltram a MO, sangue periférico e frequentemente os linfonodos (HALLEK et al., 2008). A maior parte da população acometida é de idosos com média de idade de aproximadamente 72 anos, considerada essencialmente uma doença de idosos (Figura 4). Em decorrência das mudanças demográficas previstas, a prevalência da doença tende a aumentar. Sendo caracterizada como o mais comum tipo de leucemia em países ocidentais, trata-se de uma doença de incidência de 4,1/ habitantes nos Estados Unidos, em que indivíduos do sexo masculino são mais acometidos quando comparado às mulheres, em uma proporção de 1,7:1 (MOLICA, 2006). Figura 4 Incidência de LLC e outras neoplasias de células B por faixa etária. De acordo com a idade, a incidência das neoplasias de células B maduras aumenta na população progressivamente, em especial nos indivíduos a partir dos 60 anos. Fonte: modificado à partir de SANT et al., O diagnóstico de LLC requer a presença de pelo menos 5000 linfócitos/mm 3 no sangue periférico, sendo que o aspecto morfológico dessas células leucêmicas é caracterizado por linfócitos pequenos, maduros, com uma borda estreita de citoplasma e um núcleo denso com ausência de nucléolo discernível e cromatina

26 15 parcialmente agregada, podendo também ser evidenciada a presença de prólinfócitos. Outro achado morfológico muito característico na LLC é a evidência de restos celulares, definidos como Manchas de Gumprecht (Figura 5) (HALLEK et al., 2008). Figura 5 Esfregaço de sangue periférico de paciente portador de LLC. É possível visualizar linfócitos maduros, pequenos, com citoplasma de borda estreita e núcleo denso sem nucléolo e cromatina parcialmente agregada (setas azuis). Manchas de Gumprecht (setas vermelhas). Hemácias (setas verdes). Fonte: modificado à partir da imagem de WILLIAMS e WILKINS, O perfil imunofenotipíco da LLC é demonstrado por meio de citometria de fluxo (Figura 6) com expressão de antígenos de superfície celular associados a célula B (CD19, CD20 e CD23) e co-expressão de antígeno de células T (CD5). Os níveis de Imunoglobulina (Ig) de superfície, CD20 e CD79b são relativamente baixos quando comparados com as células B normais (HALLEK et al., 2008).

27 16 Figura 6 Análise imunofenotípica da LLC por citometria de fluxo. Tipicamente, as células B normais apresentam apenas expressão de CD20, representando 6% do total (população celular marcada em verde). Na LLC, a presença de linfócitos B com co-expressão de CD5 e CD20 é evidenciada (população correspondente a 42% das células analisadas em vermelho). Na porção inferior do gráfico, restos celulares são demonstrados em azul. Fonte: adaptado de ARMITAGE, Estratificação da doença A sobrevida global varia entre 18 meses a mais de 10 anos a partir da data de diagnóstico, dependendo da evolução das manifestações clínicas em cada paciente. Na grande maioria dos casos, a LLC apresenta um curso clínico benigno em que os pacientes são aptos a manter suas atividades habituais, seguido de uma fase tardia, com duração de até dois anos, na qual a escala de desempenho dos indivíduos se encontra comprometido por complicações relacionadas ao tratamento ou pelas próprias manifestações da doença. Em geral, infecções sistêmicas, eventos hemorrágicos graves e caquexia são as causas mais comuns de óbito dos pacientes com LLC (HALLEK, 2015). Com a finalidade de diferenciar os pacientes com patologia de comportamento benigno daqueles com doença progressiva rápida os sistemas de estadiamento são amplamente utilizados para a estratificação de risco. Dentre eles, estão o sistema de estadiamento de Rai (1975) e o de Binet (1981). Ambos descrevem três relevantes grupos de prognóstico de acordo com os resultados clínicos e laboratoriais (Tabela 3), baseados no exame físico e no hemograma. (EICHHORST et al., 2010).

28 17 Estádio Dados clínicos e laboratoriais Risco Sobrevida (média/anos) Rai 0 Linfocitose isolada ( 15x10 9 /L) Baixo >10 I / II Linfocitose e linfadenopatia Intermediário >8 Linfocitose com esplenomegalia e/ou Hepatomegalia, com ou sem linfadenopatia III / IV Linfocitose com anemia (Hb<11,0g/dl), com Alto 6,5 ou sem linfadenopatia ou organomegalia Linfocitose com plaquetopenia (< /mm 3 ), com ou sem linfadenopatia ou organomegalia Binet A Hb 10,0g/dL Baixo >10 Plaquetas 100x10 9 /L <3 regiões de linfonodos comprometidos B Hb 10,0g/dL Intermediário >8 Tabela 3 Plaquetas 100x10 9 /L 3 regiões de linfonodos comprometidos Estadiamento de Rai (1975) e Binet C Hb <10,0g/dL Alto 6,5 Plaquetas <100x10 9 /L (1981). Fonte: Modificado de HALLEK et al Os pacientes diagnosticados com a doença assintomática com score Rai 0 e Binet A, são apenas monitorados sem terapia. Já os pacientes com risco intermediário (Rai I/II e Binet B) e alto risco (Rai III/IV e Binet C) necessitam de intervenção terapêutica com agentes alquilantes, análogos de purina, terapia com anticorpos monoclonais, agentes alvo de vias de sinalização e drogas imunomoduladoras (HALLEK et al., 2008), descritos mais adiante Avaliação de prognóstico Mesmo com os sistemas de estadiamento para estratificar os pacientes em diferentes grupos, outros fatores prognósticos são necessários na avaliação global dos indivíduos. Dentre eles, o tempo de duplicação linfocitária (TDL) e a expressão de proteína quinase associada a cadeia Zeta (ZAP-70) e CD38 relacionado com a

29 18 expressão em genes que se encontram na região variável da cadeia pesada de imunoglobulinas (IgV H ) não-mutados. O TDL é definido como o número de meses para que os linfócitos se duplicam em números absolutos. Assim, um TDL< 6 meses está diretamente associado a uma elevada taxa de proliferação e consequentemente, a uma doença mais agressiva (ROSENQUIST et al., 2013). Estado mutacional de IgV H e expressão de ZAP-70 e CD38: As células leucêmicas expressam uma imunoglobulina que podem ou não sofrer mutações somáticas em genes que se encontram na região variável da cadeia pesada de imunoglobulinas (IgV H ). Pacientes com IgV H mutado têm a doença indolente e exibem uma evolução clonal mínima ao longo do tempo. Por outro lado, pacientes sem a mutação do IgV H apresentam um prognóstico desfavorável (HERTLEIN et al., 2013). Essa importante subclassificação na LLC confere significativo acompanhamento como excelente marcador prognóstico além de ser amplamente aceito como um dos indicadores mais estáveis e confiáveis no desfecho clínico (GHIA et al.,2007; LANGERAK et al., 2011). A figura 7 ilustra os diferentes mecanismos da fisiopatologia da doença que são conhecidos no envolvimento de IgV H mutado e IgV H não-mutado. O aumento dos níveis de expressão de CD38 e ZAP-70 em células tumorais da LLC está relacionado com IgV H não-mutados, o qual está associado a uma patologia com curta expectativa de sobrevida e recidivas após o tratamento (HALLEK et al., 2008).

30 19 Figura 7 Ilustração dos mecanismos moleculares que levam a mutação da IgV H. Mutações no gene NOCTH1 e inibição do BIRC3 inibe a via NF-κB diminuindo a proliferação celular. Ao contrário, o aumento da sinalização da via NF-κB promove a elevada proliferação celular, visto na IgV H não-mutado. Além disso, o bloqueio de TP53 por deleção e/ou mutação conduz à interrupção da parada do ciclo celular resultando no aumento da sobrevida celular. Adaptado de ROSENQUIST et al, Perfil gênico na LLC Ao contrário de outras doenças linfoproliferativas crônicas, a LLC não possui nenhuma alteração citogenética característica. As técnicas normalmente empregadas para avaliação das deleções e aberrações cromossômicas em pacientes com LLC são as de bandeamento (cariótipo) e de análise de hibridização fluorescente in situ (FISH) (PASQUINELLI, et al., 2000; HAFERLACH et al., 2007). Deleções do braço longo do cromossomo 11 (del (11q)) podem ser encontrados em aproximadamente 25% dos pacientes sem tratamento quimioterápico com doença avançada e em 10% dos pacientes em estágio precoce da doença (ZENZ et al., 2010; QUESADA et al., 2012). Os pacientes portadores dessa deleção apresentam uma linfadenopatia volumosa, rápida progressão da doença e reduzida sobrevida global. Porém, mesmo com esses fatores de mau prognóstico, os pacientes respondem bem ao tratamento quimioterápico.

31 20 As deleções no braço longo do cromossomo 13, que envolve especificamente a região 13q14 (del(13q14)) representam a aberração citogenética mais frequente nos pacientes com LLC (Figura 8), ocorrendo em aproximadamente 55% de todos os casos. Porém, quando essa deleção se encontra isolada, está associada a um curso benigno da doença. Os mirnas, mir-15a e mir16-1 também estão localizados na região 13q14 (CALIN et al., 2002) e podem desempenhar um importante papel na leucemogênese da LLC (KLEIN et al., 2010). Figura 8 Citogenética convencional demonstrando a presença de deleção do braço longo dos cromossomos 11 (seta azul) e 13 (seta vermelha) em cariótipo de um paciente com LLC com del(11q) e del(13q). Fonte: modificado de KIEFER et al. (2012). Deleções do braço curto do cromossomo 17 (del(17p)) são encontradas em 5-8% dos pacientes sem quimioterapia. Essas deleções são quase sempre encontradas na região 17p13, onde o gene supressor tumoral TP53 está localizado. Pacientes com del(17p) apresentam resistência aos quimioterápicos genotóxicos (HALLEK et al., 2010). As mutações no gene TP53 são encontradas em 4-37% dos pacientes com LLC, têm sido associados a um mau prognóstico da doença (ZENZ et al., 2010) e são também associadas a uma grande complexidade genômica na LLC (SEIFFERT et al., 2012).

32 21 A trissomia do cromossomo 12 (+12) é observada em 10-20% dos pacientes (Figura 9), no entanto, os genes envolvidos na patogênese da LLC que possui essa aberração ainda não estão totalmente descritos. Além disso, a relevância prognóstica da trissomia do 12 continua sendo uma questão a ser discutida (SEIFFERT et al., 2012). Figura 9 Citogenética convencional demonstrando a presença de trissomia do cromossomo 12 (seta vermelha) em um caso de LLC. Fonte: Modificado de KIEFER et al. (2012). Sabendo-se que certas anormalidades citogenéticas estão associadas a um mau resultado clínico, um dos primeiros esquemas de classificação molecular no câncer foi evidenciado. A classificação de Döhner define uma hierarquia de mudanças genéticas detectadas por FISH que podem prever a progressão da doença e a sobrevida: del(17p) > del(11q) > trissomia 12 > del(13q) isolado, e assim moldar as possíveis estratégias terapêuticas (SUTTON; ROSENQUIST, 2015). Nos últimos anos, abordagens genômicas têm sido aplicadas para melhor elucidar o perfil gênico da LLC, consequentemente, novas alterações genéticas estão sendo reveladas, mais notavelmente as mutações nos genes NOTCH1, SF3B1 e BIRC3 (PUENTE et al., 2011). Alterações nesses genes ocorrem em 2-12% dos pacientes com LLC no momento do diagnóstico, no entanto, o aumento da prevalência durante as fases avançadas da doença confere um mau prognóstico da mesma (ROSSI et al., 2012; DEL GIUDICE et al., 2012; OSCIER et al., 2013).

33 22 Devido à relativa escassez da instabilidade genômica na LLC, as aberrações cromossômicas podem não ser as únicas responsáveis pela heterogeneidade clínica observada e mecanismos adicionais podem desempenhar importante papel nesse contexto (SUTTON; ROSENQUIST, 2015). Mutações nos genes supressores de tumores como TP53 e ATM foram identificadas anteriormente na LLC e podem afetar a resposta a terapia e consequentemente a sobrevida. As mutações de TP53 têm um alto impacto no resultado terapêutico do paciente com mau prognóstico e alta complexidade genética. Mais especificamente, no momento do diagnóstico a incidência de mutações em TP53 é de aproximadamente 4%, no entanto, à medida que a doença progride, essa incidência aumenta para 10-12% em paciente em 1ª linha de tratamento e aproximadamente 40% em pacientes refratários (OSCIER et al.; 2013). Apesar da grande atenção dada à identificação de genes mutados, a abordagem citogenética não pode negligenciar as vias de sinalização no microambiente, que fornecem importantes informações para as diversas estratégias de tratamento na LLC Vias de sinalização Para melhor compreensão da LLC, é essencial analisar o panorama do microambiente e a interação entre o receptor celular do antígeno B (BCR) em linfócitos B. As complexas interações entre as células B e seu microambiente promovem um desequilíbrio entre a proliferação celular e apoptose, sugerindo que a doença ocorra em decorrência do perfil anti-apoptótico e do acúmulo de células malignas (SMOLEWSKI et al., 2013). Além disso, a alteração na expressão e estímulo do BCR desempenha um importante papel na patogênese da LLC por meio da ativação de diferentes quinases como a tirosina quinase de Bruton (BTK), e a fofatidilinositol 3-quinase (PI3K) (BADER et al., 2009), que estimulam a sobrevivência de células malignas por meio de fatores transcricionais como o fator nuclear κb (NF-κB) (HALLEK, 2013; OPPEZZO; DIGHIERO, 2013; WU et al., 2013). O microambiente é constituído por componentes celulares, estruturais e solúveis dos compartimentos anatômicos onde se encontram as células leucêmicas, dentre eles sangue periférico, medula óssea e órgãos linfoides. A interação do microambiente tecidual e o sitio anatômico das células influencia no

34 23 desenvolvimento da LLC (KHAN et al., 2014). Além disso, existe uma complexa interação entre o BCR, quimiocinas, receptores de quimiocinas e moléculas de adesão, que é responsável pela direção, expansão e sobrevida das células B malignas (TEN HACKEN; BURGER, 2014). O BCR é uma proteína transmembrana do receptor composto por 2 partes: uma membrana específica do antígeno imunoglobulina ligada (Ig) e uma fração intracelular de sinal de transdução de cadeias da Igα (Igα, CD79a) / Igβ (Igβ, CD79b) (MUNK PEDERSEN; REED, 2004). A ativação do BCR levando a cascatas de sinalização intracelular pode ser induzida por antígeno ou pode ser antígeno independente. A estimulação do BCR resulta na ativação de várias vias de sinalização, incluindo a via PI3K / AKT / mtor e a via NF-κB, (Figura 10) levando a maturação e diferenciação da célula B (EFREMOV et al., 2012). A via PI3K é composta por lípides quinases que desempenham um papel fundamental nas funções celulares normais, tais como o crescimento celular, diferenciação, proliferação e sobrevivência (VANHAESEBROECK et al., 2010). A família PI3K é subdividida em três classes contendo 8 isoformas diferentes. A classe I compreende as isoformas PI3K α, β, γ, δ e age por fosforilação de vários fosfolípides de membrana. Cada isoforma PI3K de classe I é um heterodímero compreendendo uma subunidade catalítica p110 e uma subunidade regulatória p85 (VANHAESEBROECK et al., 2005; GUILLERMET-GUIBERT et al., 2008; BILANCIO; MIGLIACCIO, 2014). A ligação de um antígeno ao componente extracelular do antígeno específico BCR leva a fosforilação imunoreceptores de ativação baseados em tirosina (ITMAs) através das quinases Syk e Lyn. Os ITMAs são sequências específicas da região CD79a/b do BCR, responsáveis pela amplificação da sinalização pelo BCR (NIEMANN; WIESTNER, 2013). A ativação do PI3K ocorre pela ação de Lyn e Syk através da forsforilação do CD19 e da proteína adaptadora de célula B (BCAP), que fosforila a PIP2 (fosfatidilinositol-4,5-bifosfato) dando origem à PIP3 (fosfatidilinositol- 4,5-trifosfato), resultando no recrutamento de mediadores de sinalização, incluindo AKT, BTK e a fosfolipase C-γ (PLC-γ). A PLC-γ catalisa a hidrólise do PIP2, liberando os segundos mensageiros 1-2,diacilglicerol (DAG), responsável pela ativação da proteína C quinase (PKC), e PIP3, responsável pela reorganização do citoesqueleto celular e regulador das funções celulares como adesão celular através do fluxo de cálcio para o interior das células (KHAN et al., 2014).

35 24 O influxo de cálcio ativa diretamente alguns fatores transcricionais incluindo o fator nuclear κb (NF-κB), que desempenha um papel essencial no mecanismo antiapoptótico celular, por meio da regulação da proteína antiapoptótica Bcl-2 (B-cell lymphoma protein 2) (BUCHNER; MUSCHEN, 2014). A sinalização do BCR na LLC difere da encontrada em células B normais em vários aspectos. Nas células leucêmicas é possível observar uma diminuição na expressão da IgM de membrana, variação na resposta ao estímulo antigênico e ativação constante de determinadas quinases (WOYACH et al., 2012). Figura 10 Vias de sinalização na LLC. A ativação do BCR promove as cascatas de sinalização intracelular que pode ser induzida por antígeno ou pode ser antígeno independente. A estimulação do BCR resulta na ativação de várias vias de sinalização, incluindo a via PI3K / AKT / mtor e a via NF-κB, resultando na maturação e diferenciação da célula B. Adaptado de ROBAK e SMOLEWSKI, Tratamento Abordagem terapêutica inicial O tratamento de escolha utilizado em pacientes portadores de LLC é a combinação do anticorpo monoclonal rituximab com os citostatínicos fludarabina e

36 25 ciclofosfamida (FCR) ou com bendamustina (RB) (HALLEK et al., 2008). A combinação FCR parece ser mais eficaz que RB, porém pode resultar em mielossupressão prolongada e alta incidência de infecções oportunistas, não sendo bem tolerada principalmente em pacientes com idade mais avançada e portadores de comorbidades (LAURENTI et al., 2013). Nesses casos, a monoterapia com agentes alquilantes proporciona uma boa alternativa terapêutica na LLC, sendo o clorambucil (Clb) considerado padrão ouro durante várias décadas e ainda nos dias atuais. Sua baixa toxicidade, baixo custo e boa administração (via oral) são as vantagens mais relevantes, porém as principais desvantagens são a reduzida taxa de Remissão Completa (RC) e alguns efeitos colaterais importantes após uso prolongado como citopenias, mielodisplasia e leucemia aguda secundária (KONGNAKORN et al., 2014; FOA et al., 2014). Em pacientes portadores de comorbidades, a associação do Clb com anticorpos anto- CD20 é uma alternativa coerente (GOEDE et al., 2014). Dentre os análogos de purina, a monoterapia com fludarabina promove boa resposta terapêutica induzindo mais remissões e remissões completas (RC) em cerca de 7 40% dos casos quando comparada a outras terapias convencionais como CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona), CAP (ciclofosfamida, doxorubicina, prednisona), ou clorambucil, mas não melhorou sobrevida global quando utilizado como agente único (EICHHORST et al., 2009) Terapia com anticorpos monoclonais O marcador de células B maduras, CD20 é uma fosfoproteína glicosilada e expressa na maioria das células B malignas. Apesar de não ter a sua função totalmente esclarecida, suspeita-se que ele tenha ação como um canal de cálcio na membrana da célula (CRAGG et al., 2005). A introdução do rituximab, um anticorpo quimérico contra o antígeno CD20, em 1988 beneficiou o tratamento na LLC. A ação farmacológica do rituximab inclui ativação do complemento, opsonização de macrófagos levando à toxicidade mediada por células dependente de anticorpos, e indução de apoptose (VAN MEERTEN et al., 2006). Na LLC, o rituximab tem uma eficácia limitada como agente único, porém em combinação com quimioterapia melhores resultados podem ser vistos.

37 26 Apesar do rituximab, o ofatumumab, anticorpo monoclonal que tem como alvo um único epítopo na molécula de CD20, é eficaz em monoterapia, bem como em combinação com agentes quimioterápicos. Em decorrência da ligação específica ao seu alvo, o ofatumumab promove um aumento da afinidade de ligação ao antígeno CD20, uma taxa de dissociação prolongada e elevação da morte de células devido a maior toxicidade dependente de complemento (CASTILLO et al., 2009). Ao contrário do rituximab e ofatumumab, o obinutuzumab (GA-101) é um anticorpo produzido por glicoengenharia, especificamente direcionado à alça extracelular do antígeno transmembrana CD20, que age aumentando a toxicidade dependente de anticorpo e induz a morte de células não-apoptóticas mediada por lisossomas (ALDUAIJ et al., 2011). Em um estudo de fase III, a adição de obinituzumab ao Clb foi comparada com a combinação rituximab-clb e monoterapia por Clb. Os pacientes que receberam obinutuzumab tiveram melhor resposta, foram mais negativos para doença residual mínima (DRM) e apresentaram prolongada sobrevida livre de progressão (PFS) em comparação com a combinação rituximab- Clb (GOEDE et al., 2014). Dito isto, o obinutuzumab parece ser mais potente e melhor tolerado quando comparado ao rituximab. O alemtuzumab também é um eficaz anticorpo monoclonal. Foi aprovado nos EUA em 2001 para tratamento de pacientes portadores de LLC refratários à fludarabina. Trata-se de um anticorpo contra o antígeno CD52 com uma taxa de resposta variando de 33 a 53%, com uma média de duração da reposta em torno de 8,7 a 15,4 meses em pacientes em estágio avançado da doença e que foram previamente tratados com agentes alquilantes com recaída ou recidiva após terapia de segunda linha com fludarabina (RAI et al.; 2002). Além disso, o alemtuzumab pode ser considerado uma boa alternativa terapêutica para pacientes portadores de aberrações genéticas de alto risco como del(11q), del(17p) ou TP53 mutado (CARTRON et al.; 2014). Pacientes com esse perfil genético de risco podem apresentar uma reduzida resposta terapêutica, curta sobrevida global quando tratados com quimioterapia que induz o dano do DNA e subsequente apoptose (ZENZ et al., 2010). Porém, pacientes com esse perfil de risco tratados com alemtuzumab não apresentaram impacto sobre a PFS e sobrevida global, o que sugere uma eficácia do anticorpo anti-cd52 independente da via de sinalização p53 (HALLEK, 2015).

38 Agentes alvo da sinalização BCR A via de sinalização BCR desempenha uma importante função na sobrevida das células na LLC (MUNK PEDERSEN; REED, 2004). Várias drogas são eficazes na inibição dessa via. O Idelalisib é um inibidor seletivo da isoforma PI3Kδ que leva a uma diminuição da AKT e consequentemente comprometimento da sinalização do BCR, promovendo a apoptose de células leucêmicas sem induzir a apoptose de células T normais ou natural killer (NK). Essa citotoxicidade é independente de características genômicas, tais como as deleções cromossômicas del(11q) e del(17p) e estado mutacional da IgV H, sugerindo que o idelalisib é eficaz no tratamento de pacientes portadores de fatores prognósticos diversos, incluindo aberrações cromossômicas e mutações IgV H (KHAN et al., 2014). Além da via PI3K, a via BTK também pode ser inibida pela ação do ibrutinib, uma molécula pequena capaz de se ligar de forma covalente à cisteína 481 da BTK e assim interromper a ativação da via BCR. Essa ligação resulta na redução da migração e proliferação de células leucêmicas e consequente indução à apoptose (BROWN, 2013). Uma das grandes vantagens do ibrutinib é ser bem tolerado, com efeitos colaterais que incluem diarréia, fadiga e infecções das vias respiratórias superiores (DIAS; JAIN, 2013) Drogas imunomoduladoras A lenalidomida é uma droga imunomoduladora com ação na inibição de citocinas, tais como fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-7 (IL-7) e fator de crescimento endotelial, e estimulando as células T e NK. Além disso, essa droga é capaz de resolver mecanismos imunossupressores contra células T saudáveis induzidas por células do linfoma e assim, promove a chamada sinapse imune (RAMSAY et al., 2012). Sendo definida como sucessora da talidomida, a lenalidomida apresenta reduzidos efeitos colaterais e uma eficácia terapêutica maior, porém com alto potencial teratogênico (SHARMA et al., 2006). A combinação com rituximab promove o aumento na taxa de resposta global de 66%. O tratamento com lenalidomida causa neutropenia em mais de 78% dos casos, independente se for usando como monoterapia ou em combinação (BADOUX et al., 2013).

39 28 Além da neutropenia, pode ocorrer anemia, trombocitopenia em casos raros. Porém, no primeiro ciclo de tratamento pode ser evidenciada a presença de leucocitose, erupção cutânea, febre, dores abdominais, que pode se agravar em pacientes com insuficiência renal. Em geral, a lenalidomida é administrada em regimes de combinação (MAFFEI et al., 2015). A figura 11 mostra os principais agentes terapêuticos e seus locais de ação na LLC. Figura 11 - Principais fármacos utilizados no tratamento da LLC. Alemtuzumab é um anticorpo monoclonal que age CD52. Ofatumumab, Rituximab e GA101 atuam na ligação ao antígeno CD20. Idelalisib e Ibrutinib agem respectivamente nas vias PI3K e BTK. Lenalidomida promove a inibição de citocinas como TNF-α e IL-7. Fonte: Adaptado de TAUSCH et al. (2014). Diante das várias linhas de tratamento utilizadas na LLC, nos dias atuais, existe uma grande expectativa na possibilidade de se utilizar os micrornas como alvos terapêuticos nas vias de sinalização dessa doença, o que poderia levar a respostas mais eficazes e principalmente, na redução dos indesejados efeitos colaterais. Mais adiante, a descrição da biogênese dos mirnas.

40 mirnas Os mirnas são classes emergentes de genes reguladores endogenamente produzidos como pequenos RNAs não codificadores de proteínas. São altamente conservados em aproximadamente 22 nucleotídeos, sendo que a expressão do gene regula negativamente em nível pós-transcricional por meio de interações homólogas com a região 3 de UTR (região não traduzida) e, mais raramente com a região de codificação de RNA mensageiro alvo (AMBROS et al., 2003). Essas pequenas moléculas de RNA são usualmente encontradas em regiões intergênicas ou dentro de íntrons de RNAm conhecidos. Embora, o papel da maioria dos mirnas ainda não está totalmente esclarecido, dados experimentais em alguns deles mostram que eles estão envolvidos no desenvolvimento de células tronco embrionárias, diferenciação neonatal, diferenciação de adipócitos, secreção de insulina e, mais recentemente descrito no desenvolvimento de vários tipos de câncer (LAU et al., 2001). O primeiro mirna foi descoberto em 1993 na tentativa de entender a regulação de uma pequena região não codificadora (Lin-14) específica do nematóide Caenorhabditis elegans. Relatos científicos associam os mirnas ao papel regulador no desenvolvimento celular em vários organismos (PASQUINELLI et al., 2000; HE; HANNON, 2004). Os mirnas são formados a partir de longas transcrições que contem centenas ou milhares de nucleotídeos em regiões do genoma diferente daquelas tradicionalmente conhecidas por codificar proteínas, podendo se localizar dentro de íntrons (LEE et al., 1993). Em mamíferos, os mirnas são transcritos pela RNA polimerase II ou III no núcleo celular, dando origem aos mirnas primários (primirnas). Esses mirnas são caracterizados pela presença de uma ou mais estruturas em forma de grampo com regiões complementares imperfeitas (BARTEL, 2004). Uma única cópia do pri-mirna pode codificar apenas um mirna maduro (unidade monocistrônica) ou vários mirnas maduros (unidade policistrônica). As duas RNAs polimerases reconhecem as diferentes regiões promotoras e terminadoras do seguimento, proporcionando uma ampla variedade de mecanismos regulatórios no mecanismo celular (BARTEL, 2004; DU; ZAMORE, 2005; WINTER et al. 2009).

41 30 Os padrões de expressão dos mirnas maduros processados provenientes de uma única unidade policistrônica são muito semelhantes, indicado que eles são regulados pelo mesmo mecanismo regulatório. Uma vez transcritos, os pri-mirnas sofrem a primeira reação de maturação ainda no núcleo pela clivagem do complexo multiprocessador nuclear composto pela enzima Drosha (que é um tipo de RNase III), pela proteína DGCR8 (que interage especificamente e de forma estável com o pri-mirna) e por uma variedade de co-fatores associados (LEE et al., 2004). O pri-mirna é então processado a um precursor intermediário de 60 a 70 nucleotídeos, que é o pré-mirna. Alguns pri-mirnas intrônicos, depois do splicing, apresentam um tamanho apropriado e uma conformação em grampo semelhante ao pré-mirna. Nesse caso, essas estruturas são levadas diretamente ao citoplasma para as próximas etapas de processamento (RUBY et al., 2007). O pré-mirna retém a estrutura de grampo do pri-mirna com um fosfato 5 e duas extensões de nucleotídeos na região 3. Esse pré-mirna é então levado ao citoplasma pelo complexo Exportin-5-Ran-GTP-dependent (SIOMI; SIOMI, 2010). No citoplasma, o pré-mirna é então processado pelo complexo Dicer e perde a sua estrutura conformacional de grampo, dando origem a duas fitas simples de mirna de aproximadamente 15 a 22 nucleotídeos. Após o processamento pelo complexo Dicer e destruição do filamento complementar (também chamado de filamento passageiro, uma das fitas se liga à proteína Argonauta 2 é incorporado ao complexo de silenciamento de expressão do gene alvo, o RISC (RNA induced silencing complex). A outra fita simples é degradada (BARTEL, 2004; LEE et al., 2006; SIOMI; SIOMI, 2010). O RISC contendo o mirna maduro liga-se aos RNAm alvo na região 3 UTR ou em qualquer outra região que apresente complementariedade, o que leva ao aumento da diversidade de alvos de cada mirna (TAY et al. 2008). A figura 12 mostra como ocorre a biogênese do mirna.

42 31 Figura 12 Biogênese dos mirnas. A transcrição é realizada pela enzima Polimerase II dando origem ao pri-mirna. O complexo Drosha cliva os grampos formando o precursor do mirna (pré-mirna), que é carreado para o citoplasma pelo complexo Exportin-5. No citoplasma, o pré-mirna é incorporado ao complexo Dicer e perde a estrutura de grampo e dá origem ao mirna duplex (mirna de fita dupla). Esse mirna de fita dupla se liga à proteína Argonauta e uma das fitas é acoplada ao complexo RISC e a outra fita é degradada. O mirna/risc se liga ao RNAm alvo reprimindo sua tradução ou modulando sua regulação. Adaptado de CORTEZ et al., Um recente estudo utilizando sequenciamento gênico, mostrou que a maioria dos mirnas encontram-se regulados negativamente de acordo com a idade. Mais especificamente, o mirna-181a, mirna-1248 e mirna-151a-3p, se encontram significativamente reduzidos em idosos quando comparados a indivíduos jovens, sugerindo que os níveis de mirnas podem diminuir com o passar dos anos. Nesse estudo, foi avaliado um grupo composto por 20 jovens com média de idade de 30,6 anos e outro grupo composto por idosos com média de idade de 64,4 anos (NOREN HOOTEN et al., 2013). Como os três mirnas avaliados parecem ser importantes para a sobrevivência e desenvolvimento no organismo, é possível sugerir que a redução dos níveis de expressão desses mirnas pode resultar no desenvolvimento de fenótipos relacionados à idade, além de doenças associadas à idade. Isso fornece informações para o entendimento dos mecanismos moleculares e da fisiopatologia do processo do envelhecimento, o que leva a crer que mirnas séricos possam ser

43 32 usados como biomarcadores do processo de senescência (NOREN HOOTEN et al., 2013). O presente estudo propõe avaliar os níveis desses mirnas referidos acima, em idosos portadores de LLC de acordo com o estágio da doença e submetidos às várias linhas terapêuticas utilizadas no tratamento dessa patologia mirna-1248 O aumento da expressão do mir-1248 está relacionado às citocinas inflamatórias associadas a via NF-κB, que se encontra regulada negativamente. No entanto, as vias de reparo ao DNA estão reguladas positivamente diante da elevação dos níveis de expressão deste mirna, sugerindo que a redução dos seus níveis de expressão de acordo com a idade pode influenciar na capacidade de reparo ao DNA debilitado, o que é geralmente observado em idosos (JACOB et al., 2013). Um estudo realizado com pacientes asmáticos demonstrou que o mir-1248 age diretamente na região não traduzida 3 (3 UTR) da IL-5. Os ensaios realizados nesse estudo mostraram um aumento significativo da expressão do mir-1248 nos pacientes, sugerindo que esse mirna pode desempenhar um papel patogênico importante na asma, de tal modo que sua elevação significativa na doença poderia estar relacionada ao aumento dos níveis de citocinas mediadas pela resposta Th-2 (PANGANIBAN et al., 2012). O mir-1248 tem como alvo as interleucinas IL-5 e IL-13. Ambas participam da resposta inflamatória mediada pela via de células efetoras T helper-2 (Th-2), responsável pela secreção de citocinas pró-inflamatórias. Dentre as várias citocinas recrutadas nesse processo, estão a IL-4, IL-5 e IL-13 (ISHMAEL, 2011). Os linfócitos T CD4+ desempenham importante papel nos mecanismos imunológicos por intermédio de duas populações: Th1 e Th2. A subpopulação celular Th1 é produtora específica de interferon gama (IFN-γ), IL-2, fator de estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e fator de necrose tumoral (TNF), conhecidas como citocinas pré-inflamatórias (Figura 13). Ao contrário, a subpopulação Th-2 secreta citocinas específicas do tipo IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 que promovem a inativação dos macrófagos e ativação dos linfócitos B. Em especial, a IL-4 e IL-13 promovem nos linfócitos B ativados o aumento secretório

44 33 de Imunoglobulina E (IgE), enquanto a IL-5 atua como fator de sinalização de eosinófilos (MATTHAEI, FOSTER et al. 1997). Figura 13 Ilustração do mir-1248 e seus alvos IL-5 e IL-13. A resposta inflamatória mediada pela via de células efetoras T helper-2 (Th-2) é responsável pela secreção de citocinas pró-inflamatórias. O aumento dos níveis de expressão do mir-1248 promove a elevação de citocinas da via Th-2, principalmente Il-5 e Il mirna-181a O mir-181a está envolvido na via de sinalização da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) por estimular o seu fator transcricional AP-1 (proteína de ativação 1). Essa proteína contem dois importantes componentes reguladores do desenvolvimento de tumor hepático, c-jun e c-fos. O regulador c-jun promove o crescimento do tumor por meio da regulação do ciclo celular ou através da repressão dos seus reguladores negativos (KAPPELMANN et al., 2014). Além do aumento na atividade ou nos níveis de expressão de AP-1, outros fatores de transcrição também se mostraram afetados pelo mir-181a em células de carcinoma hepatocelular (HCC) da linhagem HepG2. Os fatores de transcrição envolvidos em NF-κB, Myc e MAPK também mostraram um aumento na atividade. Essas vias de sinalização são frequentemente ativadas em tumores que levam ao aumento da proliferação celular, angiogênese e redução do processo apoptótico. Esse mirna desempenha um importante papel no HCC ao ligar-se na região 3 UTR de duas proteínas que regula negativamente o ciclo celular, CDKN1β e E2F7 (Figura 14). (TAN et al., 2015).

45 34 De acordo com Yamashita et al.(2009), o mir-181a também está envolvido na via Wnt/β-catenina das células tronco hepáticas do hepatocarcinoma celular (HpSC- HCH). Essa via encontra-se ativada em aproximadamente 60% dos casos de hepatocarcinoma hepático (HCH) com elevados níveis de β-catenina no núcleo e no citoplasma, sugerindo que o mir-181a pode aumentar o crescimento de células tumorais no fígado (JI et al., 2009). Além do perfil tumorigêncio do mir-181a, Ramasamy et al. (2015) relataram que sua expressão está associado a resposta inflamatória no sistema cardiovascular. Nesse estudo, a expressão desse mirna encontra-se regulada negativamente durante a hipertrofia cardíaca fisiológica, sendo alvos, os genes MAPK1 e TNFα. O mir-181a protege o sistema contra danos causados por processos inflamatórios através da via NF-kB (RAMASAMY et al., 2015). Negrini et al. (2014) demonstraram que o mir-181a encontra-se regulado negativamente em pacientes portadores de LLC, o que sugere um improvável papel na patogênese da doença (NEGRINI et al., 2014). Suspeita-se que a desregulação do mir-181a poderia estar relacionada com a disfunção do complexo Dicer em pacientes com LLC (ZHU et al., 2012). Figura 14 Possíveis vias afetadas pelo mir-181a. O mir-181a ativa MAPK, que estimula o seu fator transcricional AP-1, promovendo a ativação dos reguladores, c-jun e c-fos, levando ao crescimento de tumores hepáticos através da regulação do ciclo celular ou da repressão dos seus reguladores negativos. Outra via ativada pelo mir-181a é a via Wnt/βcatenina das células tronco hepáticas promovendo a proliferação celular. Os fatores de transcrição envolvidos em NF-κB, Myc e MAPK também mostraram um aumento na atividade pela ação do mir-181a quando se encontra em elevados níveis de expressão.

46 mirna-151a-3p O mir-151a, localizado na região cromossomo 8q, está frequentemente associado a vários tipos de câncer incluindo de bexiga, rins, próstata, mama, pulmão, estômago e reto. (TAYLOR et al., 2010). O elevado número de cópias do mir151 em pacientes com câncer de próstata tem forte relação com eventos metastáticos (BARNABAS et al., 2011). Os dois mirnas maduros, mir151a-5p e mir151a-3p, são originados a partir do precursor mir151a, com sequencias diferentes e portanto, direcionados a diferentes RNAm. Em um estudo realizado com pacientes portadores de câncer de próstata, o mir151a-3p encontra-se regulado negativamente, sugerindo uma improvável relação com esse tipo de tumor. No entanto, o mir-151a-5p encontra-se em altos níveis de expressão e sua regulação positiva está relacionada a menor sobrevida dos pacientes com câncer de próstata (CHIYOMARU et al., 2012).

47 36 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL crônica. Avaliar a expressão de mirnas em idosos portadores de leucemia linfocítica 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS a) Avaliar a expressão do mir-1248, mir-181a e mir-151a-3p em idosos portadores de LLC acompanhados ambulatorialmente. b) Comparar a diferença de expressão dos mirnas entre o grupo de idosos com LLC e o grupo de idosos sem a doença. c) Analisar as características clínicas do grupo de pacientes estratificados de acordo com os sistemas de Rai e Binet e tratamento. d) Analisar a expressão dos mirnas de acordo com o sexo e idade nos grupos de idosos avaliados.

48 37 4 ARTIGO Avaliação da expressão dos mirnas, mir-1248, mir-181a e mir-151-3p, em idosos portadores de leucemia linfocítica crônica. *Simone Cruz Longatti 1 Cintia do Couto Mascarenhas 2 Rosangela Vieira de Andrade 3 Gislane Ferreira de Melo 4 Jorge Vaz Pinto Neto 5 Alexandre Nonino 6 Robert Pogue 7 Karla Helena Coelho Vilaça 8 Instituição: Universidade Católica de Brasília UCB Brasília Distrito Federal. Conflito de interesse: Os autores declaram não haver conflito de interesse. RESUMO Introdução: O envelhecimento é um processo multifatorial esperado que inclui alterações fisiológicas, moleculares e genéticas que levam ao declínio funcional de tecidos e órgãos, provocando o aumento da suscetibilidade às doenças e consequente elevação das taxas de mortalidade. Nesse contexto, as doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) são frequentemente encontradas em idosos, principalmente as doenças onco-hematológicas, dentre elas a leucemia linfocítica crônica (LLC). Considerada essencialmente como uma doença de idosos, a LLC é uma patologia linfóide de infiltração clonal de células B encontradas na medula 1 Mestre em Gerontologia pela Universidade Católica de Brasília UCB Brasília Distrito Federal. *Autor correspondente. Endereço: Avenida das Araucárias Lote 1655 Bloco C Residencial Acqua Village 107. Bairro: Águas Claras Brasília Distrito Federal CEP: simonelongatti@gmail.com. 2 Doutora em Clínica Médica pela Universidade Estadual de Campinas UNICAMP São Paulo. 3 Doutora em Ciências Biológicas pela Universidade de Brasília UnB Brasília Distrito Federal. 4 Doutora em Educação Física pela Universidade Católica de Brasília UCB Brasília Distrito Federal. 5 Doutor em Ciências Genômicas e Biotecnologia pela Universidade Católica de Brasília UCB Brasília. 6 Doutorando em Ciências Genômicas e Biotecnologia pela Universidade Católica de Brasília UCB Brasília. 7 Doutor em Human Genetics pela Newcastle University NCL Inglaterra. 8 Doutora em Investigação Biomédica pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto USP São Paulo.

49 38 óssea (MO), no sangue periférico e nos linfonodos, sendo caracterizada como o tipo mais comum de leucemia em países ocidentais. A LLC expressa níveis elevados de proteínas anti-apoptóticas e níveis diminuídos de proteínas pró-apoptóticas, o que explica o aumento exacerbado de linfócitos B maduros. Além das alterações dos níveis de proteínas, a desregulação de mirnas tem sido associada à LLC. Os mirnas são pequenas moléculas RNAs não codificadores de proteínas conservados em aproximadamente 22 nucleotídeos que regulam a expressão de genes a nível pós-transcricional. Alterações na expressão de mirnas podem estar associados ao envelhecimento e a processos carcinogênicos. Objetivos: O estudo teve como principal objetivo avaliar a expressão dos mirnas: mir-1248, mir-181a e mir-151a-3p em portadores de LLC e correlacionar com o grupo de idosos sem a doença. Métodos: O RNA total foi isolado a partir da camada de células mononucleares do sangue periférico. Para revelar os níveis de expressão dos mirnas foi utilizada a reação em cadeia da polimerase em tempo real (qpcr) nos dois grupos de idosos avaliados. Resultados: A expressão do mir-181a foi significativamente reduzida nos pacientes com LLC quando comparada aos indivíduos do grupo sem a doença. No entanto, não houve diferença significativa em relação à expressão dos mir-1248 e mir151a- 3p entre o grupo de idosos com LLC e o grupo de idosos sem LLC. Além disso, o estudo demonstrou que não houve diferença na expressão dos mirnas nos grupos em relação à idade e ao sexo. Palavras-chave: Leucemia linfocítica crônica, mirnas, Expressão diferencial. ABSTRACT: Introduction: Aging is a multifactorial process that includes expected physiological, molecular and genetic changes that lead to functional decline of tissues and organs, leading to increased susceptibility to disease and consequent increase of mortality rates. In this context, chronic non-communicable diseases (NCDs) are often found in the elderly, especially the onco-hematologic diseases, including chronic lymphocytic leukemia (CLL). Considered as essentially a disease of the elderly, CLL is a disease of clonal lymphoid infiltration of B cells found in the bone marrow (BM), peripheral blood and lymph nodes, and characterized as the most common type of leukemia in Western countries. The LLC expresses high levels of anti-apoptotic proteins, and decreased levels of pro-apoptotic proteins, which explains the exaggerated increase

50 39 of mature B lymphocytes. In addition to the levels of the proteins changes, the deregulation mirnas has been associated with LLC. mirnas are small non-protein RNA molecules encoding conserved in about 22 nucleotides that regulate gene expression post-transcriptional level. Changes in the expression of mirnas may be associated with aging and carcinogenic processes. Objectives: The study aimed to evaluate the expression of mirnas: mir-1248, mir- 181a and mir-151a-3p in patients with CLL related to the group of elders without the disease. Methods: Total RNA was isolated from the mononuclear cell layer from peripheral blood. To reveal the expression of mirnas levels we used the polymerase chain reaction in real time (qpcr) in both groups of patients included. Results: The expression of mir-181a was significantly reduced in patients with CLL when compared to individuals without the disease group. However, there was no significant difference in relation to the expression of mir-1248 and mir151a-3p among the group of older people with CLL and the group of elderly without LLC. In addition, the study showed no difference in the expression of mirnas in the groups with respect to age and sex. Keywords: Chronic lymphocytic leukemia, mirnas, Differential expression. INTRODUÇÃO De acordo com o último censo do IBGE realizado em 2010, a população brasileira tem mais de 15 milhões de pessoas com idade acima de 60 anos e a previsão para os próximos 20 anos é que este número ultrapasse 30 milhões. Até o ano de 2025, o Brasil estará, em números absolutos, com a sexta população de idosos no mundo, segundo dados da Organização Mundial de Saúde (IBGE, 2010). Diante dessas mudanças demográficas na sociedade, a incidência de doenças crônicas não transmissíveis tem aumentado, dentre elas, as patologias oncohematológicas, sendo a LLC a leucemia mais frequentemente diagnosticada nos indivíduos com mais de 60 anos. Considerada como uma doença de idosos, a LLC raramente afeta indivíduos com idade inferior a 40 anos. Cerca de novos casos são diagnosticados por ano nos Estados Unidos e mais de na Europa. (JEMAL, 2013).

51 40 A LLC é uma patologia linfóide definida como a expansão clonal de pequenas células B que infiltram a MO, o sangue periférico e frequentemente os linfonodos (HALLEK et al., 2008). Trata-se de uma doença de incidência de 4,1/ habitantes nos Estados Unidos, sendo caracterizada como o tipo mais comum de leucemia em países ocidentais (MOLICA, 2006). Apesar de apresentar uma imunofenotipagem bem característica com presença de CD19 +, CD20 +, CD5 + e CD23 + nas células B maduras, a LLC é clinicamente uma patologia heterogênea (HALLEK et al., 2008). Diferentes padrões de manifestação e uma ampla gama de alterações genéticas como a mutação dos genes de imunoglobulina de cadeia pesada (IgV H ), aberrações cromossômicas, mutações genéticas recorrentes em oncogenes e em genes supressores de tumor refletem a heterogeneidade biológica e clínica da doença (SUTTON; ROSENQUIST, 2015). Apesar do significativo avanço no tratamento da LLC na última década, os cuidados atuais consistem na combinação quimioterápica de fludarabina com ciclofosfamida e rituximab (FCR) com uma resposta global em torno de 90%. Porém, pacientes portadores de aberrações no gene TP53 respondem fracamente ao FCR e representam aproximadamente 40% dos pacientes refratários (HALLEK et al., 2010). Mutações nos genes NOTCH1, BIRC3 e SF3B1 foram identificadas e revelam mau prognóstico e pobre resposta terapêutica (GAIDANO et al., 2012). Adicionalmente, a expressão de certos mirnas em células leucêmicas pode fornecer informações relevantes quanto aos prognóstico da doença (CALIN et al., 2005). Os mirnas são classes emergentes de genes reguladores endogenamente produzidos como pequenos RNAs não codificadores de proteínas. São altamente conservados em aproximadamente 22 nucleotídeos, sendo que a expressão do gene regula negativamente em nível pós-transcricional por meio de interações homólogas com a região 3 de UTR (região não traduzida) e, mais raramente com a região de codificação de RNA mensageiro alvo (AMBROS et al., 2003). Com expressão aberrante em patologias malignas e significativa relevância no início da doença ou na progressão, os mirnas são promissores candidatos a marcadores diagnósticos das patologias que estão envolvidos. Alguns pesquisadores sugerem a possibilidade de estabelecer terapia a base de mirnas

52 41 por inibição de mirnas com funções patogênicas ou por restauração de mirnas supressores de tumores (JOSHI et al., 2012). Além disso, vários mirnas estão envolvidos na regulação das vias de sinalização do envelhecimento e atuam na progressão do ciclo celular. Estudos demonstraram que alguns mirnas estão diferencialmente expressos no soro ou plasma dos indivíduos durante o envelhecimento (OLIVIERI et al. 2012; NOREN HOOTEN et al., 2013). Sendo assim, este estudo tem como objetivo avaliar os níveis de expressão dos mirnas, mir-1248, mir-181a e mir-151a-3p, em um grupo de idosos portadores de LLC nos vários estágios da doença e nas linhas de tratamento farmacológico comparando com o grupo de idosos sem a doença. MÉTODOS TIPO DE ESTUDO Foi realizado um estudo transversal em que 20 idosos incluídos na pesquisa foram pacientes previamente diagnosticados com LLC acompanhados ambulatorialmente pelo setor de Hematologia do Hospital de Base do Distrito Federal HBDF, de ambos os sexos e com idade igual ou superior a 60 anos. Um grupo de 20 idosos hígidos, sem o diagnóstico de LLC ou qualquer outra neoplasia e pareados pela mesma faixa etária e sexo dos pacientes, foi incluído no estudo. Os idosos que fizeram parte desse grupo foram acompanhados pelo Centro de Atendimento de Idosos de Santa Maria (Centro de Saúde nº2 de Santa Maria DF), no período de setembro de 2014 a abril de Os pacientes portadores de LLC foram selecionados no Ambulatório do setor de hematologia do Hospital de Base do Distrito Federal (HBDF). O diagnóstico da LLC foi realizado previamente pela equipe de hematologistas do HBDF. Foram excluídos os pacientes que não assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. O grupo de idosos sem a doença foi constituído por indivíduos da mesma faixa etária dos pacientes incluídos no estudo. O estudo foi aprovado pelos comitês de ética e pesquisa da FEPECS (nº /2014) e UCB (nº /2014) e todos os participantes assinaram o consentimento.

53 42 ISOLAMENTO DO RNA TOTAL As amostras de sangue periférico foram processadas até 6 horas após a coleta. O RNA total, incluindo os small RNAs, foi extraído a partir das células mononucleares do sangue periférico após adição de um reagente que promove a migração diferencial através da centrifugação (Ficoll Paque Plus) e a camada de mononucleares isolada. A extração foi realizada utilizando o kit mirvana TM mirna Isolation de acordo com as instruções do fabricante. A quantificação do RNA foi determinada por fluorometria, utilizando Qubit Fluorometer (Life Technologies) seguindo as orientações do fabricante. SÍNTESE DE DNA COMPLEMENTAR (cdna) E PCR EM TEMPO REAL (qpcr) As amostras de RNA total foram submetidas à transcrição reversa por reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) para a síntese de cdna utilizando o Kit comercial TaqMan microrna reverse transcription (Applied Biosystems) juntamente com um conjunto de oligonucleotídeos iniciadores específicos para micrornas humanos. A transcrição reversa (RT) para obtenção do cdna, foi realizada utilizando sonda TaqMan (Life Technologies) e os iniciadores específicos para cada mirna (Tabela 1) em reação com volume final de 15µL, de acordo com instruções do fabricante. Em termociclador, as reações foram submetidas a um ciclo térmico de 30 minutos a 16ºC, 30 minutos a 42ºC, 5 minutos a 85ºC e finalização da reação a 4ºC. microrna Localização Sequência mir q27.3 ACCUUCUUGUAUAAGCACUGUGCUAAA mir-181a 1q32.1 AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU mir-151a-3p 8q24.3 CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG Tabela 1 Descrição da sequência e localização dos mirnas, mir-1248, mir-181a e mir151a-3p. Fonte: Base de dados mirbase. Após essa etapa, a qpcr foi realizada em triplicata no StepOne Plus (Applied Biosystems) em uma reação de 10µL utilizando 3,0µL de água tratada com DEPC (Ambion ) e 7,0µL do produto da RT, Universal Master Mix II e TaqMan small RNA assays (Life Technologies), de acordo com instruções do fabricante. O ciclo térmico

54 43 foi de 10 minutos a 95ºC, seguidos de 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC e 60 segundos a 60ºC. Para a descrição das amostras, extração de RNA e protocolos da qpcr, foi utilizada a Diretriz de informações mínimas para publicação de experimentos de qpcr (BUSTIN et al.; 2009). ANÁLISE ESTATÍSTICA Para os dados descritivos da amostra foram analisadas médias, desvio padrão e frequência. A normalidade das variáveis por grupo foi avaliada pelo teste de Shapiro- Wilks. Para as análises inferenciais foram utilizados os testes Qui-quadrado, Mann- Whitney para amostras independentes e KrusKal-Wallis com nível de significância de 5%. Os dados foram analisados no software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS IBM) versão 22.0 para Windows, devidamente registrado. Para as análises dos gráficos foram utilizados os testes Anova One way, Teste T e para as curvas de sobrevida o Teste Kaplan Meyer através do software de estatísticas e representações gráficas GraphPad Prism. RESULTADOS CARACTERIZAÇÃO DOS PACIENTES Inicialmente, foram avaliados 25 idosos portadores de LLC e 25 idosos sem doença, porém 5 idosos foram excluídos do estudo em consequência da expressão elevada em todos os mirnas ou em mirnas isolados. Sendo assim, 20 idosos com LLC e 20 idosos sem a doença foram investigados no estudo. As características do grupo com LLC estão descritas na tabela 1. A média de idade foi de 70,00 ± 9,11 anos (60 a 97 anos). A média de idade do diagnóstico foi de 65,90 ± 8,50 anos (56 88 anos). Com uma média do tempo de seguimento de 58,40 ± 34,92 meses ( meses), ocorreram 4 óbitos de pacientes com LLC durante o período do estudo.

55 44 Tabela 2 Dados demográficos e características dos pacientes com LLC. N Porcentagem (%) Demográficos Idade 60 anos (média de idade: 70 anos) % Sexo Feminino 4 20% Masculino 16 80% Binet Rai A B C 0 I II III IV Características da doença 6 30% 9 45% 5 25% 3 15% 6 30% 6 30% 3 15% 2 10% A partir da avaliação clínica estratificação dos pacientes, o tratamento foi iniciado a partir da análise de cada paciente de acordo com o Performance status, utilizado na determinação da viabilidade de quimioterapia e ajustes de doses terapêuticas. Os dados referentes ao tratamento quimioterápico e a evolução da terapia foi realizada por meio da análise de prontuários físicos e eletrônicos do HBDF. As terapias mais utilizadas administradas no grupo de idosos com LLC foram Clorambucil (Clb), a combinação Fludarabina/Ciclofosfamida/Rituximab (FCR), Flufarabina/Ciclofosfamida (FC) e Rituximab (R). Diante dos esquemas terapêuticos utilizados nos idosos com LLC acompanhados e da evolução do tratamento, foi possível traçar a curva de sobrevida global desses indivíduos a partir das terapias mais usadas pelos mesmos (Gráfico 1). Nota-se que os pacientes que receberam clorambucil isoladamente ou associado ao rituximab obtiveram uma sobrevida global maior comparado aos pacientes que fizeram uso de FCR ou FC.

56 45 Sobrevida global (%) Clb / Clb +R FC / FCR Todos Meses desde o diagnóstico Gráfico 1 Curva de sobrevida dos pacientes em uso de Clb / Clb+R e FC / FCR. Legenda: FCR Fludarabina/ciclofosfamida/rituximab; FC Fludarabina/ciclofosfamida; Clb Clorambucil; R Rituximab. Apesar das restritas informações obtidas nos prontuários analisados, pode-se evidenciar que o tratamento de escolha no momento do diagnóstico, para idosos com idade superior a 70 anos, portadores de comorbidades e com performance status ruim, a administração do Clorambucil, ainda é considerada a melhor opção. Após avaliação terapêutica dos pacientes, os níveis de expressão dos mirnas foram analisados nos dois grupos estudados, descritos na tabela 3. Inicialmente, avaliou-se a normalidade de cada variável quantitativa dos mirnas analisados (mir- 1248, mir-181a e mir-151-3p) por grupo (com e sem LLC). Como os dados não apresentaram distribuição normal após retirada dos outliers optou-se por avaliar os grupos pelo teste não paramétrico de Mann-Whithney. Tabela 3 Comparação entre o nível de expressão dos grupos avaliados utilizando o Teste de Mann-Whitney. Grupo LLC Grupo LLC Grupo Controle Grupo Controle p micrornas Média Mediana Média Mediana mir ,0870 0,748 0,0825 0,568 0,51 mir-181a 0,1929 0,1637 0,414 0,294 0,03 mir-151a-3p 0,5109 0,3234 0,4061 0,2758 0,54 Analisando os níveis de expressão entre os grupos, é possível notar que o mir- 181a apresentou-se diferencialmente expresso no grupo de idosos com LLC

57 46 comparado ao grupo de idosos sem LLC (Gráfico 2). Negrini et al. (2014), demonstraram que o mir-181a está regulado negativamente na LLC, sugerindo que não há envolvimento desse mirna na patogênese da doença. Idosos sem LLC N=20 Idosos com LLC N=20 Gráfico 2 Expressão do mir-181a entre os grupos. Pode-se notar que o grupo de idosos com LLC apresentou expressão significativamente diminuída em comparação ao grupo de idosos sem a doença. Em relação aos mirnas, mir-1248 e mir-151a-3p não houve diferença significativa de expressão (Gráfico 3) entre os dois grupos analisados. A. B. Idosos sem LLC N=20 Idosos com LLC N=20 Idosos sem LLC N=20 Idosos com LLC N=20 Gráfico 3 Níveis de expressão dos mirnas. A. Expressão do mir-1248 no grupo de idosos com LLC e no grupo de idosos sem a doença. B. Expressão do mir-151a-3p no grupo de idosos com LLC e no grupo de idosos sem a doença. Nos dois casos não houve diferença significativa.

58 47 De acordo com o sexo, não houve diferença significativa de expressão dos mirnas entre o grupo de idosos com LLC e o grupo de idosos sem a doença (Gráfico 4). Gráfico 4 Níveis de expressão dos mirnas em relação ao sexo. É possível notar que não houve diferença entre os indivíduos dos dois grupos avaliados de acordo com o sexo. Em relação ao sistema de estadiamento de Binet, diferenças significativas foram evidenciadas na expressão do mir-1248 nos idosos com estágio B e C de Binet comparado à expressão do grupo de idosos sem LLC. Da mesma forma, foi possível notar uma diferença significativa na expressão do mir-151a-3p nos idosos com LLC no estágio B comparado ao grupo de idosos sem a doença. No entanto, não houve diferença significativa nos níveis de expressão do mir-181a no grupo de idosos com LLC nos estágios A, B e C de Binet (Gráfico 5). De modo geral, a partir dessa análise, pode-se inferir que os mirnas, mir-1248 e mir-151a-3p, podem estar regulados positivamente de acordo com a gravidade da doença.

59 48 A. B. C. Gráfico 5 Níveis de expressão dos mirnas em relação ao sistema de estadiamento de Binet. A. Expressão do mir B. Expressão do mir-151a-3p. C. Expressão do mir- 181a. DISCUSSÃO De acordo com Noren-Hooten et al. (2013) os níveis de expressão dos mirnas mir-1248, mir-181a e mir-151a-3p, encontram-se significativamente reduzidos com o envelhecimento. Como esses mirnas parecem estar relacionados à vias de sinalização celular, sugere-se que a diminuição dos seus níveis de expressão pode resultar no desenvolvimento de fenótipos associados à idade e principalmente, à doenças do envelhecimento. Além disso, é possível que esses mirnas atuem como mediadores centrais de vias inflamatórias incluindo a via NF-κB e TNF-α. Dado que a redução do grau de