Universidade de Lisboa Faculdade de Medicina de Lisboa

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1 Universidade de Lisboa Faculdade de Medicina de Lisboa EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA INFECÇÃO POR VIH/SIDA, EM ANGOLA Sofia Vanda Lôa Clemente Mestrado em Doenças Infecciosas Emergentes (5ª edição) 2008

2 A impressão desta dissertação foi aprovada pela Comissão Coordenadora do Conselho Científico da Faculdade de Medicina de Lisboa em reunião de dezoito de Janeiro de 2011.

3 Universidade de Lisboa Faculdade de Medicina de Lisboa EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA INFECÇÃO POR VIH/SIDA, EM ANGOLA Sofia Vanda Lôa Clemente Mestrado em Doenças Infecciosas Emergentes (5ª edição) Orientador: Prof. Doutor Francisco Antunes Co-Orientadores: Profª Doutora Emília Valadas Prof. Doutor Nuno Taveira 2008

4 Todas as afirmações efectuadas no presente documento são da exclusiva responsabilidade da sua autora, não cabendo qualquer responsabilidade à Faculdade de Medicina de Lisboa pelos conteúdos nele apresentados.

5 Dedicatória Dedico este trabalho aos meus filhos (Clevânio e Geovani) e ao meu marido (João da Silva Clemente). i

6 Agradecimentos O meu reconhecimento estende-se a todas as pessoas que directamente ou indirectamente contribuíram decisivamente para a concretização deste trabalho. É impossível mencionar todas elas porém, não posso deixar de referenciar, os que mais de perto colaboram: Ao meu orientador, Professor Doutor Francisco Antunes, expresso a minha profunda gratidão por proporcionar a minha presença neste Mestrado, por ter criado as condições para a minha integração no Serviço de Infecciologia, pelo apoio científico, rigor, disponibilidade no esclarecimento das dúvidas e generosidade, que muito me tem ensinado, os quais foram imprescindíveis na execução deste trabalho. À Professor Doutora Emília Valadas, como presença permanente neste curso de Mestrado, agradeço-lhe o esforço, sacrifício e dedicação, empregue ao longo do curso, por garantir a maior rentabilização possível na actualização dos nossos conhecimentos e no crescimento profissional e, em particular, por aceitar co-orientar este trabalho e pelas valiosas e oportunas considerações científicas na análise do mesmo. Ao Professor Doutor Nuno Taveira, por aceitar fazer parte deste trabalho, como coorientador, expresso a minha imensa gratidão, pela sua imprescindível contribuição, orientação científica e apreços pelos constantes ensinamentos, que tanto contribuíram para o meu aperfeiçoamento profissional e pessoal. Agradeço à Fundação Glaxo Smithkline das Ciências da Saúde por ter financiado parcialmente este trabalho. À Direcção do Hospital da Divina Providência (HDP), o meu muito obrigado, pelo apoio, incentivo, colaboração e compreensão por este tempo de ausência. ii

7 À equipa técnica do laboratório do HDP, pelo apoio incondicional na obtenção das amostras utilizadas e aos colegas do Serviço de Infecciologia, Internamentos, Serviços Administrativos e Secretaria os meus agradecimentos pelo vosso auxílio. Ao Laboratório Nacional de Saúde Pública (INSP) de Luanda, Angola, à Dr.ª Filomena da Silva e à Dr.ª Joana António com toda sua equipa de técnicos, agradeço-lhes por terem permitido a conservação das amostras. Agradeço, também, à Direcção da Unidade de Retrovírus e Infecções Associadas do Centro de Patogénese Molecular, da Faculdade de Farmácia de Lisboa, por ter permitido a realização deste trabalho. À Mestre Inês Bártolo, que contribuiu com a sua amizade e gentileza para o excelente ambiente de trabalho e que, afincadamente, se empenhou arduamente ao longo de todo o trabalho laboratorial, não tenho palavras para expressar tamanha dedicação e o que aprendi ao seu lado. Expresso também, a minha gratidão à Mestre Cheila Rocha, ao Pedro Borrego e à Andreia Martins que, na ausência da Inês Bártolo, me apoiaram. Ao Dr. Ricardo Camacho e à sua equipa do Laboratório de Biologia Molecular do Hospital de Egas Moniz, por permitir a quantificação da carga vírica de 86 amostras e a sua análise, agradeço-lhes todo o empenho posto neste trabalho, assim como à Professora Doutora Patrícia Cavaco Silva. Aos meus pais (João Lôa e Eugênia António), expresso a minha profunda gratidão POR TUDO, sem os quais nada na minha vida seria possível. Aos meus irmãos, sobrinhos, outros familiares e amigos, pelo incentivo, apoio, pela paciência e por saberem suportar a minha ausência, ao longo desta caminhada. Muito obrigada. iii

8 Agradeço à TODOS com um velho ditado Que Deus vos Dê em dobro, tudo aquilo que me deste! O meu muito obrigada. iv

9 Resumo Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), estima-se que, no Mundo, em 2008, viviam 33,4 milhões de pessoas infectadas por VIH. A África sub - sariana, continua a ser a região mais afectada pela epidemia, tendo 22,8 milhões de infectados. O primeiro caso de sida, em Angola, foi diagnosticado em 1985 e até ao primeiro semestre de 2009 foram notificados casos de infecção por VIH (64). A prevalência ronda os 5,0 %, em 16 milhões de habitantes, mas nas zonas fronteiriças com a República do Congo (Kinshasa), Zâmbia e Namíbia pode atingir os 10,0 %. O objectivo do presente trabalho é: a) determinar o perfil epidemiológico, demográfico, clínico e imunológico dos indivíduos em estudo, b) estudar a diversidade genética de VIH em Angola, assim como investigar a frequência e distribuições de polimorfismos na protease (PR) e na transcriptase reversa (TR) associados à resistência aos anti-retrovíricos, nos indivíduos não tratados. As 219 amostras foram recolhidas dos 302 indivíduos infectados por VIH-1, no Hospital da Divina Providência, em Luanda, de Setembro de 2008 a Janeiro de Para o presente estudo foram recrutados 57 indivíduos, cujos critérios de inclusão seguiram algumas das recomendações da OMS, para este tipo de trabalho. Cento e cinco sequências foram realizadas, 57 da proteína PR e 48 da TR no gene pol, usando um método in-house. O perfil epidemiológico, clínico, demográfico e imunológico da população estudada é caracterizada, maioritariamente por pertencerem ao sexo feminino (67,5%), com média de idades de 31 anos, a via de transmissão predominante foi a heterossexual v

10 (86,8%) e a maior parte estava em estado avançado de doença. A análise filogenética das sequências revelou uma elevada heterogeneidade genética de VIH-1 em Angola. Foram detectados vírus de todos os subtipos pertencentes ao grupo M e 5,3% a subtipos não classificáveis. A análise filogenética das sequências revelou que, somente, 16 (37%) indivíduos albergavam vírus de um único subtipo (subtipo puro). Os restantes indivíduos (n=30, 65%) estavam, na sua maioria, infectados por vírus recombinantes, incluindo formas recombinantes circulantes (CRFs) e outros recombinantes. Um doente (d94) estava infectado por um isolado não tipável (U). O subtipo mais prevalente na PR foi o G (n=12; 21%) seguido do D (n=7; 13%) e C (n=6; 11%). Na TR os subtipos mais prevalentes foram o A, C e F1 todos presentes em cinco indivíduos (10%). Sequências não tipáveis foram detectadas em seis (11%) indivíduos na PR e quatro (8%) indivíduos na TR. Vinte e quatro indivíduos estavam infectados por vírus contendo PRs e TRs pertencentes a diferentes subtipos, a vírus não tipáveis ou a CRFs. O recombinante deste género mais frequente foi o G/U que estava presente em três indivíduos (13%). A CRF mais prevalente foi a CRF02_AG tanto na PR (n=5; 9%) como na TR (n=5; 10%), seguida da CRF01_AE (PR - n=4; 7%; TR - n=4; 8%). Detectaram-se oito (14%) indivíduos, potencialmente, infectados com vírus recombinantes constituídos por CRF01_AE na PR ou na TR. De salientar que 13 (54%) destes indivíduos albergavam recombinantes de 2ª geração, ou seja, vírus que resultam da recombinação entre um CRF e um vírus de um subtipo puro ou um vírus não tipável (U). A análise das sequências na base de dados de Stanford para as mutações de vi

11 resistência, inequivocamente, associadas com a transmissão de vírus resistentes aos anti-retrovíricos revelou que, não obstante a presença de numerosos polimorfismos invulgares na PR e TR, nenhum dos indivíduos estava infectado por este tipo de vírus. Palavras-chave: Angola, epidemiologia molecular, genótipos VIH-1, infecção VIH/sida, mutações de resistência. vii

12 ABSTRACT According to the World Health Organization in 2008 an estimated 33,4 million people were infected with HIV. Sub-Saharan Africa continues to be the region with the most infected by the epidemic with 22, 8 million infected. The first case of aids in Angola was diagnosed in 1985 and until the first semester of 2009 forty eight thousand six hundred and fifty cases of HIV/aids (64) were notified. The spread is around 5, 0% in 16 million inhabitants although in the neighboring borders of the Congo Republic (Kinshasa), Zambia and Namibia it can hit 10, 0 %. The objective of this project is to determine the epidemiological, demographical, clinical and immunological profile of the individuals under case study. Explore the genetic diversity of HIV in Angola as well as investigate the frequency and distribution of polymorphisms in protease PR and in reverse transcriptase TR associated to the resistance to ARV, in non treated individuals. The 219 samples were collected from HIV 1 infected individuals 302 from the Hospital of Divine Providence in Luanda in September of 2008 to January of 2009, for the present study 57 individuals were included following the WHO recommendations for this type of study. The samples of the 57 individuals were genotopically analysed to determine their subtype and the profile potential to the resistance to ARV using the in house method one hundred and five sequences were done (57 protein PR and 48 TR) in the Pol gene. The profile epidemiologist, clinical, demographic and immunologic of the studied population were characterized were mostly by the feminine sex (67.5%), with average of age of 31 years, the way of predominant transmission viii

13 was heterosexual (86.8%) and most was in advanced state of imunossupressão. The phylogenetic sequential analysis revealed highly heterogeneity of HIV-1 Angola. That study revealed all subtypes belonging to group M. The phylogenetic sequential analyses revealed that only 16 (37 %) patients had the virus of only one subtype pure subtype the remaining patient (30, 65 %) were mostly infected by recombinant virus including circular recombinant forms CRFs. One patients (d94) were infected by classification was not possible sequences (U). The most prevalent subtype in PR was the G (12; 21%) followed by D (7; 13%) and C (6; 11%).The prevalent subtypes were A, C e F1. All present in 5 patients (10%). Unclassified sequences were detected in 6 (11%) patients in PR and 4 (8%) patients in TR. Twenty four patients were infected with the virus containing PRs and TRs belonging to different subtypes, unclassified virus or CRFs. The CRF most prevalent was CRF02_ AG both in PR (5 patients, 9%) and TR (5; 10%) followed by CRF01_AE [PR: 4; 7%; TR: 4; 8%]. In this study we detected 8 (14%), potentially infected patients with recombinant virus made of CRF01_AE in PR or TR. It is to point out that 13 (54%) these patients lodged/possessed/had recombinant virus of second generation,that is, that result of recombination between one CRF and a virus a pure subtype or one unclassified virus. The sequential analyses of the Stanford data base for the resistant mutations unequivocally associates with the transmission of resistant viruses to the ARV revealed that notwithstanding the presence of numerous unusual polymorphisms in PR and TR, none of the patients were infected with this type of virus. ix

14 Keywords: Angola, molecular epidemiology, genotypes HIV-1, HIV-1AIDS infection, resistance mutations. x

15 ABREVIATURAS 3TC ABC ADN lamivudina abacavir ácido desoxirribonucleico AgHBs antigénio de superfície da hepatite B APV ARN ARNm ARVs ATP ATV ATV/r AZT BPN CA CRFs D4T DDC DDI DLV DRV EFV ENF ETV FDA amprenavir ácido ribonucleico ácido ribonucleico mensageiro anti- retrovíricos adenosina trifosfato atazanavir atazanavir/ritinavir zidovudina broncopneumonia proteína da cápside formas recombinantes em circulação estavudina zalcitabina didanosina delavirdina darunavir efavirenz enfuvirtida etravirina Food and Drug Adminstration xi

16 FTC emtricitabina gp HAART Ht HTA IDV IFs IINs IN INLCS IP/r IPs Kb LAPG LPV LPV/r LTR M MA MNCP N NC NFV NITR N (t)itr glicoproteína highly active antiretroviral therapy heterossexual hipertensão arterial indinavir Inibidores da fusão inibidores da integrase integrase Instituto Nacional de Luta Contra Sida inibidores da protease/ritonavir inibidores da protease kilobases linfoadenopatia generalizada lopinavir lopinavir/ritonavir long terminal repeats (terminações longas repetidas) grupo major proteína da matriz má nutrição calórico proteico grupo N (não-m e não-o) proteína da nucleocápside nelfinavir nucleosídeos inibidores da transcriptase reversa nucleosídeos ou nucleotídeos inibidores da transcriptase reversa xii

17 NNIRTs NVP O OMA OMS ONU ORF pb PCR PNI PR PT RAL RDC não-nucleosídeos inibidores da transcriptase reversa nevirapina grupo outlier otite média aguda Organização Mundial de Saúde Organização das Nações Unidas open reading frame pares de bases Polymerase Chain Reaction pneumonia inflamatória protease transmissão vertical raltegravir República Democrática do Congo RT-PCR PCR iniciado com retrotranscrição RTV sida SU T20 T TAMs TARV TB TDF TM Ritonavir síndroma de imunodeficiência adquirida proteína de superfície enfuvirtida transfusões thymidine analogue mutations terapêutica anti retrovírica tuberculose tenofovir proteína transmembranar xiii

18 TR U UK-427 V transcriptase reversa não classificável maraviroc vertical VIH-1 vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 VIH-2 vírus da imunodeficiência humana do tipo 2 VIS vírus da imunodeficiência símia xiv

19 ÍNDICE GERAL DEDICATÓRIA AGRADECIMENTOS RESUMO ABSTRACT ABREVIATURAS ÍNDICE GERAL ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE QUADROS i ii v viii xi xv xiv xxi 1. INTRODUÇÃO Síndrome da imunodeficiência adquirida (sida) Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (VIH-1) Organização estrutural Organização genómica Mecanismos de entrada de VIH-1 nas células humanas Interacção de VIH-1 com a superfície celular O ciclo replicativo de VIH Variabilidade genética de VHI Distribuição geográfica Terapêutica anti-retrovírica (TARV) Anti-retrovíricos Nucleosídeos inibidores da retrotranscriptase (NITRs) Não-nucleosídeos inibidores da transcriptase reversa (NNITRs) 14 xv

20 1.5.3 Inibidores da Protease (IPs) Inibidores de entrada (IEs) Inibidores da integrase (IINs) Quando começar a terapêutica anti-retrovírica (TARV) e com que 16 medicamentos 1.7 Resistência aos anti-retrovíricos Mecanismos de resistência aos anti-retrovíricos Resistência aos NIRTs Resistência aos NNIRTs Mecanismos de resistência aos (IPs) Epidemiologia da infecção por VIH/Sida em Angola OBJECTIVOS MATERIAL E MÉTODOS Caracterização dos Serviços da Consulta de Infecciologia do 29 Hospital da Divina Providência (HDP) 3.2 Doentes e métodos Amostras incluídas no estudo Quantificação da carga vírica plasmática Extracção de ARN para genotipagem de resistência Primers Reacção de polimerização enzimática em cadeia -PCR Sequenciação 35 xvi

21 3.9 Análise filogenética de região da protease Análise das mutações de resistência aos anti retrovíricos Análise estatística RESULTADOS Características clínicas e demográficas dos doentes angolanos Naturalidade e distribuição por sexo Distribuição etária Distribuição dos doentes, de acordo a via de transmissão Estádio da doença Grupos nosológicos Estádio da doença, carga vírica e diversidade genética dos isolados 43 víricos em circulação em Angola 5. DISCUSSÃO 52 ANEXOS 57 Quadros de mutações de resistências aos anti-retrovíricos 57 2 Mutações de resistências aos NIRTs 57 3 Mutações de resistências aos NNIRTs 59 4 Mutações de resistências aos IPs 61 5 Mutações de resistência aos anti-retrovíricos transmitidos 63 2 Aprovação do projecto pelo Hospital da Divina Providencia e da 64 Comissão de Ética de Angola 3 Cronograma de actividades 66 xvii

22 4 Informação para o doente e consentimento informado 67 5 Inquérito epidemiológico e clínico 70 6 Caracterização epidemiológica e clínica dos doentes angolanos 76 incluídos neste estudo (quadro -6) REFERÉNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 84 xviii

23 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Estrutura da partícula vírica 3 Figura 2 Organização genómica de VIH-1 3 Figura 3 Entrada de VIH nas células 6 Figura 4 Ciclo de vida da replicação de VIH-1 7 Figura 5. Distribuição geográfica das formas genéticas de VIH-1 no 10 Mundo, em geral (A), e em África, em particular (B) Figura 6 Mapa de Angola 21 Figura 7 Proporção de testes positivos de VIH por províncias, 1º 23 semestre 2009 Figura 8 Número acumulado de doentes (crianças e adultos) 23 acompanhados e em TARV por ano, 2004 até o 1º semestre 2009 Figura 9 Distribuição, por sexo, dos indivíduos incluídos no estudo 38 Figura 10 Distribuição dos indivíduos estudados, por grupo etário e 39 sexo. Figura 11 Distribuição dos indivíduos incluídos no estudo, de acordo 40 a provável via de transmissão xix

24 Figura 12 Correlação entre a carga vírica e o número de linfócitos 45 TCD4 + em 73 indivíduos. Figura 13- Análise filogenética de sequências da PR (A) e da TR (B) 47 dos isolados de VIH-1 em circulação em Luanda em xx

25 ÌNDICE DE QUADROS 1.Constituição e origem das 10 principais CRFs de VIH Mutações de resistências aos NIRTs Mutações de resistências aos NNIRTs Mutações de resistências aos IPs Mutações de resistência aos anti-retrovíricos transmitidos Caracterização epidemiológica, clínica dos doentes angolanos incluídos neste estudo Primers utilizados na amplificação por PCR nested e sequenciação do gene pol, PR e RT de VIH Misturas de reacção e ciclos de amplificação dos PCRs efectuados neste trabalho Patologias diagnosticadas nos indivíduos incluídos no estudo sida. A) Patologias associadas à Sida e B) Outras comorbilidades Características demográficas, imunológicas e víricas dos infectados por VIH-1 no HDP (Setembro de 2008 a Janeiro de 2009) Comparação das características demográficas, imunológicas e virológicas entre a amostra global e os doentes efectivamente genotipados Forma genética de isolados víricos analisados neste estudo nas regiões codificando para PR e da TR (gene pol) 50 xxi

26 Introdução 1 INTRODUÇÃO 1.1 Síndrome de imunodeficiência adquirida (sida) A síndrome de imunodeficiência adquirida (sida) representa, hoje, um dos principais problemas de Saúde Pública no Mundo inteiro (1-3). Os agentes responsáveis pela sida são os vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (VIH-1) e do tipo 2 (VIH-2), que se distinguem pelas suas propriedades antigénicas, moleculares e biológicas. A sida é uma doença letal, que provoca imunodeficiência, aumentando, assim, a susceptibilidade a outras infecções e a algumas neoplasias (4). Enquanto VIH-1 é responsável por uma pandemia, a nível mundial, a infecção porvih-2 tem características epidemiológicas diferentes, estando localizada, sobretudo, a países da África Ocidental e por um número reduzido de casos na Europa e noutros continentes. Esta última, tem melhor prognóstico e a progressão para a doença é mais lenta. A sida foi, pela primeira vez, reconhecida nos Estados Unidos da América, em 1981, mas, há referências a casos datados de 1978,em Nova Iorque e no Haiti (5). VIH-1 foi isolado, pela primeira vez, em 1983, de um doente com linfo-adenopatias e, em 1984, demonstrou-se, claramente, ser o agente etiológico da sida (6). De acordo com os dados da ONUSIDA de 2008, o número total de infectados é de 33,4 milhões, o que corresponde a mais de 2,7 milhões novos casos e a dois milhões de mortes. A África sub - sariana continua a ser a região mais afectada, estimando-se que dos dois milhões de mortes, 70% tenham ocorrido nesta região. Calcula-se que o número de infectados por VIH, em África, seja de 22,4 milhões, com 1,9 milhões de novos casos, em Do total das crianças infectadas (2,1 1

27 Introdução milhões), aproximadamente, 90% foram referenciadas na África sub - sariana. Nesta região, 61% do total de infectados por VIH são mulheres (7). Prevê-se, ainda, que nos países em vias de desenvolvimento, 45 milhões de pessoas se infectem até 2010 a não ser que se consigam montar estratégias bem sucedidas de prevenção e de tratamento (8-11). 1.2 Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (VIH-1) Organização estrutural VIH-1 pertence à família Retroviridae e ao género dos Lentivirus. Observado ao microscópio electrónico, apresenta-se como uma estrutura esférica com, aproximadamente, mm de diâmetro, com um invólucro lipídico-proteico, que possui duas glicoproteínas, sendo uma transmembranária (gp41) e a outra de superfície (gp120) (figura 1)(12). Sob a camada lipídica existe uma matriz proteica (p17), a nucleocápside viral, composta pela proteína p24, o material genético (genoma), formado por duas moléculas idênticas de ARN, as enzimas transcriptase reversa (TR), integrase (IN), protease (PR) e as proteínas da nucleocápside. As proteínas gp41 e gp120 são codificadas pelo gene env. A gp120 contém os locais de ligação aos receptores e correceptores celulares e a maioria dos domínios de neutralização, enquanto a gp41 tem um papel importante na fusão do vírus à membrana da célula hospedeira. 2

28 Introdução Figura 1 Estrutura de VIH(adaptado da referência13) Organização genómica O genoma de VIH-1 é constituído por duas moléculas de ácido ribonucleico (ARN), cada uma com cerca de 9,8 Kb e contém três genes estruturais gag, pol e env e seis genes acessórios, tat, rev, nef, vif, vpr e vpx (VIH-2) ou vpu(vih-1)(figura 2)(12). Nas extremidades 5 e 3 do ácido desoxirribonucleico (ADN) provírico localizam-se as sequências repetitivas terminais longas (long terminalltr), que controlam a transcrição do genoma vírico, regulando a produção de viriões. Figura 2 Organização genómica de VIH-1(adaptado da referência14). 3

29 Introdução Os genes gag, poleenv codificam para as poliproteínasgag-pol e env que são, posteriormente, processados por proteólise em proteínas individuais (figura 2). O gene gag codifica para a proteína da cápside (p24), para as proteínas básicas associadas ao genoma (p9 e p6) e para a proteína da matriz (p17). O gene pol codifica três proteínas, isto é, TR (p53), PR (p11) e IN (p34), que são clivadas a partir da proteína precursora gag-pol pela PR. O gene env codifica para um polipéptido, precursor das glicoproteínas do invólucro, a gp160,a qual dá lugar à glicoproteína externa gp120 e à glicoproteína transmembranária gp41, essenciais para os mecanismos de reconhecimento e entrada na célula hospedeira de partículas virais (4, 12). O gene tat codifica para uma proteína reguladora, com acção na activação da transcrição do ADN provírico de VIH. A proteína tat aumenta os níveis de expressão das proteínas víricas e liga-se a várias proteínas celulares, incluindo vários factores envolvidos na transcrição. No entanto, o seu mecanismo de acção permanece controverso, parecendo promover a fase de elongação da transcrição de VIH e estar envolvida na fosforilação do domínio carboxílico terminal do ARN polimerase II.O gene rev codifica para uma proteína de 19 Kb, responsável pela regulação do processamento do ARNm vírico. Actua pós-transcricionalmente, exportando e regulando o transporte dos transcritos de VIH, do núcleo para o citoplasma (12).O gene nef aumenta a replicação e a infecciosidade vírica (15). Em VIH-1, este gene tem um importante papel na evasão ao seu reconhecimento pelas células T. O gene vif aumenta a infecciosidade vírica e é importante para a transmissão célula a célula (sem formação de partículas víricas). Também, é fundamental para a replicação em linfócitos TCD4 + e monócitos/macrófagos, sendo tal essencial durante a infecção in 4

30 Introdução vivo(12). O gene vpu codifica para uma proteína transmembranar, presente, apenas, em VIH-1 e promove a libertação dos viriões, encontrando-se envolvida na degradação do receptor CD4, facilitando, assim, o transporte para a superfície celular da glicoproteína env. Nas extremidades do genoma vírico existem as LTR que desempenham um papel fundamental, não só no mecanismo de integração do vírus no ADN da célula humana, como, também, na regulação da expressão do provírus(12) Mecanismos de entrada de VIH-1 nas células humanas Interacção de VIH-1 com a superfície celular O processo de entrada de VIH inicia-se pela interacção de alta afinidade da glicoproteína gp120 do vírus com a superfície do receptor CD4, presente na membrana citoplasmática dos linfócitos TCD4 + e nos monócitos/macrófagos. Contudo, existem outras moléculas, na superfície da célula, essenciais para a ligação de VIH-1 à membrana celular e entrada nas células. Estas moléculas são receptores das quimiocinas, que actuam como co-receptores de VIH-1 e são designados de CCR5 e CXCR4 (12). Esta interacção entre a proteína externa do invólucro vírico e a molécula CD4 resulta não só na fixação da partícula vírica à célula, como possibilita a indução de alterações conformacionais na gp120 e na gp41, levando à exposição do péptido de fusão (região localizada na extremidade N- terminal da proteína TM), que vai mediar o processo de fusão do invólucro vírico com a membrana da célula, permitindo, assim, a entrada do vírus na célula (figura 3). 5

31 Introdução Figura 3 Entrada de VIH nas células (imagem cedida por NunoTaveira) O ciclo replicativo de VIH A fusão leva à injecção da cápside de VIH na célula e posterior libertação do seu material genético e das enzimas necessárias para a replicação. Ocorre, então, a transcrição reversa do ARN genómico vírico, isto é, a formação do ADN provírico a partir do ARN, pela acção da enzima TR de VIH. O ADN, em dupla cadeia, é transportado para o interior do núcleo celular, onde sofre clivagens específicas e é integrado no ADN da célula do hospedeiro pela acção da enzima IN (12). A activação da célula hospedeira resulta na transcrição de ADN em ARNm, que é traduzido em proteínas víricas imaturas (poliproteínas). O ARN genómico e as proteínas víricas imaturas agrupam-se na superfície celular formando um novo vírus que, finalmente, é libertado (figura 4). A acção da enzima PR é necessária nesta 6

32 Introdução fase para clivar as poliproteínas nas proteínas individuais maduras do gag e do pol. Só após esta acção da PR é que as partículas víricas ficam com capacidade infecciosa, isto é, ficam capazes de infectar de forma produtiva novas células. Figura 4 - Ciclo de vida da replicação de VIH -1 (adaptado de Variabilidade genética de VIH-1 VIH apresenta uma alta variabilidade genética, decorrente de diversos factores, que actuam em sinergismo e que permitem rápida evolução vírica. Entre estes factores incluem-se a alta taxa de erro da TR, na incorporação dos nucleotídeos, durante a transcrição reversa, elevadas taxas de replicação vírica no hospedeiro, elevada frequência de recombinação e enorme população de indivíduos infectados (16).Estes mecanismos impõem ao vírus uma característica de diversidade, que se 7

33 Introdução reflecte pela presença, no mesmo hospedeiro, de diversas variantes, a sua maioria constituídas por genomas relacionados, formando uma quasi especie. Estudos filogenéticos, em amostras de vírus de diferentes regiões geográficas, levaram à classificação de VIH-1 em três grandes grupos, isto é, M (major), O (outlier) e N. O grupo M é o responsável pela pandemia de VIH, sendo classificado em nove subtipos (A,B,C,D,F,G,H,J e K)(16, 17). Os subtipos A e F subdividem-se, ainda, em A1 a A3 e F1e F3. No grupo M foram descritas mais de quarenta CRFs, constituídas pelos diferentes subtipos (quadro 1) (18). Mais recentemente, foi identificado um quarto grupo de VIH-1, o grupo P (19). Ao contrário dos outros, este grupo contém vírus mais aparentados com VIS do gorila do que com VIS do chimpanzé. Quadro 1 Constituição e origem das 10 principaiscrfs de VIH-1 Nome Subtipos País de origem CRF01_ AE A, E Tailândia CRF02_ AG A, G Nigéria CRF03_ AB A, B Rússia CRF04_ cpx A, G, H, K Chipre, Grécia CRF05_ DF D, F RepúblicaDemocrática do Congo CRF06_ cpx A, G, J, K Burkina Faso CRF07_ BC B, C China CRF08_ BC B, C China CRF09_ cpx A, F, G Senegal CRF10_ CD C, D Tanzânia Distribuição geográfica Os subtipos de VIH-1predominantes, à escala global, são o C (responsável por mais de 50% das infecções), o A (sobretudo sub-subtipo A1), o B eo CRF02 _AG (figura 5A) (20, 21). A distribuição mundial dos subtipos é bastante diversificada, verificando-se, em cada país, a predominância de uma ou mais formas genéticas, o 8

34 Introdução que pode indiciar o papel que essas estirpes tiveram na introdução da infecção VIH num determinado país ou região (17, 21). Os resultados de múltiplos estudos epidemiológicos de base molecular, efectuados em África, indicam a presença de todos os grupos e subtipos de VIH-1 (figura 5B). A diversidade de grupos, subtipos e formas recombinantes é maior na África Central, o local de origem de VIH-1. Contudo, o subtipo C é, de longe, o mais prevalente em África, predominante nos dois países africanos com maior número de infectados por VIH-1, a África do Sul (22) e Moçambique (23). Nos países da África Central existem todos os subtipos e formas recombinantes, excepto, em geral, o subtipo B (17, 24-28). A elevada heterogeneidade das estirpes africanas de VIH-1 reflecte a maior duração da epidemia, em comparação com outras regiões do globo (24). 1.4 Terapêutica anti-retrovírica (TARV) Os objectivos da TARV são a supressão da replicação vírica e a restauração e/ou a preservação da função imunológica. A conjugação destes dois factores tem, como consequência, a melhoria do prognóstico da infecção VIH, a redução do número de infecções oportunistas, a melhoria da qualidade de vida do indivíduo infectado e a redução da morbilidade e da mortalidade relacionadas com a infecção por VIH (29). 9

35 Introdução Figura 5 Distribuição geográfica das formas genéticas de VIH-1 no Mundo, em geral (A), e em África, em particular (B) (adaptado da referência 30). 10

36 Introdução Dos 33,4 milhões de pessoas infectadas por VIH, no Mundo, 6,8 milhões vivem em países de baixo ou de médio rendimento e necessitam de tratamento anti-retrovírico imediato. Sessenta e três por cento das pessoas que, actualmente, beneficiam de TARV, nos países de baixo e médio rendimento, hoje em dia, são africanos, em comparação com 25%, em finais de 2003(31). Ainda que a África sub sariana tenha o maior número de indivíduos sob TARV, e esteja em segundo lugar no que diz respeito à cobertura terapêutica, a região representa, ainda, 70% das necessidades mundiais de tratamento não satisfeitas(32). Uma em cada sete vítimas mortais da doença, associadas à infecção por VIH, no Mundo, é criança com menos de 15 anos, facto que se deve ao fracasso da expansão dos programas de prevenção da transmissão mãe-filho de VIH e de prevenção da infecção por VIH em mulheres jovens (32).Apesar dos sucessos registados em países como o Brasil, Tailândia e Botsuana, apenas 6% das grávidas infectadas por VIH, no Mundo, beneficiam, actualmente, de profilaxia anti-retrovírica capaz de prevenir a transmissão mãe-filho de VIH. Pelo contrário, os casos pediátricos de infecção por VIH foram, praticamente, eliminados nos países industrializados. A taxa de mortalidade dos infectados por VIH nos países pobres, após um ano de tratamento é três vezes e meia superior em comparação com os europeus e norte-americanos. A terapêutica anti-retrovírica altamente eficaz (ou HAART, do inglês, highly active antiretroviral treatment), utilizada desde 1996,nos países desenvolvidos, permite, em geral, supressão da replicação de VIH e aumento do número de linfócitos TCD4 + (29, 33).Contudo, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que, 11

37 Introdução apenas, 31% dos infectados (nove milhões) com necessidade de TARV está sob tratamento (34). Esforços internacionais crescentes têm sido desenvolvidos para melhorar o acesso à TARV em países com recursos limitados. Assim, a OMS publicou recomendações para uma intervenção em termos de saúde pública para expansão da TARV (29, 34, 35).O custo dos medicamentos, uma das maiores barreiras para o acesso à TARV, nos países em desenvolvimento, tem vindo, rapidamente, a diminuir. A alteração da lei das patentes continua em discussão, de forma a que os países de menores recursos possam importar versões mais baratas dos genéricos dos anti-retrovíricos. Estudos piloto estão a ser desenvolvidos para assegurar a administração apropriada e segura dos medicamentos e a sua distribuição a nível periférico (34).Estas medidas possibilitaram que três milhões de infectados por VIH, em países em vias de desenvolvimento, estivessem em TARV, em finais de 2007 (32). Os receios iniciais de que houvesse um rápido crescimento e transmissão de vírus resistentes aos anti-retrovíricos não se confirmaram até à data (36, 37). De facto, os programas de TARV, em países com poucos recursos, têm dado resultados iguais ou melhores aos obtidos em países desenvolvidos (38-41). Um aspecto que muito contribui para este resultado é a elevada taxa de adesão à terapêutica que se verifica nestes países (42). Outro aspecto importante é o facto da maior parte dos doentes nestes países terem iniciado TARV com regimes altamente potentes o que atrasa, significativamente, o desenvolvimento e posterior transmissão de vírus resistentes (35). Não há dúvida, no entanto, de que será um grande desafio, para muitos países em 12

38 Introdução desenvolvimento, manterem os bons resultados iniciais. De facto, independentemente da potência do regime terapêutico, existe sempre o risco de emergência de estirpes resistentes. Na impossibilidade da quantificação de carga vírica, utilizada, por rotina, nos países desenvolvidos, é provável que os doentes sejam mantidos, durante muito tempo, com regimes inadequados, o que facilita a selecção de vírus resistentes (29, 43, 44). 1.5 Anti-retrovíricos Actualmente, para o tratamento da infecção por VIH, estão disponíveis as seguintes classes de medicamentos, que actuam em diferentes fases do ciclo de vida do vírus: 1. Nucleosídeos ou nucleotídeos inibidores da transcriptase reversa (TR) [N(t)ITRs]. 2. Nãonucleosídeosinibidores da TR(NNITRs). 3. Inibidores da protease (IPs). 4. Inibidores da integrase (INs). 5. Inibidores de entrada (IFs). 13

39 Introdução Nucleosídeosinibidoresda transcriptase reversa (NITRs) O alvo destes fármacos é a TR. Estão aqui incluídos: zidovudina (AZT), didanosina (ddi), estavudina (d4t), lamivudina (3TC), abacavir (ABC) e emtricitabina (FTC). Todos os NITRs são inactivos na sua forma nativa(45). Os derivados trifosfatados competem com os seus análogos naturais, os desoxirribonucleósidos trifosfato, pela incorporação na cadeia do ADN provírico. Ao contrário dos seus análogos naturais, os NITRs não têm o grupo hidroxil (OH) livre no carbono C3 da ribose. Assim, os NITRs actuam, primordialmente, como indutores da terminação da síntese do ADN, bloqueando o alongamento da cadeia dos nucleótideos. Estes anti-retrovirícos podem, ainda, actuar ligando-se, competitivamente, ao sítio activo da TR Não-nucleosídeos inibidores da transcriptase reversa (NNITRs) Os NNITRs incorporam-se directamente, de forma não competitiva, à TR numa zona próxima (bolso hidrofóbico) à do local de ligação dos nucleosídeos(46). Os NNITRs não necessitam de activação para inibirem a actividade da TR. O complexo resultante bloqueia o local de ligação dos nucleosídeos à TR o que causa atraso significativo na polimerização. Os NNITRs são inactivos contra VIH-2 (47). Três destes compostos, nevirapina (NVP), efavirenz (EFV) e etravirina (ETV) foram aprovados para o tratamento da infecção por VIH-1 (46). Os NNITRstêm baixa barreira genética, o que significa que uma simples mutação pode provocar resistência do vírus a estes fármacos. Esta resistência é cruzada dentro da classe, excepção para a ETV. 14

40 Introdução Inibidores da protease (IPs) Os IPs exercem o seu efeito antivírico ao ligaram-se, por competição, no sítio catalítico da PR, impedindo a sua actividade proteolítica. Nesta classe estão disponíveis vários fármacos, isto é, saquinavir (SQV), indinavir (IDV), ritonavir (RTV), nelfinavir (NFV), amprenavir (APV), atazanavir (ATV), lopinavir (LPV) e darunavir (DRV) (48). Os IPs têm elevada barreira genética porque são necessárias várias mutações para que ocorra resistência, podendo ser cruzada com os outros elementos desta classe Inibidores de entrada (IEs) Os IEs são de dois tipos, consoante o seu mecanismo de acção, isto é, inibidores do co-receptor CCR5 e os inibidores da fusão (IF) (49). Enfuvirtida (T20) é o único IF disponível; é um polipéptido constituído por 36 aminoácidos que interage, de forma específica, com a gp41 (50). A ligação de T20 impede a associação da HD-1 com a HD-2, a segunda α-hélice da gp41, o que impede que a gp41 assuma a sua conformação de fusão. Como consequência, não se dá a fusão do vírus com a célula hospedeira. Maraviroc (UK-427)é o único antagonista de CCR5 disponível(51, 52). Este fármaco, licenciado em 2007, pela Food and Drug Admnistration(FDA) para uso em combinação com outros anti-retrovíricos, liga-se a CCR5 e impede a ligação de VIH-1 ao seu co-receptor. UK-427 só é eficaz em doentes que albergam populações víricas, exclusivamente, com tropismo R5 (51, 52). 15

41 Introdução Inibidoresda integrase (IINs) Raltegravir (RAL) é o único dos IINs licenciado, até ao momento, para o tratamento da infecção por VIH(53). O seu alvo terapêutico é a enzima IN. RAL é activo contra vírus multi-resistentes aos elementos das outras classes terapêuticas (54). 1.6 Quando começar a terapêutica anti-retrovírica (TARV) e com que medicamentos De acordo com as recentes recomendações da OMS (29), a TARV deve ser iniciada em todos os doentes que tenham contagem de linfócitos TCD4 + inferior a 350/mm 3, seja qual for o estado clínico e em doentes que estejam no estádio clínico 3 ou 4 da OMS, seja qual for o número de linfócitos TCD4 +. A TARV, em doentes sem terapêutica prévia, deve ser iniciada com um dos seguintes regimes: AZT + 3TC + NVP; AZT + 3TC + EFV; TDF + 3TC (ou FTC) + NVP; ou TDF + 3TC (ou FTC) + EFV(29). 16

42 Introdução Nos doentes com tuberculose, a TAR deve ser iniciada, independentemente do número de linfócitos TCD4 +. A terapêutica da tuberculose deve anteceder a TARV e esta deve iniciar-se, logo que possível, após o início da terapêutica antituberculosa. Nestes casos, o NNITR de eleição deverá ser o EFV. Em caso de co-infecção por vírus da hepatite B, os doentes deverão ser tratados, independentemente do número de linfócitos TCD4 + ou estado clínico. O regime antiretrovírico inicial deve incluir TDF e 3TC (ou FTC) (29). Quando possível, a eficácia da TARV deve ser monitorizada, de seis em seis meses, avaliando a carga vírica e deve alterar-se, quando há falência vírica, confirmada pelo aumento da viremia acima das cópias de VIH/ml de plasma. A contagem de linfócitos TCD4 + deve ser utilizada para monitorizar a resposta à terapêutica, quando não se dispõe de carga vírica. A segunda linha terapêutica deve ser constituída por dois NITRs e um IP potenciado (IP/r) que deve ser ATV/r ou LPV/r (29). Recomenda-se a simplificação das opções escolhidas no que diz respeito a NITRs. Assim, se d4t, ou AZT, foram usados em primeira linha, deve usar-se TDF + 3TC (ou FTC) em segunda linha. Se TDF for usado, em primeira linha, deve mudar-se para a combinação AZT+ 3TC, em segunda linha. Quanto à terceira linha, a OMS recomenda que se escolham os regimes, tendo em conta, também, o financiamento, a sustentabilidade e o acesso equitativo à terapêutica (29). Os regimes de terceira linha devem, obviamente, incluir fármacos que têm actividade contra vírus resistentes. Fármacos de terceira linha são os IINs, 17

43 Introdução NNITRs e IPs de segunda geração. Recomenda-se, ainda, que os doentes permaneçam no mesmo regime de segunda linha, mesmo em situação de falência, quando não há acesso a outras opções terapêuticas. 1.7 Resistência aos anti-retrovíricos A impossibilidade de suprimir, por completo, a replicação vírica, predispõe para a selecção de variantes resistentes. Entre os factores que contribuem para a selecção de variantes resistentes incluem-se todos aqueles que condicionam níveis subterapêuticos, tais como a má adesão à terapêutica (com tomas irregulares ou auto-suspensões), toxicidade dos medicamentos, que obrigue à sua interrupção (55-57), limitada potência do regime terapêutico escolhido, má absorção intestinal e interacções medicamentosas, com redução dos níveis plasmáticos e/ou intracelulares dos ARVs, eliminação demasiado rápida, metabolização alterada (por potenciação ou inibição do mecanismo do citocrómio P450 ou défice de fosforilação intracelular) ou, ainda, mecanismos da membrana que mobilizam os fármacos de dentro para fora da célula (58). 1.8 Mecanismos de resistência aos anti-retrovíricos Resistência aos NITRs A resistência aos NITRs pode desenvolver-se através de dois mecanismos diferentes: a) por diminuição da ligação do fármaco à TR b) por pirofosforólise (59). 18

44 Introdução A diminuição da ligação do fármaco à TR é o mecanismo mais frequente de resistência e resulta de mutações nos locais de ligação dos fármacos à TR. A enzima mutada tem maior capacidade para discriminar e seleccionar o substrato fisiológico em vez do inibidor. Dois conjuntos de mutações conferem resistência a quase todos os fármacos da classe dos NITRs, isto é, a mutação no codão 151 (Q151M) e a inserção de dois aminoácidos na região do codão 69. Outras mutações conferem resistência, apenas, a alguns fármacos desta classe. No quadro 2 do anexo 1 estão descritas as mutações que conferem resistência aos NITRs Resistência aos NNITRs A enzima TR de VIH-1 possui duas subunidades, a p66 e a p51, e ambas têm quatro domínios denominados dedos, palma, polegar e conexão. Os NNITRs ligamse próximo ao sítio activo da TR, numa bolsa hidrofóbica, criada por descolamento do segmento polipeptídico que liga a palma ao polegar. As mutações que conferem resistência a esta classe de fármacos podem causar: a) Perda de contactos importantes entre a proteína e o inibidor; b) redução do tamanho da bolsa de ligação ou a sua deformação; c) interferência na entrada do inibidor na bolsa de ligação (59). As mutações que conferem resistência aos fármacos desta classe ocorrem em dois conjuntos, entre os codões e (quadro 3, Anexo 1). A ocorrência de resistência, como resultado da monoterapia, com qualquer destes fármacos, ocorre muito rapidamente, bastando uma única mutação, geralmente, K103N ou Y181C. A mutação no codão K103N é importante, porque confere resistência primária a todos os NNITRs. Em virtude de todos os NNITRs apresentarem, praticamente, o mesmo modo de ligação à RT, mutações que levam à 19

45 Introdução resistência a fármacos desta classe, como a substituição da Y181C ou K103N, inviabilizam a terapêutica com outros elementos desta mesma classe, com excepção da ETV, devido à resistência cruzada Mecanismos de resistência aos IPs As mutações que conferem resistência aos IPs podem ser classificadas como major, ou primárias e minor, ou secundárias (59). As mutações major são as primeiras a ser seleccionadas na presença do fármaco e conferem alterações fenotípicas que impedem a acção do anti-retrovírico. Estas mutações alteram a ligação do fármaco à protease, resultando no aumento constante da quantidade de fármaco necessário para inibir a enzima. Incluem-se, aqui, as mutações nas posições 30, 48, 50, 82, 84 e 90 (quadro 3, Anexo 1). As mutações minor emergem depois das primárias e, por si só, não causam alterações significativas no fenótipo vírico. Contudo, em conjunto com as mutações primárias, podempotenciar a capacidade de replicação (fitness) do vírus. Algumas mutações minor podem existir como polimorfismos naturais de alguns subtipos e, eventualmente, contribuir para baixar a barreira genética aos IPs e determinar novas vias de resistência (60) Epidemiologia da infecção por VIH/sida em Angola Angola fica situado na costa ocidental da África Austral. A Oeste é banhada pelo Oceano Atlântico, a Norte tem fronteira com a República do Congo Democrático 20

46 Introdução (Brazaville) e República do Congo (Kinshasa),a Este faz fronteira com a República da Zâmbia e a Sul com a República da Namíbia (quadro 6). Tem uma superfície de km 2, está dividida em18 províncias e Luanda é a sua capital. Figura 6 - Mapa de Angola (adaptado de http// Em grande medida, a infecção por VIH foi ignorada enquanto o País manteve um conflito militar, que deslocou, aproximadamente, um terço da sua população. 21

47 Introdução Angola tem reunido quase todos os factores de risco associados ao rápido crescimento da seroprevalência da infecção por VIH, tais como: a) Deficiente cobertura dos serviços de saúde e insuficiente organização das suas estruturas; b) elevado número de deslocados internos no país (quatro milhões), que regressaram agora às suas casas, juntamente com o aumento do contacto com pessoal militar; c) baixo nível de instrução; d) taxa de natalidade de 48,4%; e) população jovem (cerca de 70% dos angolanos têm menos de 24 anos); f) alto índice de pobreza; g) fraca autonomia da mulher; h) poucos mecanismos de protecção; i) redes sociais inoperacionais; j) disponibilidade reduzida de locais para testes de rastreio voluntário; k) deficiente disponibilização da TARV. Angola é um País em que a sexualidade tem muito peso (tem a segunda taxa mais alta de fertilidade, a nível mundial) e 70% das mulheres, aos 20 anos de idade, já têm, pelo menos, um filho (61-63). O primeiro caso de sida, em Angola, foi diagnosticado em 1985 e, até ao primeiro semestre de 2009, foram notificados cerca de 49 mil casos de infecção por VIH (64). A prevalência da infecção ronda os 5,0% em 16 milhões de habitantes, mas, nas zonas fronteiriças com a República do Congo (Kinshasa), Zâmbia e Namíbia pode atingir os 10%. A transmissão sexual é o principal modo de transmissão de VIH em mais de metade dos casos notificados. Angola possui 83 centros de rastreio voluntário e 23 unidades de saúde para atendimento de infectados por VIH (64). A TARV já está disponível em todas Províncias de Angola. 22

48 Introdução Figura 7-Proporção de testes positivos para VIH, por províncias de Angola, no 1º semestre de 2009 (relatórios provinciais) (64). De acordo com os dados disponíveis no relatório do 1º semestre de 2009, INLCS- Minsa, Angola, existem infectados por VIH e estão em TARV, entre adultos e crianças, verificando-se tendência para o aumento do número de casos (figura 8) (64). Figura 8 - Número acumulado de doentes (crianças e adultos) acompanhados e em 23

49 Introdução TARV por ano, desde 2004 até ao 1º semestre de 2009 (64). Quanto à seroprevalência da infecção, por Províncias de Angola, as autoridades sanitárias, no mesmo período em análise, afirmam que as províncias com maior percentagem de seropositividade para VIH foram Luanda (13,0%), Cunene (10,1%), província fronteiriça com a República da Namíbia, Lunda-Sul (9,4%), Lunda- Norte (9,1%), ambas províncias fronteiriças com a R.D.C. (Kinshasa) e República da Zâmbia e Namibe (7,3%), que faz fronteira com a República da Namíbia (figura 7). Nos testes VIH realizados diagnosticaram-se casos de infecção por VIH (6,8%);os adultos representaram o maior grupo (n=9473, 74%). Da análise da distribuição da infecção por VIH por sexo, constatou-se que 59,7% correspondiam ao sexo feminino. No período em análise foram testadas crianças, verificando-se que 968 estavam infectadas por VIH (12,1%) (64). Durante esse período, foram acompanhadas indivíduos, sendo 757 (9,3%) crianças e adultos (90%). A TARV foi iniciada em 3.927adultos(53,5%) e em 265 crianças (35,0%). A primeira linha de TARV, em Angola, é constituída por dois NITRs (zidovudina ou estavudina elamivudina) e nevirapina (63, 65). Também, nessa altura, foram testadas mulheres grávidas, das quais (2,3%) estavam infectadas por VIH. Desse total de grávidas infectadas por VIH, (47,8%) foram incluídas no programa de transmissão vertical (PT). As províncias em que foram encontradas taxas de infecção por VIH mais elevadas, na população, foram a de Cunene (5,3%), Lunda Norte (5,8%), Luanda (3,5%), Kuando Kubango e Cabinda (3,7%). A informação sobre epidemiologia molecular da infecção por VIH/sida em Angola, 24

50 Introdução ainda é escassa. Até à data, são conhecidos os resultados de, apenas, quarto estudos sobre a diversidade genética de VIH-1 e a resistência aos ARVs em Angola. Um estudo no Norte (Cabinda) e no Centro (Luanda) do País incidiu sobre isolados víricos de 48 infectados por VIH, residentes nestas localidades (66). Neste estudo, foram identificados os seguintes subtipos: A1 (n=18,38%), C (n=7,15%), H (n=5,10%), J (n=3,6%), G (n=2,4%), A2 (n=2,4%), F1 (n=1,2%) e D (n=1,2%). Oito das amostras (17%) tinham subtipo discordante. Havia seis formas de recombinantes diferentes, isto é, A1/H (n=3,6%), A1/G (n=1,2%), C/A2 (n=1,2%), F1/B (n=1,2%), G/B (n=1,2%), e G/H (n=1,2%). A diversidade genética de VIH-1 foi maior em Cabinda do que em Luanda o que, provavelmente, se justifique pela maior proximidade de Cabinda com a RDC, onde está referida uma das maiores variabilidades genéticas de VIH-1, em todo o Mundo. Relativamente à variabilidade genética noutras províncias de Angola e aos polimorfismos na TR e na PR associados (ou não) à resistência aos anti-retrovíricos, nada se sabe. Noutro estudo, foram analisados 37 amostras de infectados por VIH-1, também residentes em Cabinda e Luanda (67). A diversidade genética identificada, neste estudo, foi, também, muito elevada. Os subtipos mais predominantes foram C e F, mas também foram identificados subtipos A, D, G e H. Em três das amostras foram identificados vírus não classificáveis, que, possivelmente, pertenceriam a subtipos desconhecidos ou novas formas recombinantes. Foram ainda encontrados 13 isolados recombinantes, a maioria com padrões muito complexos. Bartolo et al., investigaram a diversidade genética de VIH-1 em Angola, em 2001, em 138 infectados por VIH-1 sem TARV, de oito Províncias (Benguela, Cabinda, 25

51 Introdução Kuanza-Norte, Luanda, Lunda-Norte, Malanje, Uíje e Zaíre), por sequenciação e análise filogenética das regiões p17 do gene gag, PR e RT do gene pol, e C2C3 do gene env (24). Este estudo concluiu que a diversidade genética de VIH-1 em Angola é ampla (extraordinária heterogeneidade), ultrapassando todos os valores conhecidos, até hoje, e todos os subtipos de VIH-1 foram detectados, excepto B e K. Por outro lado, esta diversidade traduz-se na presença de isolados altamente divergentes de quase todos os subtipos e CRFs conhecidos, bem como na presença de novos vírus recombinantes. Cinquenta e quatro vírus (39%) foram recombinantes entre dois ou mais subtipos, incluindo o sub-subtipo A3, recentemente descrito. Vinte e seis vírus (19%) foram recombinantes de segunda geração, constituídos por um ou mais subtipos e ou de formas circulantes recombinantes (CRFs). Identificaram-se, também, sequências não classificáveis (3%), bem como quatro sequências, que formam um novo subtipo A4. Assim, VIH-1 deverá ter sido introduzido, em Angola, no início da epidemia (década de 80 do século passado), por importação, a partir dos países limítrofes, sobretudo da RDC Em Angola, VIH-1 encontrou o ambiente adequado para prosseguir a sua evolução acelerada. A análise posterior das mutações de resistência no gene pol, em 122 doentes, revelou que apenas dois (1,6%) deles estavam infectados por vírus resistentes aos NRTIs e aos NNIRTs (as mutações de resistência encontradas foram M41L, D67N, M184V, L210W, T215Y, T215F e K103N) (68). Em relação à resistência adquirida aos anti-retrovíricos, em Angola, apenas estão disponíveis os resultados de um estudo(65). Este trabalho foi efectuado em , em 294 infectados por VIH, residentes em Luanda e sob terapêutica tripla de primeira linha (dois NITRs e um NNITR) por um período igual ou superior a seis 26

52 Introdução meses. Foram detectadas mutações de resistência em quase todos os doentes, das quais, as mais frequentes foram M184V (70%) e K103N (39%). A elevada taxa de resistência detectada sugere que alguns doentes poderão ter sido infectados por vírus resistentes. A transmissão de vírus resistentes pode comprometer, seriamente, a eficácia da TARV e é, particularmente, grave quando as alternativas aos regimes terapêuticos de primeira linha, actualmente, são quase nulas (9, 69, 70). 27

53 Objectivos 2. OBJECTIVOS Não existem dados recentes sobre o perfil epidemiológico, demográfico, clínico e imunológico da população infectada por VIH, em Angola. Também, não, existem dados recentes sobre a diversidade genética de VIH-1, em Angola, nem sobre a transmissão de vírus resistentes aos anti-retrovíricos. Neste contexto, os objectivos deste estudo foram: 1. Determinar o perfil epidemiológico, demográfico, clínico e imunológico da população infectada por VIH em Angola em Estudar a diversidade genética de VIH em Angola em Investigar a frequência e distribuição de polimorfismos na protease (PR) e na transcriptase reversa (TR) associados a resistência aos anti-retrovíricos, nos indivíduos não tratados, em

54 Material e Métodos 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Caracterização dos Serviços da Consulta de Infecciologia do Hospital da Divina Providência (HDP) Este estudo realizou-se numa das áreas de consultas do HDP, designada por Consulta de Infecciologia. O hospital é religioso, tutelado pela Congregação da Divina Providência, em parceria com o Ministério da Saúde, e foi inaugurado em Está localizado no município de Kilamba-Quiaxe, que tem uma população, estimada, de habitantes (13,4% dos de Luanda) (71). Tem quatro centros periféricos, sob sua dependência, que se encontram a 10km de distância do HDP e os doentes são transferidos destes centros para o HDP. Tem em funções 22 médicos (três pediatras, quatro internos de pediatria, 14 clínicos gerais eum psicólogo), 120 enfermeiros, totalizando 335 trabalhadores. A sua actividade está devotada à acção preventiva da doença na criança (Cuidados Primários de Saúde, Puericultura, Imunização, Recuperação Nutricional) e de apoio à saúde materna (Consultas Pré-natais e Imunização). Possui Laboratório, Serviços Gerais, Internamento de Pediatria, com 52 camas (18 referentes a mal nutrição), Internamento de Medicina, com 37 camas e de tuberculose, com 18 camas. A média anual de consultas é de 100 mil (72). A actividade clínica distribui-se pelas Consultas de Pediatria, de Medicina, de Infecciologia, de Oftalmologia, de Estomatologia, de Ortopedia, de Psicologia e de Curativos e pelos Serviços de Internamento. Quanto às actividades auxiliares, para além do Laboratório de Análises Clínicas, possui Farmácia e Serviço de Radiologia. Em relação ao tratamento da tuberculose, o HDP é uma unidade vocacionada para o diagnóstico e tratamento, possibilitando a toma directamente observada. A maioria dos doentes 29

55 Material e Métodos internados é proveniente das diferentes consultas realizadas no HDP, dos centros periféricos e de outros hospitais de Luanda. 3.2 Doentes e métodos O primeiro passo do projecto foi a obtenção de aprovação, pela Direcção Geral do HDP e pela Comissão Nacional de Ética de Angola (Anexo 2). Como previsto no cronograma do projecto (Anexo 3), a consulta dos processos clínicos dos doentes decorreu de 11 de Setembro de 2008 a 19 de Janeiro de A participação dos indivíduos, neste estudo, foi voluntária, dando o seu consentimento informado (anexo 4). Os indivíduos infectados por VIH foram observados em Consulta Externa de Infecciologia e outros no internamento, onde foram colhidas e preenchidas as informações clínicas para a ficha de recolha de dados (anexo 5). Em simultâneo com a recolha de dados, foi, também, recolhida uma amostra de sangue venoso. Diariamente, no final das colheitas, procedia-se à separação do plasma, que era transportado, no mesmo dia, para o Laboratório Nacional de Saúde Pública de Luanda (LNSP). As amostras foram conservadas a -80ºC até serem transportadas para o Laboratório da Unidade de Retrovírus e Infecções Associadas do Centro de Patogénese Molecular da Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa. De acordo com as recentes recomendações da OMS para este tipo de estudos, a generalidade dos indivíduos neste estudo obedeciam às seguintes características (9): a) Infecção por VIH-1 confirmada. b) Menos de 25 anos de idade. c) Mulheres que nunca engravidaram ou que estavam na primeira gravidez. 30

56 Material e Métodos d) Sem diagnóstico clínico de sida (abaixo dos estádios 3 ou 4 da OMS). e) Sem qualquer TARV. 3.3 Amostras incluídas no estudo A infecção por VIH, nos indivíduos estudados, foi determinada em Luanda pelo teste rápido Determine (Abbott) e confirmada pelo teste rápido UniGold (TrinityBiotech). Os indivíduos incluídos no estudo apresentavam positividade em ambos os testes. 3.4 Quantificação da carga vírica plasmática A carga vírica plasmática foi efectuada em 86 doentes com o kit Abbott RealTime HIV-1 (Abbott), no Laboratório de Biologia Molecular do Hospital de Egas Moniz, Lisboa (Dr. Ricardo Camacho). 3.5 Extracção de ARN para genotipagem de resistência Seleccionaram-se 57 amostras de plasma para genotipagem de resistência, do grupo etário dos anos de idade, de ambos os sexos, com valores de linfócitos TCD /mm 3. A extracção do ARN destas amostras fez-se a partir de 140 μl de plasma com o Kit da QUIAGEN, de acordo com as orientações do fabricante. Em resumo, as amostras foram, previamente, descongeladas, retiraram-se 140 µl de plasma para um tubo de 1,5 ml ao qual se acrescentou 560µl de solução lise AVL e Carrier RNA, adicionou-se 560 µl de etanol a 100% e aplicou-se esta mistura numa coluna à base de sílica. Posteriormente, procedeu-se a duas lavagens da coluna com os tampões AW1 e AW2, que permitiram eliminar resíduos e contaminações do ARN e melhorar a sua qualidade. Para maior rentabilização efectuou-se dupla 31

57 Material e Métodos eluição com 40 µl de tampão AVE, para prevenir o crescimento microbiano e contaminação com ARNases. Depois da extracção do ARN do plasma fez-se a transcrição reversa de ARN, para ADN e amplificação do ADN utilizando os primers e condições de reacção que a seguir se descreve. 3.6 Primers Os primers foram previamente descritos por Bartoloe colaboradores (68). A posição e a sequência dos primers utilizados neste trabalho estão indicadas no quadro 7. Quadro 7 Primers utilizados na amplificação por PCR nested e sequenciação do gene pol (PR e RT) de VIH-1. Primer Posição Região Sequencia (5`-3 ) BPR Gag (NC) AAAAGGGCTGTTGGAAATGTGGG IBPR RT GCAAATACTGGAGT(A/G)TT(G/ATAG IBPR Gag P1-P6 AGGCCAGGGAATTT(T/C)C(T/CTCAGA IBRT RT CCTACACCTGTCAACATAA IBRT RT TGTTTTACATCATTAGTGTG IBRT RT TAAATTTTCCAATTAGTCC IBRT RT TAAATTTGATATGTCCATTG IBR2604RT RT CCAAA(A/G)GTTAAACAATGGCCATTGACAGA IB355RT RT ATTTGATATGTCCATTG IB2997RT RT CCACAGGGATGGAAAGGATCACC IB2997RT RT GGTGATCCTTTCCATCCCTGTGG IB2621PR PR AATGCTTTATTTT(C/T)TCTTCTGTCAATGGC Os nucleotídeos, entre parêntesis, indicam a degeneração introduzida nestas posições para se ter em consideração a variação de sequência observada entre os vários isolados de referência de VIH-1. 32

58 Material e Métodos 3.7 Reacção de polimerização enzimática em cadeia PCR O gene pol foi amplificado por PCR em duas etapas PCR nested, de acordo com as condições descritas no quadro8. Os fragmentos amplificados foram analisados em gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídio. 33

59 Material e Métodos Quadro 8 Misturas de reacção e ciclos de amplificação dos PCRs efectuados neste trabalho. Pares de primers IBPR1.1/IBRT2 Tamanho do fragmento 1641 pb Mistura de reacção RT-PCR Mistura 1: dntps (2,5mM) - 30µL; Primer 1 (1µM) 30µL; Primer 2 (10µM) -30µL ; Solução DTT (100mM) - 30µL; Inibidor de Rnases (40U/µl) - 30µL; RNA 10µL Mistura 2: MgCl2 (25mM)- 6µl; Tampão 5x - 10µl; Enzima - 1µl; dh2o - 8µl Condições de reacção 55ºC, 30min; 1 ciclo; 94ºC, 2min; 1 ciclo; 94ºC, 10seg; 59ºC, 30seg; 68ºC, 1min; 10 ciclos; 94ºC, 10seg; 59ºC, 30seg; 68ºC, 1min, incrementos de 5 seg; 25 ciclos; 68ºC, 30min; 1 ciclo IBPR3.1/IBPRT º PCR Tampão David 10X - 5µl; BSA - 0,7µl; dntps (2,5mM) - 1µl; MgCl2 (50mM) - 2,5µl; Primer 1 (10µM) - 2,5µl; Primer 2 (10µM) - 2,5µl; Taq Polimerase (5U/µl) 0,3µl; dh2o 30,5µl; Amplificado do 1º PCR - 5µl 94ºC, 5min; 1 ciclo; 94ºC, 10seg; 10 ciclos; 53ºC, 30seg; 10 ciclos; 68ºC, 1,5min; 10 ciclos; 94ºC,10 seg, 25 ciclos; 53ºC, 30 seg,25 ciclos; 68ºC, 1,5 Sseg, 25 ciclos incrementos de 20 seg; 68ºC, 30 min 34

60 Material e Métodos 3.8 Sequenciação Os produtos de PCR foram purificados com o JETQUICK PCR Purification Kit (Genomed) e sequenciados com o BigDye Terminator V3.1 Cycle sequencing Kit (Applied Biosystems), com os primers descritos no quadro 7, no sequenciador automático Avant Genetic Analyser (Applied Biosystems). 3.9 Análise filogenética da região da protease As sequências nucleotídicas foram alinhadas com as das referências de todos os grupos, subtipos e CRFs, retiradas da HIV Sequence Database (30).O programa de alinhamento utilizado foi o Clustal X. Os alinhamentos foram editados e corrigidos manualmente, no programa GeneDoc. A distância genética entre as sequências foi calculada através do modelo de Kimura à dois parâmetros e a análise filogenética foi realizada pelo método neighbor-joining, no programa MEGA 3.1 (24). A fiabilidade dos agrupamentos (clusters) gerados nas árvores filogenéticas foi determinada pelo internal branch-test com 10 mil réplicas (bootstraps). Os agrupamentos observados nas árvores filogenéticas só têm validade estatística quando apresentam valores de bootstrap 70% Análise das mutações de resistência aos anti-retrovíricos A análise das mutações de resistências aos anti-retrovíricos na PR e TR foi realizada através do algoritmo de resistência da base de dados de Stanford, tendo em atenção, ainda, as mutações associadas, exclusivamente, à resistência primária (transmitida) (73-76). 35

61 Material e Métodos 3.11 Análise estatística O tratamento estatístico foi realizado recorrendo ao programa GraphPad Prism versão 4. O teste de Mann-Whitney foi usado para comparar variáveis contínuas, que não seguiam uma distribuição normal (amostra global vs amostra genotipada: idade, carga vírica e contagens de linfócitos TCD4 +. O teste exacto de Fisher foi utilizado para comparar frequências (amostra global vs amostra genotipada - género e vias de transmissão). O teste de Spearman e a análise de regressão linear foram utilizados para analisar a associação e correlação entre a carga viral e o número de linfócitos TCD4 +. O limite de significância estatística considerado foi de 5% (P <0,05). 36

62 Resultados 4. Resultados 4.1 Características clínicas e demográficas dos doentes angolanos Foram colhidas 219 amostras de plasma de infectados por VIH, dum total de 304 indivíduos inquiridos, na Consulta de Infecciologia do HDP. Os indivíduos eram encaminhados para o Laboratório, onde era realizada a colheita de 8-10 ml de sangue venoso. Registou-se a perda de 85 amostras, por morte (estado grave em que os doentes chegavam ao hospital), pelo desaparecimento de algumas amostras no LNSP, pela sobrecarga de trabalho no laboratório do HDP, pela não comparência dos indivíduos no Laboratório no dia indicado e pela dificuldade em localizar os doentes para o retorno. As características epidemiológicas e clínicas dos indivíduos incluídos neste estudo estão indicadas no quadro 6, do anexo 6. A maior parte apresentava infecção por VIH, com critérios de sida, isto é abaixo dos estádios 3 ou 4 da OMS. Foram diagnosticados 28 casos de provável hepatite B crónica (AgHBs positivo), quatro dos quais em grávidas e outros quatro casos de tuberculose associada a hepatite B Naturalidade e distribuição por sexo Foram incluídos 304 indivíduos; dois deles foram excluídos por não serem angolanos (08AGHDP03 e 08AGHDP224), pelo que os resultados apresentados se referem a 302 indivíduos. Mais de metade dos 302 indivíduos era do sexo feminino (204;67,5%) (Figura9). Trinta e três (10,0%) eram crianças e 42 mulheres (13,9%) estavam grávidas. 37

63 Resultados 33% Masculino Feminino 67% Figura 9 Distribuição, por sexo, dos indivíduos incluídos no estudo Distribuição etária A idade média dos indivíduos estudados foi de 31 anos (mínimo um ano e máximo 69 anos de idade). Na figura10 apresenta-se a sua distribuição pelos grupos etários e por sexo.com excepção do primeiro e dos dois últimos grupos etários, é claro o predomínio foi do sexo feminino. A maior parte encontrava-se na faixa etária compreendida entre os 20 e os 49 anos. 38

64 Números de indivíduos Resultados M F Total A A A A 60 e + Grupos etários Figura 10 Distribuição dos indivíduos estudados, por grupo etário e sexo Distribuição dos indivíduos de acordo com a via de transmissão. A maior parte dos indivíduos (n=262; 86,8%) tinha sido infectada por via heterossexual, 31 (10,2%) crianças foram infectadas por via vertical, quatro (1,3%) foram infectados através de transfusão e, em cinco (1,7%), a via de transmissão era desconhecida (figura 11). Não houve referências em relação as vias de transmissão homossexual/bissexual, hemofília ou toxicodependência. 39

65 Resultados 10% 1%2% 87% Heterossexual Vertical Transfusão Desconhecida Figura 11- Distribuição dos indivíduos incluídos no estudo, de acordo com a provável via de transmissão Estádio da doença. A maior parte dos indivíduos estava em estado avançado de imunossupressão, sendo a mediana do número de linfócitos TCD4 + de 274/mm 3 (mínimo de um e máximo de 1914). Em 31,8% dos casos os linfócitos TCD4 + estavam abaixo de 200/mm 3. Não foi possível quantificar os linfócitos TCD4 + em 61 indivíduos devido a problemas de ordem técnica. Nenhum dos indivíduos, até à data da colheita da amostra, se encontrava submetido à TARV. De acordo com o critério de classificação da infecção por VIH, segundo o CDC (1993), quanto ao estadiamento da infecção, apenas se pôde classificar os indivíduos de acordo com os linfócitos TCD4 +, não se podendo diferenciar em estádios clínicos. Sessenta e nove indivíduos (22,8%) foram classificados na categoria C3 (menos de 200 células/mm), 98 (32,5%) A3 e 58 (19,2%) A1. 40

66 Resultados 4.2 Grupos nosológicos Dentro do grupo das comorbilidades, predominou a tuberculose, com 62 casos detectados (22,1%). O diagnóstico de tuberculose, em 57 doentes, fundamentou-se no exame directo da expectoração (coloração de Ziehl-Neelsen), em quatro casos baseou-se em critérios clínicos e radiológicos e, num caso, numa criança, por critérios clínicos, radiológicos, teste de Mantoux e história familiar de contacto (mãe). Em 28 indivíduos (9,3 %) detectou-se a presença de AgHBs. Os resultados sobre hemoglobina, foram recolhidos em 255 indivíduos (84,4%). Foram considerados resultados recentes os que tinham sido obtidos há três meses, ou menos, à data da consulta. Os limites inferiores eram de 2 g/dl e o superior era de 16 g/dl, a média foi de 8,4 g/dl. As doenças definidoras de sida e outras patologias, encontradas nestes doentes, estão listadas no quadro 9, chamando-se a atenção para o facto de que o mesmo doente pode ter tido mais do que uma patologia. Quadro 9 Patologias diagnosticadas nos indivíduos incluídos no estudo. A) Patologias associadas à sida Patologias Números de casos Herpes zóster 11 Pericardite tuberculosa 1 Sarcoma de Kaposi 3 Síndrome de emaciação 1 41

67 Resultados Tuberculose pulmonar 62 Total 78 B)Outras comorbilidades Comorbilidades Números de casos Abcesso dentário 2 Anemia 40 Artrite 2 Candidose (orofaríngea ou vaginal) 3 Dermatitepuriginosa 5 Derrame pleural sem isolamento do 1 agente Diarreia aguda 4 Esterilidade 2 Foliculite vulvar 2 Gastrite por Helicobacterpylori 1 Hipertensão arterial 2 Infecção respiratória 16 Linfadenopatia generalizada persistente 2 Malnutrição calórica proteíca (marasmo, 4 marasmo Kwashiokor) Malnutrição calórica proteíca e infecção 2 42

68 Resultados respiratória Neuropatia periférica 1 Otite média aguda (OMA) 5 AgHBs + 29 Perturbação da personalidade (provável 1 esquizofrenia) Piodermite 1 Poliomiosite 1 Sépsis com ponto de partida urinário 1 Síndrome vírica aguda 30 Sífilis 2 Total 154 A designação infecção respiratória incluiu infecções respiratórias altas como a sinusite e as infecções respiratórias baixas como as pneumonias. Em apenas dois casos, foi possível determinar a provável etiologia da diarreia, Entamoeba histolítica e Hymenolepsis nana Schistosso mamansoni e outras parasitoses intestinais foram as causas de anemia em dois indivíduos. 4.3 Estádio da doença, carga vírica e diversidade genética dos isolados víricos em circulação em Angola. O número de linfócitos TCD4 + foi determinado em 226 indivíduos (75%). A mediana encontrada foi de 276 linfócitostcd4 + /mm 3 (amplitude: ). A carga vírica foi 43

69 Resultados determinada em 86 (28%) indivíduos que apresentavam, em média, 5,1 log 10 cópias de ARN VIH1/ml de plasma. Em geral, a carga vírica estava elevada e o número de linfócitos TCD4 + baixo (quadro11). Os doentes com tuberculose tinham um número, significativamente, inferior de linfócitos TCD4 + [mediana 195 (n=44) vs 315 (n=183) células/mm3, P = 0,0005] e carga vírica, significativamente, superior aos indivíduos sem tuberculose [média 5,8 (n=18) vs. 4,0 (68) log10 cópias de ARN vírico/ml de plasma, P =0,0002]. Quadro 10 Características demográficas, imunológicas e víricas dos infectados por VIH-1 no HDP (Setembro de 2008 a Janeiro de 2009) Variáveis Total da amostra Nº doentes [n (%)] 302 (100) Idade [anos, média (DP)] 31 (12) (n = 295) Género [n (%)] Masculino 98 (32,5) Feminino 204(67,5) Via de transmissão [n (%)] Heterossexual 262 (86,8) Vertical 31 (10,2) Transfusão 4 (1,3) Semindicação 5 (1,7) Patologiasinfecciosasassociadas Tuberculose [n (%)] 62 (19,9) HepatiteB [n (%)] 29 (10) Nº de células TCD4 + [células/mm 3, mediana (amplitude)] 276 (1-1914) (n= 226) Cargavírica [log 10cópias de ARN vírico/ml plasma, média (DP)] 5,1 (1,0) (n = 86) A carga vírica e o número de linfócitos TCD4 + foram determinados, simultaneamente, em 73 (24%) indivíduos e verificou-se que os dois parâmetros estavam, negativamente, correlacionados (Spearman r = -0,3319, P = 0,0041) (figura 12). Estes resultados confirmam a associação directa entre a perda de linfócitos TCD4 + em indivíduos não tratados e a carga vírica (23, 77). 44

70 Resultados Figura 12- Correlação entre a carga vírica e o número de linfócitos TCD4 + em 73 indivíduos. Utilizou-se a correlação de Spearman e é igualmente, assinalada a recta de regressão (correlação linear). Em 57 indivíduos, VIH foi analisado, genotipicamente, para determinar o seu subtipo e o perfil potencial de resistência aos anti-retrovíricos. Para este efeito, utilizou-se um método in-house que permite amplificar e sequenciar as regiões codificantes para a PR e para a TR no gene pol (23, 66, 68). As características demográficas e imunológicas dos indivíduos incluídos nesta análise estão indicadas no quadro10. Embora a carga vírica fosse semelhante, os indivíduos analisados estavam, significativamente, mais comprometidos a nível imunológico do que a restante população (tinham menos de 128 linfócitos TCD4 + /mm 3 em média, P < 0,0001). Foi possível obter sequências da PR e/ou TR de todos os 57 indivíduos. A 45

71 Resultados região correspondente à PR foi amplificada e sequenciada em 56 (98%) indivíduos, enquanto a região correspondente à TR foi amplificada e sequenciada em 48 (84%) doentes. A PR e a TR foram sequenciadas em 46 (81%) indivíduos. Quadro 11 - Comparação das características demográficas, imunológicas e víricas entre a amostra global e os indivíduos efectivamente genotipados. Doentesgenotipados Variáveis Total da amostra P nesteestudo Nº doentes [n (%)] 302 (100) 57 (19) - Idade [anos, média (DP)] 31 (12) (n = 295) 33 (10) 0,1685 a Género [n (%)] b Masculino 98 (32,5 17 (30) Feminino 204 (67,5) 40 (70) 0, Via de transmissão [n (%)] Heterossexual 262 (86,8) 54 (95) Vertical 31 (10,2) 3 (5) 0,3245 b Transfusão 4 (1,3) 0 Semindicação 5 (1,7 - a Nº de células CD4 [células/µl, mediana (amplitude)] 276 (1-1914) (n= 226) 148 (35-810) (n= 55) < 0,0001 Carga viral [log 10 cópias de ARN viral/ml plasma, média (DP)] 5,1 (1,0) (n = 86) 5,1 (1,1) (n = 49) 0,6888 a Subtipopuro [n (%)] 1-16 (37) (n = 46) - Nãotipáveis 2-1 (2) (n = 46) - Recombinantes [n (%)] - 30 (65)(n = 46) - 1 Subtipo igual na PR e na TR 2 Subtipo desconhecido na PR e na TR 3 CRFs conhecidos ou classificação diferente na PR e na TR. a b Mann-Whitney test Fisher exact test A análise filogenética, individualizada, das sequências da PR (Figura 13 A) e da TR (figura 13 B) demonstrou que apenas 16 (37%) indivíduos albergavam vírus de um único subtipo (subtipo puro). Os restantes (n=30, 65%) estavam, na sua maioria, infectados por vírus recombinantes, incluíndo formas CRFs e outros recombinantes (Quadro12). Um indivíduo (d94) estava infectado por um isolado não tipável (U). 46

72 Resultados A) 47

73 Resultados B) 48

74 Resultados Figura 13 Análise filogenética de sequências da PR (A) e da TR (B) dos isolados de VIH-1 em circulação em Luanda em A escala representa o número de substituições por posição. Os subtipos e CRFs estão assinalados a negrito. Os números resultam de testes de repetição (bootstrap) das árvores. Valores acima de 70% são considerados significativos e conferem suporte estatístico aos agrupamentos de sequências. A CRF mais prevalente foi a CRF02_AG tanto na PR (cinco indíviduos, 9%), como na TR (5; 10%), logo seguida da CRF01_AE [PR=4, 7%; TR=4, 8%]. O subtipo mais prevalente na PR foi o G (12, 21%), seguido do D (7, 13%) e do C (6, 11%). Na TR os subtipos mais prevalentes foram o A, C e F1 todos presentes em cinco dos indivíduos (10%). Sequências não tipáveis foram detectadas em seis (11%) indivíduos, na PR e quatro (8%) na TR. Vinte e quatro indivíduos estavam infectados com vírus contendo PRs e TRs pertencentes a diferentes subtipos, a vírus não tipáveis ou a CRFs (quadro 12). O recombinante deste género mais frequente foi o G/U que estava presente em três dos indivíduos (13%). De salientar que 13 (54%) destes indivíduos albergavam recombinantes de segunda geração, ou seja, vírus que resultam da recombinação entre um CRF e um vírus de um subtipo puro ou um vírus não tipável (U). 49

75 Resultados Quadro12 Forma genética dos isolados víricos analisados neste estudo nas regiões codificando para a PR e TR (gene pol). Subtipo Doente PR TR d7 C C d15 D D d20 G CRF02_AG d22 CRF11_CPX CRF11_cpx d26 F1 CRF04_cpx d29 D CRF05_DF d33 F1 F1 d38 - F1 d42 J d49 G A3 d55 CRF01_AE? K d59 A2 A2 d62 G J d73 A3 CRF01_AE? d77 C C d78 F1 F1 d89 G U d91 F1 F1 d92 A? CRF01_AE d93 - d94 U U d100 A? CRF01_AE d101 D D d105 CRF02_AG CRF02_AG d110 D D d111 C C d119 D - d122 H H d124 CRF02_AG - d129 D A d130 A? d150 CRF02_AG - d156 U H d157 G G d167 CRF01_AE? A d168 CRF01_AE? - d169 CRF01_AE? A d180 D D d184 H H d190 A? C d197 U - d200 C CRF01_AE? d201 G CRF02_AG d204 A2 A2 d205 C - d206 G U d217 U H d237 F F1 d247 C C d248 CRF02_AG CRF02_AG d259 G U d266 CRF02_AG CRF02_AG d267 A d278 G CRF05_DF d284 H - d290 G A d297 U - U, vírus não tipáveis; (?) indica que o genótipo tem de ser confirmado por métodos mais sofisticados de análise filogenética 50

76 Resultados Neste estudo detectámos oito (14%) indivíduos, potencialmente, infectados com vírus recombinantes constituídos por CRF01_AE na PR ou TR. 51

77 Discussão 5. Discussão Contrariamente ao proposto inicialmente, não foi possível cumprir, na íntegra, todos os critérios de inclusão. O cumprimento estrito dos critérios iria reduzir o tamanho da amostra e comprometer o estudo (por exemplo, incluir, apenas, indivíduos com menos de 25 anos de idade e sem diagnóstico clínico de sida). É de salientar que, em Angola, a sexualidade tem muito peso (70% das mulheres, aos 20 anos de idade, já têm, pelo menos, um filho) e o início da actividade sexual é muito precoce, o que dificultou o cumprimento do terceiro critério (mulheres que nunca engravidaram ou que estavam na primeira gravidez). Nenhum dos indivíduos, até a data da colheita, se encontrava submetido à TARV. Por deficiências na biossegurança, 1,7% dos indivíduos foram infectados através de transfusão. A maior parte dos indivíduos estudados apresentava marcada imunossupressão, com contagem de linfócitos TCD4 + abaixo de 200/mm 3. Muitos doentes tinham evidência de comorbilidades, principalmente, a tuberculose. Estes resultados demonstram que a maior parte dos indivíduos em análise estavam em estado de imunodeficiência avançada e são compatíveis com o facto de que não estavam em TARV (33). Estes dados são, ainda, consistentes com a associação negativa entre tuberculose e a infecção por VIH, que se observa, particularmente, nos países em desenvolvimento (78). Com base na recente recomendação da OMS para tratar os doentes com contagens de linfócitos TCD4 + <350/mm 3 (29), 58% destes indivíduos deveriam iniciar, de imediato, TARV. Com base na recomendação mais antiga, de só tratar doentes com linfócitos TCD4 + <200/mm3 (79), apenas 44% destes indivíduos seriam candidatos a TARV. 52

78 Discussão Na distribuição pelos principais grupos nosológicos, optou-se pela divisão em diagnóstico principal, isto é, a patologia dominante, que motivou a consulta de Infecciologia ou o internamento e em morbilidades co-existentes que condicionaram o prognóstico. Em relação ao diagnóstico, a maior parte fundamentou-se no diagnóstico clínico, nomeadamente herpes zoster, otite média aguda, dermatite pruriginosa e artrite (diagnóstico fundamentado, também, no exame citoquímico do líquido intraarticular). Relativamente à patologia pulmonar, os achados clínicos e radiológicos, permitiram diagnosticar a pneumonia. Quanto à tuberculose pulmonar, o diagnóstico fundamentou-se na clínica, na radiografia e no exame directo da expectoração, recorrendo à coloração de Ziehl-Neelsen (na maior parte dos casos). Alguns casos de tuberculose foram considerados, apenas, por diagnóstico presuntivo (clínica e achados radiológicos) e, outros casos, em crianças, pelo teste de Mantoux e pela clínica e exame directo (coloração de Ziehl-Neelsen), do aspirado gástrico. De realçar que, de momento, em Angola, não existe a possibilidade de realizar o exame cultural para Mycobacterium tuberculosis, por rotina. Este facto pode ter subestimado o número de casos de tuberculose, na amostra estudada, já que a sensibilidade da coloração de Ziehl-Neelsen ronda os 50-60%. O diagnóstico de pericardite foi determinado pelos dados clínicos, radiografia do tórax e ecocardiograma. O diagnóstico de infecção por vírus da hepatite B foi confirmado por testes rápidos. Nos casos em que foi possível a determinação das transaminases, não se evidenciou qualquer aumento. Muito provavelmente, estes casos correspondiam a hepatite B crónica, já que estavam assintomáticos. No entanto, não foi possível 53

79 Discussão obter informação acerca do tempo de positividade do antigénio. Atendendo a que o número de portadores crónicos do AbHBs, em África, é elevado, podemos aceitar que se trataria, na sua maioria, de mulheres com infecção crónica e por vírus de hepatite B. Não foi possível efectuar serologia para o vírus da hepatite C, por razões de ordem técnica. Os indivíduos com infecção por VIH assintomática foram às consultas motivadas pelos seguintes motivos, isto é, morte ou infecção por VIH de um dos membros da família (esposo/a, filhos), comportamentos de risco (por exemplo relações desprotegidas, poligamia, camionistas e taxistas), por estarem grávidas, por apresentarem manifestações clínicas sugestivas de sida, tais como tuberculose, herpes zóster e sífilis. Não houve registo de casos de malária neste grupo de doentes. Estes resultados são consistentes com estudos efectuados em Luanda e Cabinda, em 2001 e demonstram que epidemia de VIH/Sida neste País é ainda muito complexa em termos víricos (66-68, 80). CRF01_AE tem origem asiática (81-89) e não tinha sido detectado nos estudos efectuados em Angola em 1993 e em 2001 (66-68, 80). Em , o CRF01_AE foi detectado num indivíduo (3%) residente em Luanda (65). Deste modo, os resultados indicam que CRF01_AE foi introduzido no país entre 2002 e 2006 e que desde essa altura se está a disseminar, rapidamente, pela população local. A sua provável origem poderá estar relacionada com a população imigrante de origem asiática, a trabalhar em Angola, sobretudo a partir de 2002, data do fim da guerra civil. Tendo em conta que a população de origem asiática mais numerosa, 54

80 Discussão em Angola, é proveniente da China (cerca de indivíduos) e que o CRF01_AE, é um dos principais tipos de VIH em circulação na China (81, 83-88), é muito provável que o CRF01_AE existente em Luanda, tenha a sua origem na China. Estudos adicionais de natureza filogenética são necessários para esclarecer em definitivo a origem e actual parentesco do CRF01_AE em circulação em Luanda. Entretanto, os resultados são importantes na medida em que documentam uma possível alteração do perfil epidemiológico da infecção por VIH em Angola, que poderá vir a ter consequências importantes ao nível da prevenção e da terapêutica. Por exemplo, os resultados implicam que existam indivíduos da população chinesa, em Angola, que desconheçam a seropositividade por VIH ou que estejam infectados por VIH sem terapêutica anti-retrovírica eficaz (90). Deste modo, a prevenção da transmissão de VIH pela comunidade chinesa e/ou outras comunidades asiáticas, a residir em Angola, dependerá do diagnóstico atempado, da oferta de terapêutica anti-retrovírica e da adopção de outras medidas preventivas, especificamente, orientadas para esta população (90, 91). A análise das sequências para as mutações de resistência, na base de dados de Stanford, inequivocamente associadas com a transmissão de vírus resistentes aos anti-retrovíricos revelou que, não obstante a presença de numerosos polimorfismos invulgares na PR e TR, nenhum dos indivíduos era portador deste tipo de vírus (73-76). Estes resultados são semelhantes aos resultados obtidos em 2001 e indicam que a transmissão de vírus resistentes não tem sido identificada, até hoje em Luanda e, provavelmente, em Angola (68). Contudo, esta situação pode alterar-se, rapidamente, devido ao aumento do acesso aos ARVs e à forte presença de populações migrantes, potencialmente infectadas, por VIH, em Luanda. A vigilância 55

81 Discussão periódica da presença de vírus resistentes, nas populações tratadas e não tratadas, por métodos semelhantes aos aqui descritos, é fundamental para detectar, precocemente, e prevenir a transmissão primária de resistências. Entretanto, é importante salientar que a ausência de mutações de resistência primária, neste estudo, sugere que a TARV está a ser bem implementada e bem gerida em Angola, e indica, ainda, que a maior parte dos angolanos infectados por VIH têm sido, eficazmente, tratados com os regimes de primeira linha, actualmente, em uso em Angola (AZT ou d4t, 3TC e NVP). Em conclusão, o gene pol dos isolados de VIH-1 angolanos indica uma elevada complexidade genética. A forma recombinante CRF01_AE é uma nova adição à associação da complexidade de VIH-1, em Angola. A emergência deste fenómeno em Luanda pode estar associada à afluência recente de emigrantes provenientes da Ásia, especificamente da China. A ausência de resistências aos ARVs, indica que os regimes terapêuticos, de primeira linha, em Angola podem, com sucesso ser usados na maioria dos indivíduos infectados por VIH-1. Estudos futuros são necessários para avaliar o impacto desta diversidade em mudanças na epidemiologia da infecção por VIH-1, em Angola. É necessária uma monitorização continuada da eficácia e da resistência da terapêutica em indivíduos tratados para se poder optimizar a TARV em Angola. 56

82 Anexos Anexo 1 Quadros de mutações de resistências aos anti-retrovíricos (73) Quadro 2 Mutações de resistências aos NIRTs Mutações Perfil de resistências aos NIRTs M184 I Resistência elevada in vitroa 3TC e FTC e resistência baixa in vitro a ddi e ABC. Aumenta a susceptibilidade a AZT, TDF e d4t. Reverte parcialmente a resistência a AZT, d4t e TDF causada por outras mutações de resistência a AZT. V Resistência elevada in vitroa 3TC e FTC e resistência baixa in vitro a ddi e ABC. Aumenta a susceptibilidade a AZT, TDF e d4t. Reverte parcialmente a resistência a AZT, d4t e TDF causada por outras mutações de resistência a AZT T A M S M41 L Ocorre normalmente associada à T215Y. Juntas, conferem resistência intermédia a AZT e d4t e baixa resistência a ddi, ABC e TDF. D67 N Confere algum grau de resistência a cada NRTI excepto a 3TC e FTC. Normalmente ocorre associado a mutações nas posições 70 ou 215. K70 R Resistência baixa a AZT, d4t e, possivelmente, a TDF. Aparenta ter pouco ou nenhum efeito sobre os outros NIRTs. L210 W Confere resistência a cada um dos NIRTs excepto 3TC e FTC. Ocorre normalmente associado à M41L e T215Y. T215 F Confere resistência a AZT e d4t e reduz a susceptibilidade a ABC,ddI e TDF. Y Confere resistência a AZT e d4t e reduz a susceptibilidade a ABC,ddI e TDF, particularmente quando este ocorre em combinação com M41L e L210 W. K219 E/Q Diminui a probabilidade de susceptibilidade a AZT e provavelmente a d4t na presença das K70 R ou T215F/Y embora com pouco ou nenhum efeito sob dos outros NIRTs. Não -TAMS K65 N Mutação rara associada a susceptibilidade reduzida a ddi, ABC, 3TC, FTC e TDF. R Resistência intermédia a ddi, ABC, 3TC, FTC e TDF. Resistência baixa a d4t. Hipersusceptibilidade a AZT. K70 R Reduz a susceptibilidade a TDF, ABC, ddi e com menor reforço a 57

83 Resistência Multinucleosídica Anexos 3TC e FTC. Não reduz a susceptibilidade a d4t e ddi. G Aparenta reduzir a susceptibilidade a TDF, ABC, e ddi e com menor reforço a 3TC e FTC. Efeito no d4t desconhecido. L74 I Reduz a susceptibilidade a ABC e ddi. Reverte parcialmente a resistência a AZT e, possivelmente, a d4t causada por outras mutações. V Reduz a susceptibilidade a ABC e ddi. Aumenta a susceptibilidade a AZT e TDF. Reverte parcialmente a resistência a AZT e possivelmente a d4t causada por outras mutações. V75 M Reduz a susceptibilidade a d4t e, possivelmente, a ddi. T Reduz a susceptibilidade a d4t e a ddi. Y115 F Resistência intermédia a ABC e resistência baixa a TDF. T69 I A inserção de aminoácido nesta posição ocorre em 1-2% de doentes fortemente tratados. Em associação com as TAMs conferem resistências elevadas a cada um dos NIRTs. Q151 M Resistência intermédia a AZT, ddi, d4t e ABC. Resistência baixa a TDF. Em associação com alterações nas posições75, 77 e 116 confere resistência elevada a AZT, ddi, d4t e ABC; resistência intermédia a TDF e resistência baixa a 3TC e FTC. A62 V Associada a resistência multinucleosídica causada por Q151M. O seu efeito na ausência de Q151M é desconhecido V75 I Aumenta a resistência multinucleosídica causada por Q151M quando presente com F77L e F116Y. O seu efeito na ausência de Q151M é desconhecido. F77 L Aumenta a resistência multinucleosídica causada por Q151M quando presente com V75I ou F116Y. O seu efeito na ausência de Q151M é desconhecido F116 Y Aumenta a resistência multinucleosídica causada por Q151M quando presente com V75I ou F77L. O seu efeito na ausência de Q151M é desconhecido. 58

84 Anexos Quadro 3 Mutações de resistências aos NNIRTs Mutações Perfil de resistências aos NNRTs A98 G Resistência baixa a NVP. Ocorre em cerca de 1% de doentes não tratados com NNIRTs. L100 I Resistência intermédia a NVP, FV e resistência baixa a ETR. Surge, frequentemente, combinada com K103N. Aumenta a susceptibilidade a AZT e TDF. Reverte parcialmente a resistência a AZT e, possivelmente,a d4t causada por outras mutações. E P Q Associada a resistência intermédia a NVP e DLV. Resistência baixa a EFV e ETR. Normalmente ocorre com K103N, originando, nesse caso, resistência elevada a NVP, DLV e EFV e resistência baixa/intermédia a ETR. Ocorre, ocasionalmente, em indivíduos não tratados e não reduz a susceptibilidade aos NNIRTs K103 N Resistência elevada a NVP, DLV e EFV. Por si só não tem efeito na susceptibilidade a ETR. S Resistência elevada a NVP e resistência intermédia a DLV e EFV. V106 A Resistência elevada a NVP, resistência intermédia a DLV e resistência baixa a EFV e ETR. M Resistência elevada a NVP, DLV e EFV. Aparentemente não reduz a susceptibilidade a ETR. V108 I Resistência baixa a todos os NNIRTs com possível excepção de ETR. V179 D Baixa redução na susceptibilidade a cada um dos NNIRTs. Ocorre em cerca de 1% de doentes não tratados. Combinada com a K103R reduz em cerca de 15 vezes a susceptibilidade a NVP, DLV e EFV, sendo o seu efeito no ETR desconhecido. E F Baixa redução na susceptibilidade a cada um dos NNIRTs. Ocorre frequentemente combinada com a Y181C. Esta combinação reduz em mais de 100 vezes a susceptibilidade a ETR e causa resistência baixa a EFV. Y181 C Resistência elevada a NVP e DLV e baixa resistência a EFV. Reduz a susceptibilidade a ETR em 5-10 vezes I Resistência elevada a NVP e DLV e baixa resistência a EFV. Reduz a susceptibilidade a ETR em 5-10 vezes. Aumenta a susceptibilidade a AZT e TDF. 59

85 Anexos V Resistência elevada a NVP e DLV e baixa resistência a EFV. Reduz a susceptibilidade a ETR em 5-10 vezes. Aumenta a susceptibilidade a AZT e TDF. Y188 C Resistência elevada a NVP e baixa resistência a EFV e DLV, o seu efeito sobre ETR é desconhecido. H L Baixa resistência a NVP, EFV e DLV. Seleccionada in vitro por ETR. Resistência elevada a NVP e EFV e resistência baixa a ETR e DLV. G190 A Resistência elevada a NVP, resistência intermédia a EFV e baixa resistência a ETR. Aumenta a susceptibilidade a DLV. E Resistência elevada a NVP e EFV e resistência intermédia a DLV. Combinada com Y181C está associada à redução da susceptibilidade a ETR em mais de 100 vezes. P225 H Resistência elevada a NVP e EFV. Baixa resistência a intermédia a ETR. Aumenta a susceptibilidade a DLV. F227 C Mutação rara que tem sido associada com níveis inconsistentes de resistência a todos os NNIRTs, particularmente ETR. L Ocorre normalmente em combinação com V106A encontrando-se desta forma associada a resistência elevada a NVP e resistência intermédia a DLV. O seu efeito no ETR é desconhecido. M230 L Resistência intermédia a elevada a cada um dos NNIRTS. Seleccionada invitro por ETR reduzindo a susceptibilidade ao mesmo em cerca de 10 vezes. P236 L Resistência elevadaa DLV. K238 T Ocorre normalmente em combinação com outra mutação de resistência a NNIRTs aparentando dessa forma conferir níveis de resistência intermédia a NVP e possivelmente a DLV e EFV. 60

86 Anexos Quadro 4 Mutações de resistências aos IPs Mutações Perfil de resistências aos IPs Associada a resistência a cada um dos IPs quando na presença de outras mutações L10 V/I/F/R L10V/I ocorrem em 5-10% de indivíduos não tratados. L10F/R são mutações não polimórficas I23 I Mutação rara que causa baixa resistência a NFV. L24 I Associada a resistência a IDV e possivelmente o RTV, LPV, SQV e ATV quando presente com outras mutações D30 N Resistência intermédia a NFV V32 I Reduz a susceptibilidade a IDV, RTV, FPV, LPV, TPV e DRV. V33 F Seleccionada pelo FPV, DRV, LPV, ATV e TPV, podendo contribuir para resistência a estes fármacos. M46 I Reduz a susceptibilidade a M46I/L IDV, NFV, FPV, LPV, ATV, TPV, e possivelmente a SQV e DRV na presença de outras mutações L Reduz a susceptibilidade a M46I/L IDV, NFV, FPV, LPV, ATV, TPV, e possivelmente a SQV e DRV na presença de outras mutações. I47 A Normalmente ocorre em combinação com a V32I e dessa forma acusa resistência elevada a LPV e FPV e provável resistência intermédia a DRV. V Diminui a susceptibilidade a FPV, ATV, IDV, LPV, TPV e DRV. G48 M Resistência elevada a SQV e resistência intermédia a NFV, ATV, IDV e NFV. V Resistência elevada a SQV, resistência intermédia a ATV e NFV e baixa resistência a IDV e LPV. I50 L Resistência intermédia a elevada a ATV e hipersusceptibilidadeaos restantes IPs V Resistência intermédia a elevada a FPV, resistência intermédia a LPV e DRV, e aumenta a susceptibilidade a TPV. F53 L Ocorre apenas em doentes não tratados e em combinação com outras mutações de resistência. Está associada a redução da susceptibilidade a IDV, LPV, e SQV e possivelmente a outros IPs. I54 A Mutação relacionada as IPs observada em doentes sob tratamento intensivo e reduz a susceptibilidade à maioria dos IPs. L Reduz a susceptibilidade a FPV, LPV, DRV, NFV e possivelmente a ATV. Associada a aumento da susceptibilidade a TPV. 61

87 Anexos M Reduz a susceptibilidade a FPV, LPV, DRV, NFV e ATV. V Contribui para resistência a cada um dos IPs (exceptuando, possivelmente, DRV) quando presente com outras mutações. G73 S Seleccionada e associada a diminuição da susceptibilidade a todos os IPs. T Seleccionada e associada a diminuição da susceptibilidade a todos os IPs. L76 V Reduz a susceptibilidade a FPV, IDV, LPV e DRV e aumenta a susceptibilidade a SQV e ATV. V82 A Reduz a susceptibilidade a IDV e LPV. É associada, na presença de outras mutações à redução da susceptibilidade a NFV, ATV, SQV, FPV e TPV. F L T Reduz a susceptibilidade a IDV, LPV, FPV e DRV. É associada, na presença de outras mutações à redução da susceptibilidade a NFV, ATV, SQV e TPV. Mutação rara seleccionada pelo TPV. O seu efeito nos IPs ainda não foi caracterizado Reduz a susceptibilidade a IDV, LPV e TPV. É associada, na presença de outras mutações à redução da susceptibilidade a NFV, ATV, FPV e SQN. S Provável efeito similar à V82T que reduz a susceptibilidade a IDV, LPV e TPV. Na presença de outras mutações está associado à redução da susceptibilidade a NFV, ATV, FPV e SQV. I84 A Mutação rara que aparentemente reduz a susceptibilidade a todos os IPs. C V Mutação rara que aparentemente reduz a susceptibilidade a todos os IPs. Resistência intermédia a elevada a ATV, FPV, IDV, NFV, SQV e TPV e resistência baixa a intermédia a LPV e DRV. N88 D Baixa resistência a NFV S Resistência elevada a NFV e ATV e baixa resistência a IDV. Aumenta a susceptibilidade a FPV. L90 M Resistência a NFV, SQV, ATV e IDV. Na presença de outras mutações compromete a actividade do FPV, LPV e TPV. Efeito desconhecido no DRV. 62

88 Anexos Quadro 5 Mutações de resistências aos anti-retrovíricos transmitidos. NIRTs NNIRTs IPs M41 L L100 I L23 I K65 R K101 E, P L24 I D67 N,G K103 N D30 N T69 D,N,Ins V106 A, M V32 I K70 E,R E138 K I47 V, A L74 I,V V179 F G48 M, V V75 T,M,S Y181 C, I, V I50 V, L Y115 F Y188 L,C F53 L,Y Q151 M G190 A,S I54 V,M,L,T,S,A M184 V,I P225 H Q58 E L210 W M230 L G73 S,T,C,A T215 C,,D,E,F,V,Y,S,I Y318 F T74 P K219 E,Q L76 V V82 A,F,L,T,S,M C N83 I84 N88 L89 L90 D V D,S V M 63

89 Anexos Anexo 2 Aprovação da direcção do hospital da divina providência e da comissão de ética de Angola 64

90 Anexos 65

91 Anexos Anexo 3 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADE 66