Marcadores Moleculares

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1 UNIVERSIDDE FEDERL DO PRNÁ SEOR DE IÊNIS RÁRIS DEPRMENO DE FIOENI E FIOSSNIRISMO F 060- Biotecnologia Vegetal Marcadores Moleculares Prof a. Renata Faier alegario Profº Bruno Portela Brasileiro

2 Marcadores genéticos Marcador: função de identificar ou etiquetar; Marcadores genéticos: marcar alelos cuja expressão seja de difícil identificação; Selecionar o alelo de interesse de forma indireta, por meio do marcador;

3 Marcadores genéticos Deve ser herdável e de fácil avaliação; Deve estar intimamente ligado ao alelo que deseja-se selecionar; Estudos de divergência genética, teste de paternidade, seleção etc. Marcadores genéticos: Morfológicos; Moleculares.

4 Marcadores moleculares Década de 70: engenharia genética (biologia molecular); Marcadores moleculares: Proteínas (produtos diretos dos alelos); DN (seqüências de DN situadas próximas aos genes que queremos marcar).

5 INRODUÇÃO Marcadores aracterísticas que permitem a distinção de indivíduos geneticamente diferentes Morfológicas, Bioquímicas ou Moleculares (BORÉM, 1997).

6 plicações: diversas áreas do conhecimento Melhoramento enética mendeliana enética de populações Marcadores enéticos enética molecular Organização do genoma Sequenciamento ransferência gênica

7 Fenótipo aracterísticas visíveis de um indivíduo Sofre influência: LUNS ONEIOS BÁSIOS enótipo Fatores ambientais enótipo onstituição genética de um organismo => o conjunto de genes

8 LUNS ONEIOS BÁSIOS Haplóide: onstituído por uma cópia de cada cromossomo Diplóide: onstituído por duas cópias de cada cromossomo lelo: enes que ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos Local ocupado pelo gene no cromossomo Haplóide Diplóide

9 LUNS ONEIOS BÁSIOS Homozigotos: élula diplóide com alelos idênticos de um gene em ambos os cromossomos homólogos Heterozigotos: élula diplóide com alelos diferentes de um gene em ambos os cromossomos homólogos

10 DOMINÂNI ene Recessivo (a) Só manifesta o fenótipo quando em homozigose (aa) Presente em dose dupla (dois alelos iguais) ene Dominante () Manifesta o mesmo fenótipo em homozigose () e heterozigose (a)

11 MRDORES DOMINNES = alelo dominante Presença de bandas 2 alelos recessivos no mesmo loco: usência de banda só amplifica locus com alelos dominantes Mesmo padrão de bandas: Homozigose e Heterozigose => exclusão de um dos alelos na expressão gênica do heterozigoto

12 MRDORES O-DOMINNES enes no mesmo locus Padrão de bandas diferentes: Homozigose e Heterozigose => Expressão de ambos os alelos no heterozigoto

13 Monomorfismo e Polimorfismo

14 IPOS DE MRDORES Marcadores Morfológicos aracterísticas fenotípicas do organismo Ex. Nanismo, deficiência de clorofila, cor de pétala Marcadores Bioquímicos Presença ou ausência de compostos Ex. isoenzimas e proteínas Marcadores Moleculares Presença ou ausência de sequências de DN Ex. alteração em bases nitrogenadas - Várias técnicas

15 ONEIO DE MRDOR dominante e co-dominante Dominante o-dominante

16 ipos de Marcadores

17 RERÍSIS DESEJÁVEIS DE UM MRDOR Reprodutibilidade mplamente distribuído através do genoma Poder de discriminação usência de influências ambientais Barato Fácil de mensurar

18 MRDORES MOLEULRES Marcadores genéticos que exploram a variabilidade do DN aracterísticas polimórficas herdáveis que refletem diferenças na sequência de DN ao nível de nucleotídeos Qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene expresso ou de um segmento específico de DN Polimorfismo detectado na sequência de DN => Variabilidade

19 PLIÇÕES Diversidade genética de organismos Proteção de cultivares - demonstrar que a cultivar é diferente de qualquer outra variedade da mesma espécie nálise da pureza genética de semente Mapeamento de genes e características (associação do marcador com os genes de interesse) Seleção de genitores Retrocruzamento assistido...

20 MRDORES MOLEULRES Vantagens Não sofre influência do ambiente Neutros em relação a efeitos fenotípicos N ilimitado de marcadores e de polimorfismo Identificação de genótipos em estágios iniciais da planta celera o processo de seleção e recombinação desejáveis Desvantagens Necessidade de técnicas e equipamentos mais complexos

21 ÉNIS E FERRMENS DE BIOMOL Levou à descrição de várias classes de marcadores moleculares Eletroforese Eletroforese Enzimas de restrição Restrição PR ermociclador PR DN ligase

22 écnicas para obtenção de padrão polimórfico de DN Marcadores baseados em PR PR (Reação da polimerase em cadeia). RPD ISSR Microssatélites Minissatélites FLP, etc.

23 PR - REPLIÇÃO IN VIRO Saiki, RK, elfand, DH, Stoffel, S, Scharf, SJ, Higuchi, R, Horn,, Mullis, KB & Erlich, H Primer-direct enzymatic amplification of DN with a thermostable DN polymerase. Science. 239: NOBEL

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25 PR - REPLIÇÃO IN VIRO Promove a síntese específica de certos segmentos do DN genômico; Necessidade de síntese de primers; ada molécula produz duas moléculas filhas idênticas a cada ciclo (2 n ).

26 PR - Pequena quantidade de DN genômico (10ng); - Solução tampão contendo magnésio; - Dois primers específicos; - dp, dp, dp, dp; - DN polimerase.

27 DN Polimerase DN polimerase comum (E. coli); aq polimerase (bactérias termofílicas hermus aquaticus); Possibilidade de automação do processo; Surgimento de várias metodologias para detectar marcadores moleculares do DN.

28 PR - ermociclador 94 0 separação das fitas de DN (desnaturação); 55 0 os primers pareiam aos sítios que flanqueiam a região a ser amplificada; 72 0 a enzima DN polimerase estende o primer, ou seja, adiciona nucleotídeos ao terminal 3 -OH dos primers; Depois de 40 ciclos (1 a 4 h); Região amplificada pode ser visualizada em gel de eletroforese.

29 écnica da PR onsiste na síntese in vitro de fragmentos de DN; Reagentes e moléculas utilizadas: - DN a ser amplificado; - Primers; - DNps; - aq DN polimerase; - o-fatores necessários para a síntese;

30 écnica da PR ermociclador; iclos ( 40); Eletroforese; Luz U.V.;

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35 ERMOILDOR

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37 Polimerização de DN

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52 LSSES DE MRDORES MOLEULRES partir => Varia de acordo com a técnica usada para identifica-lo RFLP Restrição e Hibridização de sequências DN RPD, Microssatélites PR FLP PR + restrição...

53 Marcadores isoenzimáticos Marcadores de proteína mais utilizados são representados pelas isoenzimas (esterase, fosfatase, peroxidase etc); omo são produtos diretos dos alelos, basta identificá-los para selecionarmos os indivíduos com o fenótipo desejado; Possuem reduzida variabilidade (polimorfismos);

54 Marcadores isoenzimáticos Os alelos responsáveis pelas proteínas facilmente identificáveis não ocorrem em número suficiente para marcar um grande número de alelos de interesse. Ex. Em cevada Isoenzima esterase para selecionar plantas resistentes ao vírus do mosaico amarelo. Vantagem: menores custos.

55 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Polimorfirmo no tamanho do fragmentos de restrição Utiliza o DN genômico digerido com enzima de restrição Examina diferenças no tamanho dos fragmentos de DN Polimorfismo: é resultado de mutação pontual, inserção, deleção Requer conhecimento sequência

56 RFLP Planta, fungo, organismos... Hibridização Southern Blot

57 RFLP - MEODOLOI 1. DN tratado com enzimas de restrição = era fragmentos pequenos 2. Separação dos fragmentos: Eletroforese (gel agarose) 3. ransferência DN para a membrana e Hibridização com sonda 4. Visualização dos fragmentos na membrana Southern blot sondas marcadas ( 32 P) ou Fluorescência 5. nálise dos resultados presença/ausência de bandas diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas escolha de sonda/enzima de restrição = direcionada

58 NÁLISE DOS RESULDOS

59 RFLP: Identificação de Fitoplasma em omate pb Fragmentos que hibridizarem com a sonda + rupo 16 SrIII 118 Fonte: Mello et al., 2007.

60 Brássica: diferentes padrões de bandas em F2 = diferença genética => representam um loco RFLP = pode ser usado como marcador genético Eletroforese do DN cortado com enzima de restrição Homozigotos p/ os alelos 1: 3, 5, 6, 7, 8, 9 Homozigotos p/ os alelos 2: 1, 2,4 el revelado com EtBr => UV Visualização de arraste contínuo de fragmentos de DN

61 RFLP Vantagens Reprodutibilidade Marcadores co-dominantes Simples Desvantagens rabalhoso aro Uso de sondas radioativas

62 RPD Random mplification of Polymorphic DN Fragmentos de DN amplificados por PR Método mais rápido para detecção de polimorfismos DN genômico amplificado por PR Uso de um único primer aleatório (8-10 bases): função de R e F Não requer conhecimento da sequência Marcador dominante

63 RPD - MEODOLOI 1. DN é amplificado via PR com primer aleatório => era fragmentos pequenos 2. Separação dos fragmentos por eletroforese 5. nálise dos resultados presença/ausência de bandas diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas

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65 RPD - MEODOLOI B B

66 PRIMERS LEÓRIOS DN Primer se anela em vários pontos do DN (desconhecidos) Quando se anela em direções opostas = mplificação nelamento em pequenas distâncias Vários Fragmentos

67 RPD - Feijoeiro Resistentes à raça pb 1000 pb 550 pb marcador ligado à o-1 o-1 = gene que confere resistência à raça 65 de. lindemuthianum Fonte: Moura, 2005

68 RPD Vantagens Rápido e simples - não envolve hibridização Baixo custo Sem uso de radioisótopos Não precisa conhecimento prévio da sequência de DN Desvantagens Marcador dominante Problemas de reprodutibilidade: produtos amplificados não são conhecidos Problemas de interpretação: co-migração - mesma banda: mesmo fragmento? Pode ser outro! - uma banda: um fragmento? Pode ser dois! Fonte: IPRI

69 MIROSSÉLIES Pequenas sequências com 1 a 4 nucleotídeos, repetidas em tandem (em sequência) presentes no genoma eucarioto Mononucleotídeos Dinucleotídeos rinucleotídeos etranucleotídeos mplificadas por PR Marcador o-dominante lasse de marcador com maior grau de polimorfismo Requer conhecimento prévio da sequência

70 MIROSSÉLIES Sinonímias SSR (Simple Sequence Repeats); SMS (Sequence agged Microsatellites); SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms); Onde são encontrados??? Mamíferos: ()n ( a vezes no genoma) Plantas: ()n Mitocôndrias loroplastos

71 MIROSSÉLIES: MEODOLOI 1. Digestão DN Enzimas de Restrição 2. Seleção dos Fragmentos (tamanho) e clonagem em vetor 3. ransformação da bactéria e seleção das colônias por hibridização (sondas marcadas com sequências repetidas) 4. Sequenciamento dos clones 5. Desenho dos primers

72 MIROSSÉLIES Marcador o-dominante M homozigoto heterozigoto el de poliacrilamida => Perceber diferenças de nucleotídeos

73 DEEÇÃO DE LOUS SSR Simple Sequence Repeats = Microssatélites Homozigoto Heterozigoto Homozigoto () 3 () 3 mostra 1 mostra 2 mostra 3

74 MIROSSÉLIES cada ilha microssatélite constitui um locus, multialélico ada fragmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo locus

75 MIROSSÉLIES Marcador multialélico lelos diferentes da mesma repetição (mesmo locus) Marcador Molecular com maior conteúdo de informação de polimorfismo

76 MIROSSÉLIES Vantagens Reprodutibilidade Requer pequena quantidade de DN Baixo custo rande poder de resolução lto nível polimorfismo útil para germoplasmas aparentados e de baixa variabilidade Desvantagens Necessidade de serem desenvolvidos para cada espécie (primers aleatórios) rabalhoso Porém: uma vez desenvolvido é fácil aro

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78 tributos Isoenzimas Proteínas de sementes RFLPs RPDs Microssatélites FLPs Nível de baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto Polimorfismo Estabilidade moderada alta alta alta alta alta ambiental Número de locos moderado (<50) baixo (<10) alto alto alto alto Expressão genética co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante Número de alelos por 2-5 multialélico multialélico 2 multialélico 2 loco Distribuição no regiões de cópia regiões de cópia várias ao acaso ao acaso ao acaso genoma única única cessibilidade muito alta muito alta média muito alta muito baixa média tecnológica plicabilidade no melhoramento rápido, baixo custo rápido, baixo custo lento, custo médio rápido, baixo custo lento, custo alto rápido, custo baixo Identificação de baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta genótipos valiação de média baixa alta alta alta muito alta germoplasma Mapeamento baixa muito baixa alta alta muito alta alta genético Mapeamento de baixa inadequado média muito alta média muito alta regiões específicas Mapeamento baixa inadequado muito alta baixa alta baixa comparativo enética de baixa baixa média alta muito alta muito alta utógamas enética de média baixa média alta muito alta muito alta lógamas nálise Filogenética média baixa muito alta média alta média daptado de epts (1993) e Ferreira & rattapaglia (1995).

79 Marcadores de DN Exemplo: Espécie humana Estimativa: pares de nucleotídeos; Em cada 100 nucleotídeos um deve ser diferente (polimórfico); Espera-se de pares de nucleotídeos diferentes quando se comparam dois indivíduos tomados ao acaso na população.

80 Distâncias e Dissimilaridades DISSIMILRIDDE utiliza dados binários para o cálculo, ou seja, marcadores dominantes. É o complemento da similaridade (Dis= 1- Sim), é um índice de divergência. DISÂNI utiliza freqüências alélicas para seu cálculo, ou seja, marcadores codominantes. Utilizam-se de conceitos genéticos e/ou geométricos.

81 Medidas de Dissimilaridades Objetivo: representar o grau de divergência entre diferentes populações ou indivíduos. Os marcadores são interpretados como dados binários (1 e 0) presença ou ausência da banda. Principais índices: - Jaccard - Simple Matching (oincidência simples) - Dice (Sorensen ou Nei-Li)

82 Distâncias genéticas Marcadores codominantes (RFLP, SSR, isoenzimas) discriminam o genótipo heterozigoto do homozigoto e se prestam ao cálculo das frequências alélicas. Distância genética de Nei, Rogers e Reynolds FP, D, NSYS, RLEQUIM...

83 RPD (Random mplified Polymorphic DN)

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86 Medidas de Similaridades

87 Medidas de Similaridades

88 Medidas de Dissimilaridades

89 Matriz de Similaridade

90 Distância genética de Nei

91 alculando a distância

92 rquivo marcador codominante

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94 Distância Nei: Loco 1

95 Distância Nei: Locos 1, 2 e 3

96 nálise de grupamento onstrução de dendrogramas;

97 nálise de grupamento UPM (Unweighted Pair rouping Method with ritimetical Means) entre populações e entre indivíduos/populações.

98 orrelação cofenética análise de correlação tem como objetivo determinar o grau de relacionamento entre duas variáveis, isto é, a covariabilidade entre elas. n i i n i i i n i i xy Y Y X X Y Y X X Y V X V Y X ov R ,

99 lgumas observações importantes devem ser feitas em relação ao coeficiente de correlação: - O coeficiente de correlação é adimensional. 0 r 2 1 e 1 rxy 1 - Um coeficiente de igual a zero não implica falta de relação entre duas variáveis, apenas reflete a ausência de relação linear entre essas variáveis. X2 X2 X2 X1 X1 X1 X2 X2 X1 X1

100 onsiderando que os resultados dos agrupamentos sofrem acúmulo de erro a cada ciclo de inclusão de um indivíduo, isto se reflete na construção do dendrograma, conduzindo a interpretações distorcidas dos resultados obtidos. Em que: ij = valor de similaridade entre os indivíduos, obtidos a partir da matriz cofenética; e S ij = valor de similaridade entre os indivíduos, obtidos a partir da matriz de similaridade.

101 F E D B F E D B D F E D B F E D B D Matriz dissimilaridade Matriz cofenética

102 Rolph (1992) considera a partir do coeficiente de correlação cofenético: Muito bom: r 0,9; Bom: 0,8 r < 0,9; Ruim: 0,7 r < 0,8; e Péssimo: r 0,7. Há que se ressaltar que um baixo coeficiente de correlação cofenético não significa que o dendrogama não tem utilidade; apenas indica que alguma distorção deve ter ocorrido.

103 BIBLIORFI 1. luízio Borém e Eveline eixeira aixeta - Marcadores Moleculares Viçosa, M, Fábio elape Faleiro - Marcadores enético-moleculares aplicados a programas de conservação e uso de recursos genéticos. EMBRP errados, Planaltina, DF,