A imuno-expressão das citoqueratinas como marcadores diagnósticos e prognósticos nas neoplasias mamárias caninas

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1 A imuno-expressão das citoqueratinas como marcadores diagnósticos e prognósticos nas neoplasias mamárias caninas Cytokeratin immunoexpression as diagnostic and prognostic markers in canine mammary neoplasias Debora Aparecida Pires de Campos Zuccari 1*, Marcilia Viana Pavam 2, José Antônio Cordeiro 3, Aureo Evangelista Santana 1 1 FCAV - UNESP, Campus de Jaboticabal, Rodovia Carlos Tonanni, s/nº - Jaboticabal (SP), Brasil 2 UNIRP - São José do Rio Preto (SP), Brasil 3 FAMERP - São José do Rio Preto (SP), Brasil Resumo: O estudo dos tumores mamários da cadela é um excelente modelo para a investigação clínico-patológica, diagnóstica e prognóstica das neoplasias mamárias da espécie humana. O objetivo deste estudo foi investigar a expressão imuno-histoquímica das citoqueratinas 5, 14 e 18 na caracterização da histogênese e do grau de malignidade de tumores mamários em cadelas em citologias por impressão, caracterizando um auxílio diagnóstico e um prognóstico mais precoce dos tumores mamários. Dessa forma foi testada a capacidade dos referidos anticorpos monoclonais em discriminar as camadas epiteliais luminal e basal, e caracterizar o prognóstico destes animais. Os resultados presentemente alcançados são de muito valor na rotina oncológica, além de determinantes para um diagnóstico precoce, pré-cirúrgico, das neoplasias mamárias em cadelas. Das citoqueratinas estudadas, a citoqueratina 18 apresentou resultados estatísticos significativos como marcador diagnóstico, uma vez que a sua expressão está relacionada com o diagnóstico de carcinoma. Outrossim, pode ser considerado marcador de mau prognóstico se considerarmos os carcinomas, os tumores de caráter mais maligno. A utilização deste anticorpo pode contribuir para um prognóstico tumoral mais criterioso, permitindo ir além da utilização de uma classificação tumoral complexa e pouco conclusiva como única resposta na busca de uma melhor e maior sobrevida ao paciente portador de câncer mamário. Abstract: The investigation of the mammary tumors in the bitch has showed to be an excellent model for the diagnostic, clinic pathologic, and prognostic search of mammary neoplasias in human beings. The goal of this research was the investigation of immunocytochemical capability of monoclonal antibodies (citokeratins 14 and 18) to characterize the histogenesis and the malignant degree of mammary tumors in the bitch. We also, tested the capability of these monoclonal antibodies to discriminate between luminal and basal epithelial tissue, and to determine malignant through type I citokeratin expression. These results have a great value for oncology practice and, besides, are determinant for an early presurgical diagnosis of canine mammary neoplasias. The use of those antibodies as a panel of markers may contribute for a more accurate tumoral prognosis, allowing us to go farther than the use of a non definitive and complex tumoral classification as the sole answer in the search of a better and longer life for the patient suffering mammary neoplasia. * Correspondência: debora.zuccari@terra.com.br. Endereço actual: UNIRP - Centro Universitário de Rio Preto São José do Rio Preto (SP), Brasil Introdução As neoplasias mamárias são os tumores mais comuns na cadela, sendo responsáveis por aproximadamente 52% de todas as neoplasias nesta espécie (MacEwen, 1990; Sørenmo, 1998). Também, a fêmea canina, é a que apresenta maior incidência de neoplasias mamárias dentre todos os mamíferos e, quando comparada à mulher, apresenta três vezes mais tumores (Brodey et al., 1983). Os tumores mamários dos canídeos são modelos apropriados, e válidos, ao estudo da biologia do câncer (Schneider et al., 1970; Mottolese et al., 1994), assim como para testes de agentes terapêuticos, já que animais de companhia têm tumores que do ponto de vista histopatológico e de comportamento biológico são similares aos descritos na espécie humana (MacEwen, 1990; Peleteiro, 1994). O estudo da patogenia e histogênese destas neoplasias, envolvendo marcadores de receptores hormonais e de filamentos intermediários, é o que tem alcançado maior progresso nos últimos anos (Peleteiro, 1994). O valor diagnóstico do exame citológico de tumores, tanto de lesões internos como externos, tem sido bem estabelecido na prática médica humana (Griffiths et al., 1984). Na maioria das vezes, o material colhido pode ser conseguido de forma rápida, fácil e barata, com pouco ou nenhum risco para o paciente. Freqüentemente o material pode ser preparado, corado e interpretado com o cliente ainda no ambulatório. A interpretação dos achados citoscópicos é sempre de valor no estabelecimento do diagnóstico, identificação do processo (neoplasia ou hiperplasia reactiva), definição da terapia, ajuizamento do prognóstico e na determinação dos procedimentos diagnósticos subseqüentes (Cowell et al., 1999). Assim, o estudo citopatológico do tumor tem um grande valor como apoio diagnóstico, pois, feito rapi- 173

2 45% 16% 10% 6% 3% 10% 10% TCM TCB Carcinoma túbulo-alveolar Carcinoma alveolar Carcinoma lobular Carcinoma ductal Carcinoma esquirroso Figura 1 - Diagnóstico histopatológico de neoplasias mamárias em cadelas atendidas junto ao HV-FCAV/ Unesp, no período de janeiro a dezembro de Jaboticabal (SP), TCB Tumor Complexo Benigno; TCM Tumor Complexo Maligno. damente e no próprio consultório, possibilita ao clínico a adoção de condutas terapêuticas mais precoces, seguras e, na maioria das vezes, individualizadas (Wallgren et al., 1976; Wilson e Ehrmann, 1978). Para a lesão maligna, a aspiração do nódulo mamário e o diagnóstico citopatológico permitem ao clínico descobrir a doença precocemente e estabelecer um plano de terapia mais seguro e urgente, até mesmo a definição de um tratamento mais radical como uma mastectomia (Eisenberg et al., 1986). A detecção de filamentos intermediários, que compõem o citoesqueleto das células epiteliais, é uma das maneiras mais importantes de caracterizar a histogênese tumoral e de classificar tumores de origem desconhecida. Os filamentos intermediários constituem uma família de proteínas relacionadas. Esta família inclui as citoqueratinas, a vimentina, a desmina e o neurofilamento revelando uma distribuição tecidual restrita (Arai et al., 1994). As queratinas estão presentes na maior parte das células epiteliais sendo, assim, marcadores muito sensíveis à detecção de células malignas de origem epitelial. Na anátomo-fisiologia da glândula mamária da cadela, pode-se observar que os alvéolos da glândula mamária são compostos por epitélios basal e luminal. O epitélio basal forma uma camada descontínua entre a membrana basal e o epitélio luminal, o qual forra o lume dos ductos e alvéolos (Griffiths et al., 1984). Essa disposição topográfica é de extrema importância no estudo dos tumores mamários havendo uma relação direta da distribuição dos componentes celulares com o prognóstico da lesão. As células epiteliais luminais expressam as queratinas 7, 8, 18 e 19 e as células epiteliais basais expressam queratinas 5 e 14 (Warburton et al., 1989). Arai et al. (1994) observaram que a expressão de filamentos intermediários nas células epiteliais mamárias pode ser mantida ou modificada quando essas células sofrem transformação neoplásica. Tais células passariam a ter a capacidade de síntese de uma determinada citoqueratina de peso molecular 57 kilodalton, conhecida como citoqueratina tipo I (anticorpo monoclonal 24) e considerada como o marcador molecular da transformação maligna das células epiteliais mamárias. Assim, o presente trabalho foi planejado e executado com o objectivo de contribuir para o aprimoramento da técnica de imunomarcagem aplicada à citologia por impressão dos tumores mamários em cadelas e, ao mesmo tempo, definir a histogênese tumoral e a possível transformação maligna das células, auxiliando no estabelecimento de melhor conduta clínica, bem como no auxílio diagnóstico e do prognóstico precoce da neoplasia mamária em cadelas. A B Materiais e métodos C Figura 2 Fotomicrografia de preparações imunocitoquímicas demonstrando a marcação das citoqueratinas nas citologias dos carcinomas complexos malignos em cadelas. A. Citoqueratina 5 (60X); B. Células fusiformes marcadas por Citoqueratina 5 (60X); C. Citoqueratina 18 (40X); D. Citoqueratina 14 (40X). Jaboticabal (SP), D No presente protocolo experimental foram utilizadas trinta e uma cadelas, portadoras de neoplasias mamárias, atendidas no Hospital Veterinário Governador Laudo Natel, da FCAV/UNESP - Câmpus de Jaboticabal, no período de Janeiro a Dezembro de As preparações citoscópicas foram submetidas a acção de anticorpos dirigidos contra três diferentes marcadores para a avaliação e classificação das neoplasias mamárias: a citoqueratina 18 (The Binding Site, PH504) como marcador de células epiteliais luminais, a citoqueratina 14 (The Binding Site PH503) como marcador de células epiteliais basais (mioepiteliais) e a citoqueratina tipo I (The Binding Site CK50) como marcador de transformação maligna da célula epitelial. Imediatamente após a exérese cirúrgica do tumor, 174

3 A C Figura 3 Fotomicrografia de preparações imuno-histoquímicas demonstrando a marcação das citoqueratinas na histopatologia dos carcinomas complexos malignos em cadelas. A e B. Citoqueratina 14 (40X) Marcação da dupla camada epitelial; C. Citoqueratina 18 (40X) Marcação de células estromais e luminais D. Citoqueratina 5 (40X) Marcação das células mioepiteliais. Jaboticabal (SP), B D foram feitas as impressões para os procedimentos imunocitoquímicos e foram colhidos fragmentos do tumor para a realização da técnica histológica. Os fragmentos de tecido colhidos durante a exérese da massa tumoral foram fixados em formol a 10%, desidratados, diafanizados e embebidos em parafina e os blocos, submetidos a cortes de 5 µm de espessura, montados entre lâmina e lamela e corados pela Hematoxilina e Eosina (HE) para diagnóstico histopatológico. O procedimento para imunomarcação das preparações citoscópicas e também dos cortes de tecido iniciou-se com a Recuperação Antigênica. Foi preparada uma solução de ácido cítrico (ph = 6,0) e esta foi aquecida por cinco minutos em microondas (700 w). As preparações citoscópicas foram mergulhadas nesta solução por 25 minutos, em panela a vapor (80 o C). Após as lâminas retornarem a temperatura ambiente, foi realizado o Bloqueio da Peroxidase Endógena, para o que as preparações citoscópicas foram lavadas três vezes em água destilada e, em seguida, colocadas em solução de Metanol com Peróxido de Hidrogênio a 3%, durante 20 a 30 minutos. Em seguida, as preparações foram incubadas em câmara húmida por duas horas (temperatura ambiente) ou durante a noite à 4 o C, com o anticorpo primário, sendo que as diluições dos anticorpos foram feitas em soro fetal bovino (BSA), seguindo a especificação de cada anticorpo. Após a incubação, as preparações foram submetidas a três lavagens sucessivas de PBS de cinco minutos Tabela 1 - Diagnóstico, perfil imunocitoquímico e prognóstico de tumores mamários de cadelas (Diagnóstico: TCB Tumor Complexo Benigno; TCM Tumor Complexo Maligno. Marcadores: X. Inconclusivo, -. Negativo, +. FOCAL, ++. ATÉ 25%, %, MAIS DE 50%). Jaboticabal, Diagnóstico CK14 CK18 CK5 Prognóstico 1 TCB X + ++ BOM 2 CARCINOMA ALVEOLAR RUIM 3 TCM X +++ X BOM 4 TCB X X +++ RUIM 5 TCM - - X BOM 6 TCB BOM 7 TCM BOM 8 TCM RUIM 9 TCM RUIM 10 TCM BOM 11 TCM BOM 12 TCM BOM 13 CARCINOMA TUBULAR BOM 14 CARCINOMA ALVEOLAR RUIM 15 TCM BOM 16 TCM X RUIM 17 TCM BOM 18 TCM BOM 19 TCM X BOM 20 CARCINOMA ALVEOLAR ++++ X ++++ BOM 21 TCB BOM 22 CARCINOMA ESQUIRROSO BOM 23 TCM BOM 24 TCB + X + BOM 25 CARCINOMA TÚBULO- ALVEOLAR RUIM 26 CARCINOMA DUCTAL RUIM 27 CARCINOMA TÚBULO-ALVEOLAR X X X BOM 28 CARCINOMA DUCTAL BOM 29 CARCINOMA LOBULAR RUIM 30 CARCINOMA LOBULAR RUIM 31 CARCINOMA LOBULAR RUIM 175

4 26% 16% 58% Bom Prognóstico Mau Prognóstico Óbito por outra causa Figura 4 - Evolução clinica das cadelas portadoras de tumores mamários atendidas junto ao HV câmpus de Jaboticabal de janeiro a dezembro de Jaboticabal, nº de casos TCB TCM Carcinoma Mau Prognóstico Tipo Tumoral Bom Prognóstico Figura 5 - Diagnóstico em relação à evolução clinica de cadelas portadoras de tumores mamários atendidas no HV- câmpus de Jaboticabal no período de janeiro a dezembro de Jaboticabal, cada e em seguida foi utilizado o Kit LSAB Peroxidase (Dako, Dinamarca). Primeiramente, as preparações citoscópicas foram incubadas em câmara húmida por 15 minutos (temperatura ambiente), com a solução A (biotina anti-mouse e anti-goat) e após três lavagens sucessivas de PBS de cinco minutos cada, foram incubadas em câmara húmida por 15 minutos, também a temperatura ambiente, com a Solução B (Estreptavidina-Peroxidase) e logo em seguida foram submetidas a três lavagens sucessivas de PBS, de cinco minutos cada. Em seguida, as lâminas foram mergulhadas em solução de cromogênio DAB (diaminobenzidina - Dako, Dinamarca) por aproximadamente oito minutos ou até a visualização macroscópica da cor marrom-dourada, foram lavadas em água corrente durante cinco minutos e em seguida lavadas em água destilada. Para o contraste nuclear, foi utilizado hematoxilina de Mayer com hidróxido de amônia a 0,1%, durante um a dois minutos e em seguida as lâminas foram montadas com meio de Entellan (Merck). Em todos os testes imunocitoquímicos a bateria de lâminas possuía sempre um controlo positivo e negativo para o anticorpo testado. Como controlo negativo o anticorpo primário foi substituído por PBS. Para o controlo positivo utilizou-se um carcinoma mamário com expressão positiva conhecida para os marcadores utilizados. Os animais, independentemente dos procedimentos pós-cirúrgicos recomendados, foram acompanhados até dezoito meses após a cirurgia para avaliação da ocorrência de recidiva e/ou metástase da neoplasia mamária. Para descrever a intensidade e a percentagem de células marcadas utilizou-se do sistema de cruzes (- Negativo; + focal (expressão em 10% das células); ++ até 25%; %; ++++ mais de 50%). Os resultados obtidos no presente estudo foram analisados dentro do contexto do diagnóstico tumoral e do prognóstico do paciente. O método de predição escolhido foi o da Regressão Logística Nominal, quando considerado só o diagnóstico, e aquele da Regressão Logística Binária, quando considerados o diagnóstico e o prognóstico. O prognóstico foi avaliado com base nas características macroscópicas do tumor (dimensões, localização, presença de áreas de ulceração e necrose), tempo de evolução, recidiva, presença de metástase (Classificação TNM) (Gilbertson et al., 1983) e ainda em relação à resposta pós-operatória e óbito. No caso dos animais que vieram a óbito, em decorrência de outras causas, foram considerados apenas os aspectos pré-operatórios do tumor e do paciente. Resultados Como observado na Figura 1, os tumores complexos malignos ocorreram com maior freqüência e totalizaram 45% dos casos. Os tumores complexos benignos representaram apenas 16% e foram a representação das neoplasias benignas neste grupo. Os carcinomas alveolares, túbulo-alveolares e lobulares foram diagnosticados em 10% dos casos, cada um. Os carcinomas ductais foram diagnosticados em dois casos (6%) e os carcinomas esquirrosos em apenas um (3%). As citoqueratinas demonstraram excelente expressão nas preparações imunocitoquímicas (Figura 2) e também nas imunohistoquímicas. Nas preparações de imunocitoquímica observou-se a marcação tanto dos grupos celulares como nas células fusiformes soltas no esfregaço. Em concordância com a literatura consultada, a marcação das citoqueratinas caracterizou-se como citoplasmática. Nos cortes de tecido (Figura 3), observou-se a marcação da citoqueratina 14 nas camadas epiteliais luminal e basal. Já a citoqueratina 18 marcou as células epiteliais luminais e também as células estromais dos tumores. Ainda nos cortes, houve grande expressão da citoqueratina 5 apenas nas células mioepiteliais. Conforme observado na Tabela 1, a marcação foi simbolizada com cruzes e os esfregaços inconclusivos aparecem como X. Cinco cadelas vieram a óbito em decorrência de outras causas como ICC descompensada, complicações anestésicas pós-cirúrgicas, atropelamento, causas estas sem qualquer ligação com a neoplasia mamária. Nestes casos o prognóstico foi avaliado em relação às características macroscópicas da lesão, presença de metástase 176

5 e/ou recidiva (Classificação TNM) para confrontação com o diagnóstico tumoral (Figura 4). As características macroscópicas das lesões de maior importância foram o tamanho tumoral e a presença de ulcerações, além do crescimento rápido destes tumores. O principal sítio de metástases foi, sem dúvida, pulmonar e as recidivas ocorreram em 30% dos casos. Quando confrontados o diagnóstico tumoral com o mau prognóstico observamos que nos tumores complexos benignos, apenas em um caso (20%) houve discordância do diagnóstico com relação à evolução do caso. No caso dos tumores complexos malignos, dentre 14 cadelas apenas 3 (21,5%) confirmaram um mau prognóstico. Mas no caso dos carcinomas, de 12 casos, sete (58%) confirmaram o pior prognóstico (Figura 5). Quanto aos resultados estatísticos, inicialmente, foram avaliados, por meio de regressão logística nominal, os anticorpos em relação ao diagnóstico, considerando-se como evento referencial o carcinoma, o mais maligno dos tumores. Das citoqueratinas estudadas, obtivemos uma associação positiva significativa para a citoqueratina 18 (valor p=0,027) quando comparado o carcinoma com os tumores complexos malignos. Isso significa que a citoqueratina 18 pode ser utilizada como um marcador para carcinomas em cadelas. Essa citoqueratina não tem valor preditivo significante quando da confrontação do carcinoma com um diagnóstico benigno. A citoqueratina 14 não demonstrou relação significativa com o diagnóstico tumoral, tal como a citoqueratina 5 que, por apresentar forte correlação com as outras duas, mesmo quando avaliada sozinha, não é um bom marcador nem a nível diagnóstico, nem tampouco prognóstico. Sendo assim, este marcador não pode ser considerado um marcador de expressão nas neoplasias malignas mamárias. O diagnóstico não foi significativo para a formação de prognóstico. Discussão A citologia por impressão é sem dúvida uma técnica fácil, barata, simples e não necessita de instrumental sofisticado para sua confecção (Cowell, 1999). Sob as presentes condições, nas preparações citológicas por impressão de lesões neoplásicas, retiradas durante exérese da massa tumoral ou por ocasião do exame post mortem do paciente, o sangue e os fluídos tissulares foram primeiramente removidos da superfície da lesão da qual a impressão foi feita, enxugando-a com material absorvente. De acordo com a literatura consultada (Cowell, 1999), o excesso de sangue e de fluídos pode inibir a aderência das células do tecido à lâmina. No presente trabalho, as preparações da citologia por impressão se mostraram ricas, mesmo na presença de células sangüíneas que em nada atrapalharam a qualidade das preparações. A citologia complementada com a técnica de imunocitoquímica demonstrou ser eficiente para o estudo dos marcadores diagnósticos e prognósticos. Considerando o resultado inconclusivo uma possibilidade no procedimento citológico, uma vez que impressões repetidas podem resultar em uma ou outra impressão negativa, isto leva a técnica a ser considerada uma técnica de baixa sensibilidade. Neste trabalho, para cada animal foram confeccionadas 10 lâminas e a impressão repetida do mesmo fragmento tumoral na lâmina resultou, algumas vezes, em esfregaços negativos. Tal fato invalidou estatisticamente a análise dos componentes principais e justifica a ocorrência de resultados inconclusivos em um ou mais marcadores estudados, por terem sido processados seqüencialmente. A padronização da técnica de imunocitoquímica para tumores mamários caninos foi necessária já que os anticorpos comerciais foram desenvolvidos contra antígenos humanos limitando seu uso em patologia veterinária. Foram testados os reagentes de três laboratórios e em apenas um deles (The Binding Site) obteve-se expressão positiva para os anticorpos estudados. O estudo da expressão das citoqueratinas no tecido demonstrou que houve forte correlação entre as citoqueratinas estudadas. Isso significa que a expressão foi muito semelhante para as três citoqueratinas em cada caso estudado. O fato de o estudo ter sido feito em preparações citoscópicas, em que as células epiteliais perdem seu arranjo, apresentando-se em grupos ou mesmo soltas no esfregaço, dificultou a determinação da histogênese epitelial, o que não ocorreu nos cortes de tecido, quando as citoqueratinas demonstraram sua marcação específica. Outrossim, a citoqueratina 18 que deveria marcar epitélio luminal demonstrou essa intensa marcação definindo o diagnóstico de carcinoma. Como esperado, quando há forte densidade de marcação com a citoqueratina 18 o provável diagnóstico é aquele de um carcinoma. Já a citoqueratina 5 que deveria marcar a transformação maligna do tumor demonstrou, nos cortes de tecido, expressão positiva apenas nas células mioepiteliais ou epiteliais luminais. O anticorpo contra a citoqueratina tipo I foi descrito e desenvolvido por Arai et al. (1994) e a forma comercial encontrada é muito similar em peso molecular ao marcador de células mioepiteliais, justificando sua marcação neste tipo celular. Os resultados deste trabalho demonstram ainda que a utilização como um painel de marcadores, desses anticorpos que mostraram resultados estatisticamente significativos, pode contribuir para um prognóstico tumoral mais criterioso, deixando-se de lado a classificação tumoral complexa e inconclusiva, como única resposta na busca de uma melhor e maior sobrevida ao paciente com câncer. Além disso, o pequeno número de pesquisas em medicina veterinária, buscando novos marcadores prognósticos e preditivos para a neoplasia mamária mostra um imenso campo de pesquisa a ser desenvolvido. Os resultados obtidos neste trabalho, nas condições 177

6 metodológicas empregadas, permitem-nos concluir que a imunocitoquímica demonstrou sua importância como auxílio diagnóstico e prognóstico precoce dos tumores mamários em cadelas. Das citoqueratinas estudadas a citoqueratina 18 demonstrou ser um marcador diagnóstico para carcinomas mamários em cadelas e conseqüentemente um marcador para um prognóstico ruim. Agradecimentos Este trabalho foi financiado pela Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (Processo nº 98/ ). Bibliografia Arai, K., Kaneko, S., Naoi, M., Suzuki, K., Maruo, K., Uehara, K. (1994). Expression of stratified squamous epitheliatype cytoqueratin by canine mammary epithelial cells during tumorigenesis: type I (acidic) 57 kilodalton cytokeratin could be a molecular marker for malignant transformation of mammary epithelial cells. Journal of Veterinary Medicine Science, 56, Brodey, R.S., Goldschmidt, M.H., Roszel, J.R. (1983). Canine mammary gland neoplasms. Journal American Animal Hospital Association, 19, Cowell, R.L., Tyler, R.D., Meiokoth, J.H. (1999). Diagnostic Cytology and Hematology of the Dog and Cat. 2ª edição, Editor: Mosby (St. Louis), Eisenberg, A.J., Hajdu, S.I., Wilhelmus, J. Melamed, M.R., Kinne D. (1986) Preoperative Aspiration Cytology of Breast Tumors. Acta Cytologica, 30, Gilbertson, S.R., Kurzman, I.D., Zachrau, R.E., Hurvitz, A.I., Black, M.M. (1983). Canine Mammary Epithelial Neoplasms: Biologic implications of morphologic characteristics assessed in 232 dogs. Veterinary Pathology, 20, Griffiths, B.V., Lumsden, J.H., Valli, V.E.O. (1984). Fine Needle Aspiration Cytology and Histologic Correlation in Canine Tumors. Veterinary Clinical Pathology, 13, MacEwen, E.G. (1990). Spontaneous tumors in dogs and cats: Models for the study of cancer biology and treatment. Cancer and Metastases Review, 9, Mottollese, M., Morelli, L, Agrimi, U., Benevolo, M., Sciarretta, F., Antonucci, G., Natali, G.N. (1994). Spontaneous Canine Mammary Tumors A model for monoclonal antibody diagnosis and treatment of human breast cancer. Laboratory Investigation, 71, 182. Peleteiro, M.C. (1994). Tumores mamários na cadela e na gata. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias, 89, Schneider, R. (1970). Comparison of age, sex and incidence rates in human and canine breast cancer. Cancer, 26, Sørenmo, K. (1998). An update on Canine Mammary Gland Tumors. In: ACVIM Forum, San Diego, Proccedings 16 th, Wallgren, A., Silfverswärd, C., Zajicek, J. (1976). Evaluation of Needle Aspirates And Tissue Sections As Prognostic Factors In Mammary Carcinoma. Acta Cytologica, 20, Warburton, M. J., Hugues, C. M., Ferns, S. A., Rudland, P.S. (1989). Localization of vimentin in myoepithelial cells of the rat mammary gland. Histochemical Journal, 21, Wilson, S.L., Ehrmann, R.L. (1978). The Cytologic Diagnosis Of Breast Aspirations. Acta Cytologica, 22,