UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA DO AMAZONAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HEMATOLOGIA

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1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA DO AMAZONAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HEMATOLOGIA MESTRADO EM CIÊNCIAS APLICADAS À HEMATOLOGIA FREQUÊNCIA DOS ALELOS HLA EM PACIENTES COM LEUCEMIA E DOS DOADORES VOLUNTÁRIOS DE MEDULA ÓSSEA, ATENDIDOS NA FUNDAÇÃO HOSPITALAR DE HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA DO AMAZONAS MIRIAN RODRIGUES RIBEIRO SANTIAGO MANAUS 2015

2 MIRIAN RODRIGUES RIBEIRO SANTIAGO FREQUÊNCIA DOS ALELOS HLA EM PACIENTES COM LEUCEMIA E DOS DOADORES VOLUNTÁRIOS DE MEDULA ÓSSEA, ATENDIDOS NA FUNDAÇÃO HOSPITALAR DE HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA DO AMAZONAS Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Hematologia da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, em cumprimento a requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Aplicadas à Hematologia. Orientador: Prof. Dr. Daniel Saito Co-orientadora: Profa. Dra. Aya Sadahiro MANAUS 2015

3 APRESENTAÇÃO: Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária da Fundação Hemoam: Ana Cristina Chagas Sena CRB-11/348 S135f Santiago, Mirian Rodrigues Ribeiro. Frequência dos alelos HLA Classe I e II em pacientes com leucemia e doadores voluntários de medula óssea atendidos na Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas. Mirian Rodrigues Ribeiro Santiago. Manaus: UEA/FHEMOAM p. Ilust. Dissertação (Mestrado em Ciências Aplicadas em Hematologia) Universidade do Estado do Amazonas e Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas. Escola de Ciências da Saúde (ESA). Orientador: Prof. Dr. Daniel Saito Co-orientadora: Profa. Dra. Aya Sadahiro 1.Leucemias, 2. Alelos HLA, 3. Suscetibilidade, 4. Resistência. I. Título. CDU:

4 FOLHA DE JULGAMENTO FREQUÊNCIA DOS ALELOS HLA EM PACIENTES COM LEUCEMIA E DOADORES VOLUNTÁRIOS DE MEDULA ÓSSEA ATENDIDOS NA FUNDAÇÃO HOSPITALAR DE HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA DO AMAZONAS MIRIAN RODRIGUES RIBEIRO SANTIAGO Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências aplicadas a Hematologia, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Hematologia da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas. BANCA EXAMINADORA Prof. Daniel Saito, Dr. Presidente Profa. Mariane Martins de Araújo Stefani, Dra. Membro Profa. Leny Nascimento da Motta Passos, Dra. Membro

5 Dedicatória Aos meus pais, Raimundo e Graça, meus exemplos de vida e dedicação, graças a eles pude chegar aonde cheguei e conquistar o que conquistei. A meu esposo Jacob e minha filha Thalyssa pelo apoio, dedicação e amor dedicados a mim. A vocês, meu AMOR, CARINHO, RESPEITO e GRATIDÃO.

6 AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar, agradeço a DEUS, criador de TUDO e de TODOS. Graças a ELE, pude desenvolver meus conhecimentos e aprimorar minhas aptidões profissionais. Obrigado Deus Pai! Pela vida, saúde, vitória e, acima de tudo, pela força, para sempre me erguer nos momentos difíceis. Ao meu esposo Jacob e minha filha Thalyssa que sempre estiveram ao meu lado, obrigada pelo carinho, incentivo, amor e paciência. Aos meus pais Raimundo e Graça Ribeiro que continuam nessa mesma filosofia e me incentivam até hoje, a eles minha eterna gratidão não só pela formação profissional, mas pelos ensinamentos para a vida. A minha família Ribeiro que sempre estiveram presentes dando todo o apoio necessário para que pudesse vencer os obstáculos do dia-a-dia; Aos meus orientadores e mestres Dr. Daniel Saito e Dra. Aya Sadahiro, pelo apoio, disponibilidade e carinho que sempre demonstram a mim. A todos esses professores em especial, minha gratidão, nossa convivência durante esses anos contribuiu muito para meu crescimento profissional. Agradeço também aos pacientes, que foram essenciais para realização deste trabalho. A toda equipe do Laboratório de HLA (Adriana, Lorena, Nandara e William) e a todos os funcionários do LAC por toda ajuda dada; A equipe do setor de estatística da Fundação HEMOAM pela ajuda no projeto. Enfim, a todos que contribuíram para que essa dissertação de mestrado se tornasse uma realidade, muito obrigada.

7 RESUMO O desenvolvimento das leucemias está relacionado a diversos fatores, tais como a predisposição genética, exposição a produtos químicos e irradiação. No Brasil, embora muitas pesquisas sobre antígenos leucocitários humanos (HLA) associados às doenças tenham sido conduzidas, ainda existe uma grande lacuna de conhecimentos sobre a participação do HLA nas leucemias. Por este motivo, o presente estudo teve como objetivo a investigação da frequência dos alelos HLA Classe I (A e B) e II (DRB1) em 177 pacientes com diagnóstico de leucemia: linfóide aguda (LLA, n=105), mieloide aguda (LMA, n=42) e mieloide crônica (LMC, n=30) e em indivíduos saudáveis, atendidos na Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (FHHEMOAM). A tipificação de HLA foi realizada pela técnica multiplex com sondas únicas de oligonucleotídeos de sequências específicas para alelos e grupos alélicos (PCR-SSOP). Neste estudo, os alelos HLA mais frequentes ( 10%), tanto nos pacientes quanto nos controles, foram: A*02, A*24, A*31, B*15, B*35, DRB1*04 e DRB1*08. Além disso, os alelos HLA-B*39 (p=0,0246; OR=1,725; IC 95%=1,10-2,72) e HLA-B*44 (p=0,0069; OR=0,347; IC 95%=0,16-0,75) foram associados, respectivamente, à suscetibilidade e proteção para LLA, enquanto que o alelo HLA-A*03 (p=0,0559; OR=2,071; IC 95%=1,05-4,09) foi associado à suscetibilidade para LMA. Os resultados obtidos sugerem que alguns alelos HLA classe I têm participação relevante no desenvolvimento de LLA e LMA na população-alvo do estudo. Palavras-chave: leucemia, HLA, suscetibilidade, resistência.

8 ABSTRACT The development of leukemia is related to several factors such as genetic predisposition, exposure to chemical products and radiation. In Brazil, although a lot of research have been conducted on the impact of human leukocyte antigens (HLA) in a variety of diseases, there is still a huge gap of knowledge about the participation of HLA in leukemia. In this reality, this study aimed to investigate the frequency of HLA Class I (A and B) and II (DRB1) in 177 patients with acute lymphoblastic (ALL, n=105), acute myeloid (AML, n=42) and chronic myelogenous (CML, n=30) leukemia, and 1,200 healthy control subjects, all attended at the Hematology and Hemotherapy Hospital of Amazonas Foundation (FHHEMOAM). HLA typing was performed by multiplex polymerase chain reaction, based on sequence-specific oligonucleotide probes (PCR-SSOP). In all, the most frequently detected alleles ( 10%), both in patients and in controls, were A*02, A*24, A*31, B*15, B*35, DRB1*04 and DRB1*08. In addition, alleles HLA-B*39 (p=0.0246, OR=1.725, 95% CI=1.10 to 2.72) and HLA- B*44 (p=0.0069, OR=0.347; 95% CI=0.16 to 0.75) were associated, respectively, with susceptibility and protection for ALL, while HLA-A*03 (p=0.0559; OR=2.071; 95% CI=1.05 to 4.09) was associated with susceptibility to AML. The results suggest that specific HLA class I alleles have a relevant participation in the development of ALL and AML, within the target population of the study. Key-words: leukemia, HLA, susceptibility, resistance.

9 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Distribuição geográfica das taxas de incidência das leucemias segundo unidades da Federação Brasileira, a cada 100 mil habitantes para o ano de Figura 2. Distribuição das regiões HLA classes I, II e III ao longo do cromossomo 6 e respectivos lócus gênicos Figura 3. Estrutura da molécula HLA de classe I e classe II Figura 4. Procedimento técnico da etapa de hibridização

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Características dos pacientes com Leucemia (LLA, LMA e LMC) e do grupo controle Tabela 2. Frequência dos alelos de HLA-A*, em pacientes com Leucemia e suas diferentes formas clínicas (LLA, LMA e LMC) e nos controles Tabela 3. Frequência dos alelos de HLA-B*, em pacientes com Leucemia e suas diferentes formas clínicas (LLA, LMA e LMC) e nos controles Tabela 4. Frequência dos alelos de HLA-DRB1*, em pacientes com Leucemia e suas diferentes formas clínicas (LLA, LMA e LMC) e nos controles

11 LISTA DE QUADROS Quadro 1. Classificação das LLCs... 6 Quadro 2. Classificação da Organização Mundial de Saúde (2008) das LMAs Quadro 3. Classificação Franco-Americano-Britânica (FAB) das LMAs Quadro 4. Estudos em HLA, em pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) e em controles Quadro 5. Estudos de HLA em pacientes com Leucemia Mieloide Aguda (LMA) e em controles Quadro 6. Estudos de HLA em pacientes com Leucemia Mieloide Crônica (LMC) e em controles

12 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDAS BCR-ABL Translocação dos cromossomos 9 e 22 CEP CD DNA DVMO dntp EDTA EUA FAB-LMAs Comitê de Ética em Pesquisa Cluster of Differentiation Ácido Desoxirribonucleico Doador Voluntário de Medula Óssea Desoxirribonucleico Trifosfato Ácido Etileno Diamino Tetracético Estados Unidos da América Classificação Franco-Americano-Britânico das LMAs FHHEMOAM Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas HLA IMGT INCA kda KIR LLA LLC LMA LMC MHC mg ml NK OMS PCR PE RPM SAPE SSOP TCLE TCR TMO UEA UFAM Antígeno Leucocitário Humano International Immunogenetics Information System Instituto Nacional do Câncer Kilo Dalton Immunoglobulin-like receptor Leucemia Linfoblástica Aguda Leucemia Linfoblástica Crônica Leucemia Mielóide Aguda Leucemia Mielóide Crônica Complexo Maior de Histocompatibilidade Miligrama Mililitro Células Natural Killer Organização Mundial de Saúde Reação em Cadeia da Polimerase Ficoeritrina Rotação por minuto Estreptavidina Conjugada com R-ficoeritrina Sequência Específica de Sondas de Oligonucleotídeos Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Receptor de Célula T Transplante de Medula Óssea Universidade do Estado do Amazonas Universidade Federal do Amazonas

13 SUMÁRIO 1. INTRODUCÃO Tipos de Leucemias Leucemia Linfóides Leucemia Linfóide Aguda... 3 Linfoma não Hodgkin em fase leucêmica... 6 Linfoma de zona marginal esplênico/linfoma da zona marginal nodal Neoplasias Mieloides Leucemia Mieloide Aguda Leucemia Mieloide Crônica Epidemiologia das Leucemias no Brasil Complexo Principal de Histocompatibilidade Leucemias e HLA (Antígeno Leucocitário Humano) HLA e LLA: HLA e LMA: HLA e LMC: JUSTIFICATIVA OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODOS Modelo de Estudo Universo de Estudo População de Referência População de Estudo Critérios de inclusão e exclusão Procedimentos Coleta da amostra clínica Tipificação HLA Extração de DNA Amplificação de DNA Hibridização Interpretação de dados e análises estatísticas Considerações Éticas RESULTADOS Características gerais e clínicas da população estudada Identificação dos alelos HLA classe I e II nos pacientes com leucemias e controles saudáveis DISCUSSÃO Resultados gerais Frequência alélica e análise de associação nas leucemias Leucemia Linfóide Aguda (LLA) Leucemia Mieloide Aguda (LMA) Leucemia Mieloide Crônica (LMC) CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS... 55

14 1. INTRODUCÃO Historicamente, a leucemia foi originalmente evidenciada há mais de 200 anos por Peter Cullen, em um caso de esplenite aguda associada ao sangue leitoso (CULLEN, 1811). Alguns anos após, Alfred Velpeau (1827) observou pus nos vasos sanguíneos de um paciente, cujos sintomas eram característicos do que seria conhecida, futuramente, como a doença leucêmica. Contudo, o reconhecimento da leucemia como doença humana distinta somente ocorreu no ano de 1845, quando os pesquisadores Rudolf Virchow, na Alemanha, e John Bennett e David Craigie, na Escócia, descreveram a doença do sangue branco (VIRCHOW, 1845; BENNETT e CRAIGIE, 1845). Esta foi, posteriormente, denominada leucemia por Rudolf Virchow (1856), sendo este termo amplamente aceito pela comunidade científica e utilizado até a atualidade. As leucemias constituem o tipo mais comum de câncer em crianças e adolescentes, sendo representadas por um conjunto de doenças caracterizadas pela proliferação neoplásica das células brancas da medula óssea. Esta proliferação celular, por sua vez, interfere diretamente na hematopoiese, causando anormalidades no sangue periférico e, por vezes, infiltrando em tecidos não hematopoiéticos. Tais alterações acarretam, habitualmente, em sangramento, infecções e anemia, dentre outras complicações sistêmicas importantes (LORENZI, 2006). Nos Estados Unidos, estima-se que aproximadamente 13,9 indivíduos por 100 mil habitantes desenvolverão algum tipo de leucemia, com uma taxa de morte de 6,8 pacientes em cada 100 mil habitantes. Em números absolutos, esta estimativa equivale um total de novos casos (3% do total de casos de câncer) e mortes (4,1% do total de mortes por câncer), no ano de No Brasil, o levantamento epidemiológico mais recente indicou um total de novos casos e mortes, entre homens e mulheres (INCA, 2014). As leucemias podem ser classificadas em agudas ou crônicas, conforme a velocidade de evolução da doença, e em linfóide ou mieloide, dependendo da linhagem celular envolvida. Dentre os principais tipos de leucemia encontram-se: 1

15 leucemia linfóide aguda (LLA), leucemia linfóide crônica (LLC), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crônica (LMC) (BARION et al., 2007). Porém, salienta-se que as leucemias diferem não apenas quanto ao seu perfil citomorfológico, como também quanto aos aspectos clínicos, incluindo o quadro evolutivo e a resposta ao tratamento (ZAGO et al., 2013). Atualmente, a classificação das leucemias (bem como o seu diagnóstico e a avaliação das terapias) é realizada por uma abordagem multifacetada. De fato, ensaios imunofenotípicos, citogenéticos e de genética molecular vêm sendo gradativamente utilizados, contribuindo com informações adicionais aos métodos tradicionais e resultando em um aumento na confiabilidade do processo de classificação (HUTCHISON e DAVEY, 2008). Muito embora os mecanismos de origem das leucemias permaneçam, na maioria dos casos, desconhecidos, existem evidências de que alguns fatores possam estar associados ao risco para o desenvolvimento de variantes específicas desta doença. Dentre eles, podemos citar a predisposição genética, a exposição à radiação ionizante, o uso de medicamentos quimioterápicos e a exposição ocupacional a produtos químicos, como o benzeno (INCA, 2014). Dentre os genes já implicados como fatores de risco às leucemias, aqueles pertencentes ao grupo Antígeno Leucocitário Humano (HLA) - sistema altamente polimórfico e crucial durante a resposta imunológica tendo relevância em diversas populações do mundo (BARION et al, 2007). Nesse contexto, estudos de associação entre HLA e leucemias também têm sido conduzidos no Brasil, muito dos quais com resultados conflitantes, havendo necessidade de confirmá-los com pesquisas epidemiológicas complementares. Diante disto, descrevem-se os tipos de leucemias, alvos do presente estudo, incluindo suas características clínicas, critérios de classificação e diagnóstico. 1.1 Tipos de Leucemias Leucemia Linfóides 2

16 Compreendem neoplasias linfoblásticas que apresentam características clínicas e morfológicas bastante variáveis, originárias da proliferação de linfócitos das linhagens T, B ou natural killer (NK), em diferentes estágios de maturação (ZAGO et al., 2013). Deve-se considerar que as doenças proliferativas da linhagem linfoblástica também podem estar associadas a quadros clínicos agudos ou crônicos. As linfoproliferações agudas são denominadas leucemias linfóides agudas (LLA) e são caracterizadas pela elevada porcentagem de blastos linfóides ou linfoblastos (>20%) no sangue periférico e na medula óssea (LORENZI, 2006) Leucemia Linfóide Aguda Definição da LLA A leucemia linfóide aguda (LLA) é uma desordem maligna de células progenitoras linfoblásticas na medula óssea e outros órgãos, principalmente baço e fígado, afetando tanto crianças como os adultos acima de 60 anos. É mais comum em homens, com pico de prevalência entre as idades de 2 e 5 anos (PUI et al., 2004; PUI, ROBINSON e LOOK, 2008; SCHUMACHER et al., 2002). Atualmente, a taxa de cura (ausência de evidência de doença em 10 anos) é de 80% para crianças e 40% para adultos (PUI et al., 2004). A LLA é considerada a leucemia mais comum na infância, perfazendo 80% dos casos. Em contrapartida, é responsável por apenas 20% das leucemias agudas no adulto. Uma avaliação diagnóstica ampla e precisa é necessária para uma correta avaliação prognóstica, bem como para fundamentar as decisões terapêuticas. Ela pode ser alcançada com base na morfologia celular, citoquímica, imunofenotipagem e, cada vez mais, nas anormalidades citogenéticas e análise de expressão de genes híbridos resultantes de translocações (ZAGO et al., 2004). A etiologia da LLA encontra-se estreitamente relacionada a mutações genéticas secundárias a infecções, a ação de agentes físicos ou químicos 3

17 (radiações ionizantes, agentes quimioterápicos e o benzeno), sendo que uma pequena porcentagem dos casos (<5%) está associada a presença de alguma síndrome genética (Síndromes como de Down, de Bloom, de Nijmegen (PUI, ROBINSON e LOOK, 2008; CRANS e SAKAMOTO, 2001). Classificação da LLA A classificação da LLA baseia-se em critérios morfológicos, imunofenotípicos e citogenéticos, e tem como objetivo facilitar o diagnóstico, aumentar a reprodutibilidade entre os estudos, identificar fatores prognósticos favoráveis e desfavoráveis e permitir a detecção precoce da recaída da doença. Com esses critérios, é possível identificar diferentes subgrupos prognósticos e, consequentemente, utilizar abordagem terapêutica específica para cada um dos subgrupos (WHO, 2012). Em 2008, a Organização Mundial de Saúde (OMS) classificou as leucemias linfóides agudas (LLAs) foram subdivididas em duas categorias: Leucemia/linfoma linfoblástica T (LLLA-T) e Leucemia/linfoma linfoblástica B (LLLA-B). A Leucemia/linfoma linfoblástica B (LLLA-B) foi subdivida em duas subcategorias, também descrita por Swerdlow et al., 2008: 1. Leucemia/linfoma linfoblástica B associada a anormalidades genéticas recorrentes. 2. Leucemia/linfoma linfoblástica B não categorizada nos itens anteriores. Manifestações clínicas e Diagnóstico da LLA As manifestações clínicas na LLA decorrem do acúmulo das células anormais (blastos) na medula óssea impedindo a produção das células normais (hemácias, leucócitos e plaquetas), com a diminuição dos leucócitos (glóbulos brancos) propiciando o aparecimento de infecções; a diminuição do número de hemácias provoca anemia, e a redução da contagem de plaquetas ocasionam sangramentos. 4

18 Além de outras manifestações clínicas da LLA secundárias à proliferação excessiva das células imaturas da medula óssea (blastos), que infiltram os tecidos do organismo, tais como: amígdalas, linfonodos, pele, baço, rins, sistema nervoso central (SNC) e outros. Mostrando também os sinais e sintomas mais freqüentes como a febre, adenomegalias (aumento dos gânglios), manifestações hemorrágicas, palidez, esplenomegalia (aumento do baço) e hepatomegalia (aumento do fígado), fadiga, e dor óssea (BARBOSA; NAKAMURA; TERRERI, 2002; RODRIGUES; CAMARGO, 2003). O procedimento de diagnóstico da LLA é feito por meio de punção óssea realizada com agulha própria. Em seguida, os procedimentos de diagnóstico, que inclui o mielograma, com a análise morfológica complementada pelos exames de imunofenotipagem, citogenética e biologia molecular. Estas técnicas mais específicas e sensíveis para a classificação da leucemia, com fundamental importância para a escolha do esquema terapêutico (BRAGA; TONE; LOGGETTO, 2007) Leucemia Linfoide Crônica Definição da LLC A leucemia linfoide crônica (LLC) é constituído por um grupo heterogêneo de neoplasias formados em média por 12 diferentes patologias, tendo em comum à origem a partir de células linfoides maduras (periféricas), que apesar de infiltrarem os órgãos linfoides (gânglios linfáticos e baço), também estão presentes na medula óssea e no sangue periférico. Trata-se de uma neoplasia de célula B monomórfica de pequeno tamanho que usualmente expressam antígenos CD5 e CD23 na sua superfície (ZAGO et al., 2013). A Organização Mundial de Saúde (OMS) classifica a LLC entre as doenças linfoproliferativas crônicas de células B maduras, junto do linfoma de pequenos linfócitos (LPL). É uma leucemia freqüente nos países do Ocidente, entre a população de caucasóides, correspondendo entre 25 a 30% de todas as leucemias. 5

19 É mais comum no gênero masculino (2M:1F) e acomete indivíduos idosos (média de 68 anos no diagnóstico; sendo 90% dos casos >50 anos de idade (YAMAMOTO et al., in FIGUEIREDO et al., 2011). Existem questões a esclarecer em relação a etiologia da doença, como a incidência de LLC com a exposição à radiação ou a substâncias químicas (DIGHIERO; HAMBLIN, 2008). Classificação da LLC A classificação das LLCs segundo a linhagem celular de origem: células B, células T ou NK. Os critérios diagnósticos consideram as características morfológicas, imunofenotípicas, citogenéticas e as alterações moleculares, segundo a linhagem celular de origem (Quadro 1) (ZAGO et al., 2013). Células B Leucemia linfoide crônica Leucemia prolinfocítica Tricoleucemia Clássica Variante Linfoma não Hodgkin em fase leucêmica Linfoma de zona marginal esplênico/linfoma da zona marginal nodal Linfomas foliculares Linfoma linfoplasmocítico Linfoma de células do manto Outros Quadro 1. Classificação das LLCs Células T ou NK Leucemia prolinfocítica Clássica Variante de células pequenas Doenças linfoproliferativas de linfócitos granulares Células T Células NK Sindrome de Sézary Leucemia-Linfoma de célula T do adulto Linfomas T-periféricas Outros Fonte: Zago et al., 2013 Manifestações clínicas e Diagnóstico da LLC No diagnóstico a maioria dos pacientes com LLC é assintomática e a doença é detectada em exames de rotina, com os achados mais comuns: a linfoadenopatia generalizada, perda de peso e cansaço. Geralmente apresentam gânglios 6

20 pequenos, mas podem ser muito volumosos, mas ambas com consistência normal, sendo móveis e indolores. Na metade dos pacientes é detectada a presença de esplenomegalia sendo em geral não volumosa. Pode ocorrer a infiltração leucêmica em todas as partes do corpo incluindo as tonsilas, meninges e pele, com os sintomas e sinais de anemia presentes, mas raramente são intensos. Petéquias e equimoses são raras. Observam-se infecções bacterianas com frequente desenvolvimento de pneumonias (ZAGO et al., 2013). Geralmente o diagnóstico da LLC se dá pelas características morfológicas das células neoplásicas no sangue periférico e nos esfregaços de medula óssea, entretanto, a análise da morfologia da medula óssea, gânglios linfáticos e baço são indispensáveis para o diagnóstico. Como exame complementar, os estudos citogenéticos e de biologia molecular podem ser necessários para se estabelecer um correto diagnóstico (ZAGO et al., 2013). 1.2 Neoplasias Mieloides As neoplasias mieproliferativas clonais são resultantes da mutação de uma célula progenitora pluripotencial com capacidade, embora de maneira imperfeita, de diferenciação e maturação para cada uma das linhagens mieloides (ZAGO et al., 2013). As anomalias proliferativas podem manifestar-se desde o início da doença, encontrando-se no sangue um número elevado de células indiferenciadas, denominadas blastos mieloides, como acontece nas leucemias mieloides agudas (LMA), já nas leucemias mieloides crônicas (LMC) a proliferação dos granulócitos também é evidente, mas no sangue e na medula óssea são encontradas células maduras e há raras formas blásticas em circulação (LORENZI, 2006). 7

21 1.2.1 Leucemia Mieloide Aguda Definição da LMA A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma doença clonal do tecido hematopoiético caracterizada pela proliferação anormal de células progenitoras da linhagem mieloide, eritróide, células megacariocíticas e monocíticas, ocasionando produção insuficiente de células sanguíneas maduras normais (RUBNITZ, GIBSON e SMITH, 2008). A LMA representa cerca de 15-20% das leucemias agudas da infância e 90% das leucemias agudas que ocorrem entre os adultos. Na maioria dos casos, não há evidencia da influência de fatores genéticos e raciais, ao contrário da LLA (ZAGO et al., 2013). Alguns fatores de risco para o desenvolvimento desse tipo de leucemia são: uso frequente de tabaco, tratamento prévio com quimioterápicos ou radioterapia e desordens sanguíneas como a síndrome mielodisplásica (McKENZIE, 2005). Classificação da LMA Em 2008, a Organização Mundial de Saúde (OMS) publicou a classificação das LMAs, na qual é destacada a importância das alterações citogenéticas e moleculares nos algorítimos para o diagnóstico, resposta ao tratamento e sobrevida. Nessa classificação, são listadas 07 (sete) categorias principais que, por sua vez, são divididas em subcategorias (Quadro 2) (VARDIMAN et al., 2009; ZAGO et al., 2013). 8

22 Quadro 2. Classificação da Organização Mundial de Saúde (2008) das LMAs. Características Leucemia mieloide aguda com anormalidades genéticas recorrentes: LMA com t (8; 21) (q22, q22), RUNX1-RUNX1T1 LMA com inv (16) (p13.1q22) ou t (16, 16) (P13.1; p22); CBFB-MYH11 Leucemia promielocítica aguda, com t (15, 17) (q22, q12); PML-RARA LMA com t (9; 11) (p22, q23) MLLT3-MLL LMA com t (6:09) (p23, q34); DEK-NUP214 LMA com inv (3) (q21q26.2) ou t (3,3) (q21; q26.2); RPN1-EVl1 LMA (megacarioblástica) com t (1:22) (p13, q13); RBM15-MKL1 LMA com NPM1 mutado LMA com CEBPA mutado Leucemia mieloide aguda com alterações relacionadas à mielodisplasias Neoplasias mieloides relacionadas à terapia Leucemia mieloide aguda não especificada nos itens anteriores: LMA com diferenciação mínima LMA sem maturação LMA com maturação Leucemia mielomonocítica aguda Leucemia monocítica e monoblástica aguda Leucemia eritróide aguda Leucemia megacarioblástica aguda Leucemia a basófilos aguda Panmielose aguda com mielofibrose Sarcoma mieloide Proliferações mieloides relacionadas à Sindrome de Down Mielopoiese anormal transitória Leucemia mieloide associada com a síndrome de Down Neoplasia blástica de células dendríticas plasmocitóides Fonte: Zago et al., 2013 (Adaptado de VARDIMAN et al., 2009). 9

23 A classificação Franco-Americano-Britânica (FAB) das LMAs (subtipos) tem como base as características morfológicas e citoquímicas, para a determinação da linhagem e do grau de maturação das células blásticas. A LMA apresenta-se com uma variedade de tipos de células que podem ser observados no sangue periférico e na medula óssea (Quadro 3) (HAMERSCHLAK, 2008; ZAGO et al., 2013). Quadro 3. Classificação Franco-Americano-Britânica (FAB) das LMAs. Subtipos de LMA Características M0 M1 LMA sem diferenciação morfológica LMA com mínima diferenciação morfológica M2 LMA com diferenciação (componente monocítico < 20%) M3 LMA promielocítica hipergranular LMA variante hipogranular M4 LMA mielomonocítica (células monocíticas 20%) M5 LMA monocítica (com células monocíticas 20% das células leucémicas) M5a LMA monoblástica (sem diferenciação, blastos 80%) M5b LMA monocítica (com diferenciação, blastos < 80%) M6 M7 Eritroleucemia LMA megacarioblástica Fonte: Zago et al., 2013 (Adaptado de VARDIMAN et al., 2009). Manifestações clínicas e Diagnóstico da LMA Na sua totalidade os casos, o diagnóstico de LMA inicia-se a partir de uma suspeita clínica com características que incluem: palidez, hepatomegalia, esplenomegalia, linfadenopatia, febre em consequência de infecções, faringite, petéquias e outras manifestações hemorrágicas, dor óssea, hipertrofia gengival, lesões cutâneas. No Geral, os exames de laboratório apresentam no hemograma a contagem de plaquetas e hemoglobinas baixas, contagem de leucócitos com variação de <1.000/μL a /μL, contagem diferencial de células brancas anormais com neutropenia e presença de blastos, anemia normocrômica e normocítica, trombocitopenia podendo ser severa, baseando-se na avaliação do sangue periférico e da medula óssea (BAIN, 2003). 10

24 1.2.2 Leucemia Mieloide Crônica Definição da LMC A leucemia mieloide crônica (LMC) é uma doença maligna de expansão clonal da célula progenitora hematopoiética que ocorre principalmente na quarta e quinta décadas de vida. A existência da translocação em 90% dos pacientes pode ser facilmente diagnosticada por cariotipagem. Esta alteração da translocação de t (9;22) (q34;q11) resulta na formação do cromossomo Philadelphia (cromossomo Ph ou Ph + ). Dois genes fundidos (BCR e ABL) codificam a proteína de fusão P210 com uma elevada atividade tirosino-quinase que tem um papel importante na patogenia da LMC (AMIRZARGAR et al., 2007). A LMC era fatal na década de 1980, apresentando sobrevida média de 48 meses. Porém, o surgimento das técnicas de transplante de medula óssea (TMO) permitiu que alguns doentes atingissem a cura. Atualmente, o uso da terapia molecular com a inibição da proteína tirosino-quinase tem promovido um prolongamento importante da sobrevida dos pacientes (CHAUFFAILLE, 2010). A incidência da LMC é de um a dois casos para cada 100 mil habitantes por ano, representando cerca de 15% de todas as leucemias. Achados mostram que a mediana de idade ao diagnóstico é de 55 a 60 anos, com menos de 10% dos casos em pacientes com menos de 20 anos (TEFFERI et al., 2005). Ultimamente, houve a diminuição do número de indivíduos acometidos com idade superior a 60 anos, o que se sugere que muitos dos relatos da literatura sejam de estudos clínicos que excluíram os pacientes mais idosos (BORTOLHEIRO e CHIATONE, 2008). Classificação da LMC A classificação da LMC é de acordo com os exames clínicos e de laboratório definindo em fases: fases inicial crônica, acelerada duradoura e final aguda. Na última fase, pode ocorrer a crise blástica, sendo esta considerada a mais grave (DOBBIN e GADELHA, 2002; LOPES e ABREU, 2009). 11

25 Manifestações clínicas e Diagnóstico da LMC A LMC é inicialmente de progressão lenta; sendo assim, a especificidade do tratamento para estes pacientes é importante, uma vez que esta doença pode evoluir para as fases acelerada e aguda, arriscando a vida do paciente (LOPES e ABREU, 2009). De acordo o protocolo de condutas do Instituto Nacional do Câncer (INCA, 2002), a evolução clínica da LMC apresenta as seguintes fases, podendo ser o diagnóstico dado em qualquer uma delas: Na fase crônica da LMC, com duração mediana entre 3 a 5 anos, as manifestações clínicas incluem sintomas constitucionais como fadiga, perda de peso, sudorese, febre e os achados ao exame clínico de palidez e esplenomegalia, sendo que a intensidade das manifestações clínicas depende do volume da doença existente. Os exames de laboratório apresentam leucocitose que é caracterizada por marcada hiperplasia medular e capacidade de maturação das células mieloides. A fase acelerada da LMC tem duração de alguns meses e caracteriza-se por resistência terapêutica citorredutora, aumento da esplenomegalia, basofilia e número de células blásticas, trombocitose ou trombocitopenia, mielofibrose, sendo que nessa fase os pacientes podem ser assintomáticos ou pode apresentar febre, sudorese noturna, perda de peso e dores ósseas, o paciente é resistente à terapia medicamentosa, tendo por características a evolução clonal citogenética e, no sangue periférico, 15% de blastos, 30% de blastos e pró-mielócitos, 20% de basófilos e, não relacionado à quimioterapia, < plaquetas/mm 3. Finalmente, na fase blástica da LMC é comum a presença de febre, sudorese noturna, anorexia, perda de peso e dores ósseas. Trata-se de uma fase agressiva, com quadro clínico da leucemia aguda e permitindo ao doente uma sobrevida muito curta com expectativa de sobrevida sem tratamento é de 3 a 6 meses após o início da crise blástica, caracterizada por 30% de blastos no sangue periférico ou na medula óssea, seja por infiltrado extramedular de células blásticas. 12

26 1.3. Epidemiologia das Leucemias no Brasil Assim como ocorre em vários países desenvolvidos, não se conhece o número real de casos novos de câncer diagnosticados a cada ano pelos serviços de saúde no Brasil, devido à ausência de um sistema de registro que cubra todo o território nacional (LEITE, 2012). Em relação aos registros brasileiros, as estimativas anuais de incidência continuam apresentando grande importância, pois, de acordo com dados do Instituto Nacional do Câncer, para o ano de 2014, foram estimados casos novos de leucemia em homens e em mulheres que corresponderiam a um risco de 5 casos novos/100 mil homens e 4/100 mil mulheres (Figura 1) (INCA, 2014). Segundo os dados do mesmo Instituto, na região Norte, a leucemia em homens é a quinta neoplasia mais freqüente (3 casos/100 mil habitantes) e o sétimo mais frequente em mulheres (2 casos/100 habitantes), excluindo-se os casos de tumores da pele não-melanoma. No Estado do Amazonas, foi estimada uma taxa bruta de 3,65 casos em 100 mil homens e 2,31 casos em 100 mil mulheres (INCA, 2014). Figura 1. Distribuição geográfica das taxas de incidência das leucemias segundo unidades da Federação Brasileira, a cada 100 mil habitantes para o ano de Fonte: MS/INCA,

27 1.4 Complexo Principal de Histocompatibilidade O Complexo Principal de Histocompatibilidade ou Major Histocompatibility Complex (MHC) representa o conjunto de genes responsável por codificar as moléculas de histocompatibilidade em uma determinada espécie, sendo chamado no ser humano de sistema Antígeno Leucocitário Humano Human Leukocyte Antigen (HLA), o qual é controlado por genes do braço curto do cromossomo seis (6p.21.3) e apresenta um número excepcionalmente grande de genes, os quais são agrupados em três regiões (SHANKARKUMAR, 2004). Os genes do sistema HLA são altamente polimórficos, isto é, possuem alta variabilidade alélica. A maioria dos genes do HLA codificam proteínas envolvidas no sistema Imune ( O HLA pode ser dividido em três classes: I, II e III, sendo que os de classes I e II estão diretamente envolvidos na apresentação de peptídeos aos linfócitos T. Além disso, as moléculas de HLA apresentam diferenças estruturais e funcionais importantes. A distribuição e organização dos genes de HLA, no braço curto do cromossomo 6, podem ser observadas na Figura 2 (KLEIN e SATO, 2000). A molécula de HLA classe I é formada por duas cadeias polipeptídicas ligadas não-covalentemente: a cadeia mais pesada, de 44 kda a 47 kda, e a cadeia 2 - microglobulina de 12 kda (Figura 3). Somente a cadeia é transmembrana. O HLA de classe I está presente na maioria das células somáticas, embora o nível de expressão dessas moléculas possa ser diferente dependendo do tecido. A molécula de HLA classe I participa do processo de apresentação de antígenos citosólicos aos linfócitos T citotóxicos (CD8) (KLEIN e SATO, 2000). A molécula de HLA classe II é composta por duas cadeias polipeptídicas ligadas não covalentemente, a cadeia de 32 kda a 34 kda e a cadeia de 29 a 32 kda, sendo que as duas apresentam domínios transmembrana (Figura 3). O HLA classe II, normalmente está presente na superfície de células que incluem: células dendríticas, macrófagos, linfócitos B, linfócitos T ativados e células do epitélio tímico, 14

28 sendo que as três primeiras células atuam como apresentadoras de antígenos endocíticos aos linfócitos T helper (CD4) (KLEIN e SATO, 2000). Figura 2. Distribuição das regiões HLA classes I, II e III ao longo do cromossomo 6 e respectivos lócus gênicos. Fonte: Klein e Sato, Figura 3. Estrutura da molécula HLA de classe I e classe II. Fonte: Klein e Sato,

29 Conforme a última estatística realizada pelo Banco de Dados do projeto Internacional em Imunogenética (IMGT/HLA) em colaboração com o European Bioinformatics Institute, mais de variantes alélicas já foram identificadas até o momento nestes múltiplos loci MHC humanos (HLAs), incluindo cerca de de classe I e de classe II (IMGT/HLA Database). A variabilidade observada nos genes HLA, que cresce continuamente pela descoberta de novos alelos, têm como resultante a codificação de proteínas que diferem umas das outras em um ou mais resíduos de aminoácidos, resultando em funcionalidades distintas com implicações diretas na dinâmica do sistema imunológico como, por exemplo, na compatibilidade doador-receptor nos transplantes heterólogos de órgãos (VOLTARELLI, PASQUINI e ORTEGA, 2009). 1.5 Leucemias e HLA (Antígeno Leucocitário Humano) As leucemias fazem parte de um grupo importante de doenças hematopoiéticas que, apesar de constituírem alvo de diversos estudos científicos, ainda exigem investigações complementares, para se elucidarem aos seus verdadeiros mecanismos etiológicos. Dentre estes estudos, os imunogenéticos têm obtido especial atenção, uma vez que a interação entre as moléculas do sistema imune e as células neoplásicas pode ter um papel importante na gênese destas enfermidades (BARION et al, 2007). Pelo fato dos genes do sistema HLA serem altamente polimórficos, análises das associações entre estes e as diferentes variantes de leucemia, em diferentes raças ou grupos étnicos, são especialmente importantes, na medida em que possibilitam uma definição mais clara quanto à distribuição da doença na população humana, possibilitando, também, o estabelecimento abordagens terapêuticas mais específicas no futuro a médio prazo (GHODKE et al., 2005). A vigilância imunológica contra as células tumorais depende do reconhecimento de antígenos, no contexto do HLA classe I, por linfócitos T citotóxicos via receptor da célula T (TCR) e por células Natural Killer (NK), via receptores KIR (immunoglobulin-like receptor). Ademais, sabe-se que, para 16

30 respostas envolvendo ação de células T helper, são necessárias as moléculas de HLA classe II (GUILLAUME e MAROLLEAU, 2013). Assim, não se descarta a possibilidade de os genes HLA classe I e II estarem diretamente envolvidos no desenvolvimento das leucemias HLA e LLA: Em estudos realizados sobre LLA, no período de 1996 a 2011 (Quadro 4), três associaram HLA-DRB1*04 ao desenvolvimento das leucemias. Em contrapartida, em dois outros estudos, HLA-DRB1*13 foi associado à proteção à doença. Esses dois alelos pertencem ao HLA classe II e, certamente, respostas imunológicas envolvendo apresentação de peptídeos (próprios ou não) aos linfócitos T devem participar na regulação da doença, tanto para um maior risco à LLA, como para proteção à mesma. Barion et al. (2007) conduziram uma investigação em uma população brasileira de etnia mista, a partir da qual foi possível observar os alelos HLA classe I HLA-B*45 e HLA-B*56 em associação à LLA (Quadro 4). Similarmente, Fernandes et al. (2010) desenvolveram estudo, em indivíduos brasileiros, constituído por pacientes com leucemias agudas. Os autores sugeriram que o alelo HLA-DRB1*07 confere suscetibilidade à LMA e HLA-DRB1*03, à LLA, e o alelo HLA-DRB1*04 confere proteção à LLA. Os mesmos alelos HLA de classe I também foram associados positivamente à LLA e LMA, no trabalho realizado por Mundhada et al. (2004), numa população mista dos EUA. Orgad et al. (1988), em estudo com crianças judias diagnosticadas com LLA, sugeriu a existência de possível associação entre antígenos HLA e leucemia, a partir da observação de frequências mais elevadas de HLA-A30 em pacientes doentes, sugerindo suscetibilidade, e mais baixas de HLA-B14, sugerindo proteção à LLA. NG et al. (2006), em um estudo em crianças chinesas, encontrou uma correlação significativa entre os antígenos HLA e LLA, onde HLA-A33 (p=0,006) e HLA-B17 (p<0,001) apresentaram correlação estreita com a presença de leucocitose elevada. Similarmente, Gao et al. (2005) demonstraram que os alelos HLA-A*26, 17

31 B*56 e DRB1*09 parecem contribuir para a suscetibilidade genética à LLA. No entanto, os alelos HLA-A*30, A*33 e B*58 parecem ter papel protetor. Luo et al. (2008), em estudo na população de uma província chinesa, com leucemias (LMC e LLA) na população chinesa de Han na província de Hunan, observaram que os alelos HLA-B*58, DRB1*12, DRB1*14 parecem contribuir para a suscetibilidade genética de pacientes com LMC, enquanto que HLA-B*58 pode estar associado à suscetibilidade genética à LLA. Tais resultados corroboram os de Wang et al. (2009), no qual se evidenciou o alelo HLA-DRB1*15 como um dos fatores de risco à LLA em crianças chinesas. Quadro 4. Estudos em HLA, em pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) e em controles. Autor (es) Ano Local Alelo HLA Caso (n) Controle (n) Dorak et al País de Gales P Valor DRB1*04 47/114 96/325 0,029 Dorak et al Turquia DRB1*04 41/86 a 13/57 a 0,003 DRB1*13 11/86 a 18/57 a 0,010 Barion et al Brasil B*45 c 3/35 72/ ,020 b B*56 c 1/35 20/ ,030 b Fernandes et al Brasil DRB1*03 6/15 13/100 0,008 Ozdilli et al Turquia A*23 18/110 8/100 0,050 B*07 6/110 14/100 0,035 DRB1*04 38/110 20/100 0,019 Uçar et al Turquia A*11 18/103 29/360 0,010 a Análise de pacientes portadores de LLA somente do sexo masculino. b HLA associado à proteção à LLA. c Análise estatística corrigida pelo número de antígenos testados. DRB1*01 20/103 27/360 0,001 DRB1*13 19/ /360 0, HLA e LMA: Nos estudos sobre LMA, os alelos HLA associados à doença foram distintos em cada população (Quadro 5) e dois deles, HLA-B*07 e HLA-DRB1*11, que haviam sido associados à suscetibilidade à LMA, apresentaram evidências de 18

32 proteção à LLA (Quadro 4) e observada em outros estudos com leucemia. A identificação dos subtipos desses alelos seria fundamental para que fosse possível conhecer o alelo específico associado às condições de risco e proteção, bem como o papel dos mesmos na imunobiologia das leucemias. Sarafnejad et al. (2006) estudaram as freqüências alélicas HLA classe II em pacientes LMA iranianos, observando uma associação positiva significativa entre a doença e o alelo HLA-DRB1*11 (p=0,033). Sugere-se, portanto, que este constitui um fator de predisposição genética à doença. Por outro lado, o alelo HLA-DRB4 mostrouse significativamente diminuídos nos pacientes, sugerindo conferir proteção à mesma. O alelo HLA-B*07 foi previamente associado à suscetibilidade a LMA em uma população do Brasil de etnia mista (BARION et al., 2007). Ainda neste contexto, outros genes investigados, e que devem estar envolvidos diretamente ao HLA, são os genes que codificam para o KIR (immunoglobulin-like receptor), presentes em células NK, os quais também são altamente polimórficos (BABOR et al., 2013). Estas células possuem fundamental papel no combate às células neoplásicas (ABBAS, LICHTMAN e PILLAI, 2012). No entanto, tem sido demonstrado que a ação das células NK no sangue periférico de pacientes com leucemias é significativamente reduzida (COSTELLO et al., 2002; FAURIAT et al., 2007; BABOR et al., 2013). Uma das explicações seria o aumento expressivo das moléculas de MHC de classe I nas células blásticas leucêmicas, ou a reduzida expressão dos receptores ativadores nas células NK (NOWBAKHT et al., 2005). 19

33 Quadro 5. Estudos de HLA em pacientes com Leucemia Mieloide Aguda (LMA) e em controles. Autor (es) Ano Local Alelo HLA Caso (n) Controle (n) P Valor Barion et al Brasil B*07 12/50 286/2472 0,01 a Khosravi et al Irã DRB1*11 42/120 88/360 0,033 Fernandes et al Brasil DRB1*07 13/30 20/100 0,01 Ozdilli et al Turquia A*11 b 4/90 14/100 0,027 B*11 b 2/90 10/100 0,036 B*49 12/90 5/100 0,044 DRB1*15 23/90 13/100 0,027 Uçar et al Turquia A*03 42/268 74/720 0,019 B*51 52/268 82/720 0,001 a Os autores utilizaram probabilidade corrigida pelo número de antígenos testados. b HLA associado a proteção. c Valor P corrigido HLA e LMC: Na LMC, o HLA-DRB1*04 foi associado à doença (Quadro 6), assim como observado na LLA em três populações investigadas (Quadro 4). No entanto, o subtipo HLA-DRB1*0405 foi mais frequente nos controles, sendo associado à proteção a LMC (Quadro 5). Estes resultados podem ser atribuídos às diferenças nas frequências desses alelos de HLA-DRB1*04 em populações distintas e pelo fato deste HLA ter mais de 200 subtipos já descritos no mundo (IMGT/HLA Database). Estudos de frequência dos alelos HLA têm demonstrado que o HLA-DRB1*04 está entre os mais frequentes na população brasileira (VISENTAINER et al., 1997; MONTE et al., 2004; BARION et al., 2007). Da mesma forma, em levantamento realizado por Sacramento et al. (2011) em candidatos a doadores de medula óssea, identificou-se que HLA-DRB1*04 está entre os alelos mais frequentes na população residente no Estado do Amazonas. Outro alelo frequente em pacientes LMC na população brasileira é HLA-B*45 (Quadro 5), que também apresentou resultados significativos de associação à LLA, com os valores de probabilidade corrigidos (Quadro 3). 20

34 O número avaliado de pacientes com a presença do HLA-B*45 foi muito pequeno, sugerindo a necessidade de estudos adicionais com a inclusão de mais casos para confirmar os resultados. Por outro lado, o alelo HLA-B*45 está entre aqueles com frequência menor que 1% (SACRAMENTO et al., 2011). Quadro 6. Estudos de HLA em pacientes com Leucemia Mieloide Crônica (LMC) e em controles. Autores Ano Local Alelo HLA Caso (n) Controle (n) P Valor Yasukawa et al Japão DRB1*0405 b 6/50 40/127 0,005 Rosas-Cabral et al México DRB1*14 2/63 2/746 0,03 DRB1*03 13/63 62/746 0,000 Oguz et al Turquia B*35 b 45/169 86/213 <0,01 B*37 12/169 3/213 <0,01 DRB1*11 b 62/ /213 <0,05 Barion et al Brasil B*45 7/78 72/2472 0,01 a DRB1*04 30/77 562/2472 0,002 a DRB1*08 16/77 247/2472 0,004 a a Os autores utilizaram probabilidade corrigida pelo número de antígenos testados. b HLA associado à proteção. Chhaya et al. (2006) investigou pacientes indianos diagnosticados clinicamente com LMC com idade entre 17 a 54 anos e revelou que os indivíduos que expressam HLA-A3, -B8, -DR4 tem risco diminuído para o desenvolvimento de LMC, em populações caucasianas. Na distribuição dos antígenos HLA de classe I, as diferenças para o HLA-A11 (p(c)=0,351) e DRB1*13 (p(c)=0,403) não permaneceram significativas após a aplicação de um fator de correção para o valor p. Estes resultados sugerem que o desenvolvimento de LMC está aparentemente associada a fenótipos HLA específicos para cada população. Num estudo incluindo a população canadense, os pesquisadores Naugler e Liwski (2009), investigaram a associação dos alelos HLA em pacientes com LMC e concluíram que HLA-B*13 (OR=4,92), HLA-B*55 (OR=4,50) e HLA-DRB1*16 (OR=4,07) eram marcadores de risco para a doença. Não se observou, contudo, quaisquer alelos associados à proteção. 21

35 Um estudo realizado por Wang et al. (2014), na população chinesa, mostrou relevante associação entre HLA e leucemias. Para tanto, avaliaram as categorias clinicas de leucemias, incluindo LLA, LMA, LMC e observaram relação negativa entre LLA e DRB1*09, o que pode desempenhar um papel importante por uma resposta imunitária de células T restrita na gênese da leucemia, ao passo que a relação positiva entre LMC e HLA-B*18 sugere não ativar antígenos específicos presentes na leucemia resultando em escape imunológico. Em outra investigação, sugerindo que determinados alelos HLA podem estar associados com a patogênese da LMC na população chinesa, os pesquisadores Zhang et al. (2011) demonstraram que os alelos HLA-A*11, A*74, B*40, B*47, B*55 e B*81 foram correlacionados com o risco crescente de LMC, porém o alelo DRB1*13 confere proteção genética à doença. 1.6 Registros de doadores e receptores de Medula óssea no Brasil A existência dos Bancos de registros de doadores e receptores no Brasil tem sua grande importância para busca de doadores compatíveis com receptores para o Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (TCTH), para isso criou-se em 1993, o Registro Nacional de Doadores de Medula Óssea (REDOME/SP), e em 1999 no INCA/RJ, ampliou-se a aplicação de recursos específicos na busca de doadores não aparentados de medula óssea que não possuía doador compatível na família. De acordo com o INCA, existem mais de milhões de doadores cadastrados, classificando o Redome como o terceiro maior banco público de doadores de medula óssea do mundo, reunindo todos os dados dos voluntários à doação para pacientes que não possuem um doador na família (INCA, 2014).. No Redome incluem-se 300 mil novos doadores/ano, onde a probabilidade de se identificar um doador aumenta se o doador e o paciente possuem a mesma origem étnica ou racial, para isso o INCA criou o Registro Nacional de Receptores de Medula Óssea (REREME), a fim de organizar o cadastro de pacientes, para os quais a única alternativa de cura da doença imuno-hematológicas para o TCTH (INCA, 2014). 22

36 2. JUSTIFICATIVA No Estado do Amazonas há poucos registros de investigação científica sobre as leucemias, principalmente, no que se refere aos aspectos imunológicos da doença. Neste aspecto, a proposta de realizar um estudo sobre a frequência dos Antígenos Leucocitários Humanos (HLA) nos pacientes com leucemias, foi considerada relevante, nas quais foi estimulada pelas evidências científicas nacionais e internacionais sobre os estudos com peptídeos ligantes as moléculas do HLA e que podem estar diretamente ou indiretamente associadas ao desenvolvimento das leucemias. Neste contexto, decidiu-se investigar a frequência dos alelos HLA classe I (A e B) e classe II (DRB1) nas leucemias (LLA, LMA e LMC), em pacientes atendidos na Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas. O estudo visa, em última instância, contribuir para a identificação dos marcadores imunogenéticos que possam estar associados às leucemias, além de investigar o perfil dos alelos HLA em doadores de sangue/medula óssea saudáveis na população amazonense, possibilitando um melhor entendimento dos fatores envolvidos na imunobiologia das leucemias. 23