Estudo de Inativação Microbiana por Radiação Gama em Morangos Frescos

Transcrição

1 333 Estudo de Inativação Microbiana por Radiação Gama em Morangos Frescos Instituto Superior Técnico / Campus Tecnológico e Nuclear Ciência Viva no Laboratório - Ocupação Científica de Jovens nas Férias Formadora: Mestre Telma Silva Ana Raquel Saramago Ana Teresa Ferreira Sara Isabel Gomes Agosto de 2013 Página 1

2 Índice Estudo de Inativação Microbiana por Radiação Gama em Morangos Frescos I. Objetivos... 3 II. Introdução teórica... 4 III. Desenvolvimento Experimental... 6 DIA 1 22 de julho de »Preparação de soro fisiológico a 0,9% e soro fisiológico com Tween... 6»Preparação do meio de cultura... 6 DIA 2 23 de julho de »Validação do técnico de microbiologia... 8 DIA 3 24 de julho de »Preparação das amostras para irradiação... 9»Determinação da contaminação inicial e do número de sobreviventes DIA 4 25 de julho de »Leitura dos dosímetros... 13»Teste sensorial DIA 5 26 de julho de »Preparação de soro fisiológico a 0,9% com Tween DIA 6 29 de julho de »Determinação da contaminação inicial e do número de sobreviventes... 14»Preparação do álcool utilizado para desinfetar mãos e material DIA 7 30 de julho de »Caracterização de microrganismos a nível macroscópico DIA 8 31 de julho de »Isolamento dos microrganismos para caracterização a nível microscópico DIA 9 01 de agosto de »Caracterização dos microrganismos a nível microscópico IV. Resultados Experimentais e Respetiva Análise V. Conclusão VI. Bibliografia Página 2

3 I. Objetivos Este estágio tem como objetivos dar a conhecer o modo de trabalho em condições de assepsia, avaliar a inativação da flora microbiana presente em morangos frescos, após o seu tratamento a doses sub-letais de radiação gama (fonte de cobalto-60) bem como o aumento do seu tempo de prateleira e estudar tratamentos alternativos à lavagem (simples ou com desinfetantes) que garantam a segurança e qualidade dos alimentos antes da sua comercialização, pois este método apresenta pouca eficácia na eliminação de microrganismos de deterioração e patogénicos, responsáveis por surtos de toxinfeções bacterianas e/ou virais. Figura 1 Embalagem com morangos utilizados neste trabalho experimental Página 3

4 II. Introdução teórica Foi estudado o efeito da radiação gama na inativação dos microrganismos presentes nos morangos frescos. Os morangos são uma fonte de vitaminas, minerais e antioxidantes naturais necessários ao bom funcionamento do organismo humano, mas devido à elevada atividade microbiana e respiratória o seu tempo de prateleira é reduzido. O tratamento com radiação gama é considerado um meio de aumentar a vidade prateleira dos mais variados alimentos, pois a excitação e ionização das moléculas gera radicais livres, que provocam reações químicas que afetam as funções estruturais e metabólicas das células, podendo retardar o abrolhamento e amadurecimento, inativar microrganismos e destruir parasitas e pragas, reduzindo o número de microrganismos de deterioração e patogénicos neles presentes. A radiação é a propagação da energia proveniente de uma fonte natural ou artificial através de ondas eletromagnéticas (campos elétricos e magnéticos oscilantes, perpendiculares entre si e à direção de propagação) e que têm a capacidade de penetrar em diversos materiais e em diferentes escalas. Embora a maioria dos elementos que ocorrem naturalmente sejam isótopos estáveis (ou seja, não se decompõem espontaneamente num nuclídeo), há também alguns núcleos que são radioativos, o que quer dizer que emitem espontaneamente pequenas partículas e radiação eletromagnética de energia elevada, originando núcleos mais estáveis, fenómeno ao qual chamamos radioatividade. Os três tipos de emissão mais conhecidos são as partículas alfa (núcleos de hélio), as partículas beta (eletrões de elevada energia) e os raios gama (forma de radiação eletromagnética de elevada energia e frequência, baixo comprimento de onda e grande poder de penetração). A radiação classifica-se em ionizante e não ionizante. A radiação ionizante é aquela que tem a capacidade de ionizar a matéria que atinge, sendo a não ionizante aquela que não possui essa capacidade. A radiação ionizante, provém de átomos instáveis que para atingirem a estabilidade libertam a energia em excesso sob a forma de radiação. Existem 3 fontes de radiação ionizante, os raios X, os feixes de eletrões e as fontes radioativas (cobalto-60 ou césio-37). Em vários países utiliza-se a irradiação de alimentos como meio de inativar os microrganismos neles presentes, uma vez que o objetivo é semelhante ao tratamento por temperatura, como a pasteurização. Esta técnica consiste na exposição do alimento a uma determinada dose de radiação, tornando-o mais seguro para consumo e até mesmo para a saúde pública. O seu valor nutricional é muito pouco afetado não sofrendo alterações significativas. Geralmente para este processo são utilizadas fontes radioativas de cobalto-60, pois como não são radioativas não ativam a amostra em estudo, pelo que os alimentos Página 4

5 não ficam radioativos e não produzem nenhum efeito adverso para o ser humano. A avaliação dos aspetos toxicológicos e genéticos não demonstrou nenhuma evidência direta de atividade cancerígena ou toxicidade a nível genético. A interação da radiação com o alimento tem como objetivo inativar a população microbiana presente, através da interrupção da divisão celular. Deste modo aquando da absorção da radiação, os microrganismos sofrem danos biológicos que podem ser devidos a dois tipos de efeitos, diretos ou indiretos. Estes efeitos distinguem-se pelo local onde é depositada a radiação. Os efeitos diretos são caracterizados pela interação direta da radiação com a estrutura do ADN (ácido desoxirribonucleico) da célula, enquanto os efeitos indiretos estão relacionados com a formação de radicais livres resultantes da radiólise da água. Esses radicais, quando entram em contacto com as estruturas biológicas causam danos irreversíveis pois são altamente radioativos. Dependendo das suas estruturas químicas e físicas, da radiossensibilidade das células e da sua capacidade de reparar os danos causados, os microrganismos apresentam diferentes níveis de resistência à radiação. Pode descrever-se este fator pelo valor que corresponde à dose necessária a aplicar num produto para inativar cerca de 90% da população microbiana aí presente, sendo por isso a dose de radiação aplicada variável consoante o tipo de alimento e o resultado final que se pretende atingir. Há vários processos de tratamento de alimentos através de radiação e consoante a dose aplicada e o objetivo final estes são denominados radurização (quando o objetivo é a desinfestação de insetos, a inativação de parasitas e o retardamento da maturação, sendo a dose aplicada inferior a 1 kgy), radiciação (quando o objetivo é a redução do número de microrganismos responsáveis pela deterioração dos alimentos e a inativação dos microrganismos potencialmente patogénicos, sendo a dose aplicada de 1 a 10 kgy) e radapertização, (quando o objetivo é a redução do número total de microrganismos para garantir a esterilização, sendo a dose aplicada superior a 10 kgy). A irradiação de alimentos é um processo que já é aplicado a nível comercial em mais de 60 países devido às suas inúmeras vantagens, de entre as quais salientamos que os alimentos podem ser irradiados já na sua embalagem final, pelo que o risco de recontaminação é baixo; este processo permite ainda aumentar a validade ou tempo de vida útil de certos alimentos bem como tornálos mais seguros sem induzir radioatividade no alimento; o valor nutricional, tal como anteriormente se referiu, não sofre alterações significativas; verifica-se um decréscimo no desperdício de alimentos; o elevado poder de penetração da radiação permite irradiar vários tamanhos e formas bem como alcançar não só os organismos na superfície mas em toda a amostra, garantindo total eficácia do processo; é um tratamento seguro, limpo, eficiente e de baixo custo que preserva o alimento não produzindo nenhum efeito adverso para o ser humano. Página 5

6 III. Desenvolvimento Experimental DIA 1 22 de julho de 2013»Preparação de soro fisiológico a 0,9% e soro fisiológico (0,9%) com Tween 80 (0,1%) Materiais e Reagentes: Equipamento: Espátula Gobelé Proveta 2000mL 3 Frascos Pipeta graduada de escoamento total de 1mL Cloreto de sódio Água Milli-Q Tween 80 Agitador magnético Balança digital Placa de aquecimento com agitação Pipetador automático Procedimento Experimental: 1. Pesou-se 9g de cloreto de sódio num gobelé, com a balança digital, previamente tarada. 2. Dissolveu-se os 9g de cloreto de sódio em 1000mL de água Milli-Q. 3. Transferiu-se a solução preparada para um frasco. 4. Repetiu-se o processo anterior (pontos 1 a 3) duas vezes. 5. Em dois dos frascos adicionou-se 1mL de Tween 80 com recurso a uma pipeta volumétrica de 1mL e um pipetador automático. 6. As soluções foram esterilizadas em autoclave 121 C durante 15 minutos»preparação do meio de cultura Materiais e Reagentes: Equipamento: 2 Erlenmeyer Funil Frascos de vidro Placas de Petri (descartáveis) Tryptic Soy Agar TSA Água Milli-Q esterilizada Fita indicadora de calor húmido Balança digital Placa de aquecimento com agitação Autoclave Bico de Bunsen Câmara de fluxo laminar Procedimento Experimental: Página 6

7 1. Verteu-se, com o auxílio de um funil, 1000mL de água Milli-Q, para cada Erlenmeyer. 2. Os Erlenmeyer foram submetidos a um aumento progressivo de temperatura com homogeneização, numa placa de aquecimento com agitador. 3. Assim que a água começou a ferver, dissolveram-se 80 gramas de TSA, em cada Erlenmeyer. 4. Adicionou-se de seguida outros 1000mL de água Milli-Q a cada Erlenmeyer, perfazendo um total de 2000mL. 5. Deixou-se a mistura em aquecimento e agitação constante até se tornar translúcida. 6. Uma vez atingida uma solução homogénea, esta foi distribuída por vários recipientes (respetivamente: cinco frascos de 400mL, quatro frascos de 200mL e um frasco de 900mL). 7. Os recipientes com TSA foram identificados e colocou-se também um pedaço de fita indicadora em cada um deles. 8. Fechou-se os frascos deixando as tampas ligeiramente soltas, para que as pressões e temperaturas elevadas existentes no interior do Autoclave não destruam as preparações. 9. Os frascos de TSA, de soro fisiológico e de soro fisiológico com Tween que tinham sido preparados anteriormente foram levados a esterilizar no Autoclave no modo de Exaustão Lenta (121 C durante 15 minutos). 10. Depois de terminada a esterilização no Autoclave, fechou-se de imediato as tampas para evitar possíveis contaminações. 11. Ligou-se e limpou-se a câmara de fluxo laminar com álcool a 70% por este ter um período de evaporação mais lento e por isso ser mais eficaz na descontaminação microbiológica. 12. Dentro da câmara, abriu-se e distribuiu-se as placas (do canto esquerdo ao fundo para o canto direito à frente de modo a não contaminar as placas) para de seguida ser possível verter o conteúdo dos frascos de TSA para cada uma delas. 13. Verteu-se sensivelmente 20mL para cada placa. 14. Antes do meio de cultura solidificar eliminaram-se todas as bolhas tocandolhes com a ponta de uma agulha esterilizada no Bico de Bunsen. 15. Assim que o meio de cultura solidificou, fecharam-se as placas ainda dentro da câmara de fluxo laminar. 16. Repetiu-se os pontos 12 a 15 até se consumir todo o volume de TSA, obtendo-se assim 184 placas de meio de cultura. 17. Identificou-se o lote do meio (TSA 33/13) nas placas. Página 7

8 DIA 2 23 de julho de 2013»Validação do técnico de microbiologia Materiais e Reagentes: Equipamento: Placas de TSA Kitasato Pinças estéreis Vedantes Medalhões Membranas estéreis (Ø poro 0,45 µm) Funis de filtração Pipetas de 1 e 25 ml Pipetador Água Milli-Q esterilizada Água Milli-Q não esterilizada Câmara de fluxo laminar Rampa de filtração Bomba de vácuo Bico de Bunsen Procedimento Experimental: 1. Marcou-se as placas de TSA (amostra, réplica, data, técnico). 2. Ligou-se e limpou-se a câmara de fluxo laminar. 3. Montou-se o sistema de filtração (como descrito na imagem 1). 4. Colocou-se o bico de Bunsen dentro da câmara de fluxo laminar. 5. Abriu-se as 3 placas de controlo do fluxo laminar (esquerda, centro e direita) dispostas ao fundo da câmara. 6. Esterilizou-se as pinças à chama. 7. Colocou-se o vedante com a pinça (como descrito na imagem 2). 8. Colocou-se o medalhão com a pinça (como descrito na imagem 2). 9. Colocou-se a membrana de filtração com a pinça (como descrito na imagem 2). 10. Instalou-se o funil de filtração (como descrito na imagem 2). 11. Esterilizou-se o bocal do frasco de água estéril à chama. 12. Pipetou-se 50mL de água esterilizada sobre a membrana. 13. Abriu-se a válvula para iniciar a filtração. 14. Retirou-se o funil de filtração. 15. Colocou-se a membrana retirada no centro da placa de TSA com a pinça (réplica 1). 16. Repetiu-se os passos de 7 a 15 mais 2 vezes (réplicas 2 e 3). 17. Fechou-se as placas de controlo do fluxo laminar. 18. Desmontou-se o sistema de filtração. 19. Limpou-se a câmara. 20. Desligou-se a câmara de fluxo laminar. 21. Incubou-se as placas de TSA a 30 C durante 3 dias. 22. Lavou-se e arrumou-se o material utilizado bem como o laboratório. Página 8

9 Legenda: A - Rampa de filtração, no interior da câmara de fluxo laminar B - Kitasato, reservatório de água, fora da câmara de fluxo laminar C - Bomba de vácuo, fora da câmara de fluxo laminar Imagem 1: Esquema do sistema de filtração Imagem 2: Pormenor da montagem da rampa de filtração Legenda: A - Vedante, peça plástica B - Medalhão, peça metálica C - Membrana estéril (Ø poro 0,45 µm) D - Funil de filtração, peça metálica DIA 3 24 de julho de 2013»Preparação das amostras para irradiação Materiais e Reagentes: Equipamento: Morangos 1 kg Pinças estéreis Caixas de morangos Balança digital 6 Dosímetros Amber Prespex Fonte experimental de cobalto- 60 (Precisa22) Página 9

10 Procedimento Experimental: 1. Pesou-se a quantidade de morangos necessária por dose e guardou-se em caixas separadas (como indicado na tabela 1). 2. Identificaram-se os dosímetros Amber Perspex por dose (dose, cima/baixo). 3. Colocaram-se dois dosímetros por caixa para monitorizar as doses absorvidas. 4. Irradiaram-se os morangos, uma dose de cada vez (primeiro a de 1,5kGy, seguida pela de 3kGy e por fim a de 0,5kGy), na Precisa22, no nível 2, nas posições A, B e C de 1 a 3 (figura 2), durante os períodos de tempo indicados na tabela 2. Tabela 1: Massa de morangos por dose de radiação Massa da caixa sem tampa Massa da caixa com tampa Massa de morangos 0kGy - 300g 0,5kGy - 150g 1,5kGy - 150g 300kGy - 300g 23,98g 10,96g 10,83g 10,76g 39,04g 22,23g 21,71g 22,52g 302,71g 150,97g 163,89g 309,42g Figura 2 Representação do suporte metálico com os respectivos níveis e posições de irradiação. Tabela 2: Tempo de irradiação por dose de radiação Dose (kgy) Tempo de irradiação (hh:mm) 0 00:00 0,5 00:30 1,5 01: :40 Página 10

11 »Determinação da contaminação inicial e do número de sobreviventes (t=0) Materiais e Reagentes: Equipamento: Morangos 1 kg Soro fisiológico 0,9% Soro fisiológico 0,9% com 0,1% de Tween sacos de stomacher estereis Pipetas volumétricas de 1, 10 e 25mL Pipetador 84 placas de TSA Pinças estéreis 9 Tubos de ensaio estéreis Câmara de fluxo laminar Balança digital Stomacher Agitador (vórtex) Bico de Bunsen Página 11

12 Procedimento experimental: 1. Ligou-se e limpou-se a câmara de fluxo laminar. 2. Identificou-se os sacos de stomacher (dose, aluno, data). 3. Pesou-se na câmara de fluxo laminar cerca de 25 g de morangos para um saco de stomacher estéril (1 saco por dose e por aluno). 4. Adicionou-se com auxílio de uma pipeta volumétrica 100mL de SF + TW80 a cada saco. 5. Fecharam-se os sacos. 6. Macerou-se manual e cuidadosamente os morangos. 7. Colocou-se os sacos no stomacher durante 15 minutos a homogeneizar. 8. Deixou-se repousar cerca de 1 minuto. 9. Abriu-se as placas de controlo da câmara (esquerda, centro e direita) e colocou-se no fundo da câmara. 10. Efectuou-se o controlo microbiológico das soluções utilizadas através do espalhamento de 0,1mL de cada solução (SF e SF+TW) em 3 placas de TSA. AS placas foram incubadas a 30ºC durante 7 dias. 11. Colocou-se 9mL de soro fisiológico em cada um dos tubos de ensaio, passando sempre o bocal à chama depois de abrir o tubo e antes de o fechar. 12. Efetuaram-se as diluições necessárias adicionando 1mL da solução inicial (10-1 ) e 1mL da diluição anterior (10-2 ) aos tubos de ensaio. 13. Homogeneizou-se os tubos de ensaio no vórtex. 14. Inocularam-se vários volumes para cada dose em estudo. a. 0kGy: identificaram-se os tubos (10-1 e 10-2 ). Posteriormente, usando um pipetador automático e uma pipeta de 1mL inoculou-se um volume de 0,1mL de cada solução, em três placas (3 réplicas por dose e por diluição) de TSA. De seguida fez-se o espalhamento. b. 0,5kGy: Colocou-se 9mL de soro fisiológico num tubo e adicionou-se 1mL da solução do saco, identificado para esta dose, para fazer a diluição Seguidamente inoculou-se um volume de 0,1mL da diluição anterior em três placas de TSA. Pipetou-se diretamente um volume de 0,1mL da solução do saco para as outras três placas. De seguida fezse o espalhamento. c. 1,5kGy: Inoculou-se volumes de 1mL e 0,1mL em cada uma das três placas de TSA a partir da solução do saco identificado para esta dose. De seguida fez-se o espalhamento e deixou-se secar as placas inoculadas com 1mL dentro da câmara. d. 3,0kGy: Repetiu-se o procedimento realizado para a dose de 1,5kGy. 15. Uma vez secas, as placas foram fechadas ainda no interior da câmara. 16. No final do trabalho fecharam-se as placas de controlo e foram incubadas a 30ºC durante 7 dias. 17. Limpou-se a câmara de fluxo laminar. 18. Incubaram-se as placas de TSA a 30ºC durante 7 dias. 19. Lavou-se e arrumou-se o material utilizado bem como o laboratório. Página 12

13 DIA 4 25 de julho de 2013»Leitura dos dosímetros Materiais e Reagentes: Equipamento: Tesoura Pinça Dosímetros Espectrofotómetro Micrómetro Procedimento experimental: 1. Abriu-se a embalagem dos dosímetros com uma tesoura. 2. Retirou-se os dosímetros do interior das embalagens com uma pinça. 3. Leu-se a absorvância dos dosímetros no espectrofotómetro. 4. Mediu-se a espessura do dosímetro com um micrómetro. 5. Registou-se todos os valores obtidos por dosímetro e por dose. 6. Efetuou-se o cálculo da dose real absorvida.»análise sensorial Uma vez irradiados os morangos, iniciou-se uma nova etapa a análise sensorial que tem como principal objetivo manifestar as diferenças no paladar, consistência, rigidez e aroma entre os morangos irradiados e os morangos não irradiados. 1. Para isso foi confecionado gelado de morango utilizando os das doses de 0kGy e 3kGy com recurso a azoto líquido (-160 C), um processo eficaz e muito utilizado na indústria alimentar. DIA 5 26 de julho de 2013»Preparação de soro fisiológico a 0,9% com Tween À semelhança do dia 1 ( ) preparou-se mais soro fisiológico a 0,9% com Tween80 (0,1%), mas desta vez um volume total de 1400mL. Página 13

14 DIA 6 29 de julho de 2013»Determinação da contaminação inicial e do número de sobreviventes (t=5) À semelhança do dia 3 ( ) refez-se todo processo de determinação da contaminação inicial e do número de sobreviventes nos morangos, 5 dias após a irradiação dos mesmos que foram armazenados em condições de refrigeração, com o objectivo de avaliar se existiam diferenças ao nível da contaminação microbiológica e assim inferir sobre o tempo de parteleira de morangos irradiados.»preparação do álcool utilizado para desinfetar mãos e material Materiais e Reagentes: Proveta de 1000mL Etanol Água Milli-Q Procedimento experimental: 1. Numa proveta mediram-se 700mL de etanol. 2. Nessa mesma proveta adicionou-se 300mL de água Milli-Q, perfazendo um total de 1000mL de solução de etanol a 70%. DIA 7 30 de julho de 2013»Caracterização morfológica dos microrganismos isolados observação macroscópica Identificou-se e fez-se a caracterização morfológica das colónias existentes a nível macroscópico (pigmentação, textura, opacidade, forma, elevação e margem). Página 14

15 DIA 8 31 de julho de 2013»Isolamento dos microrganismos para caracterização morfológica observação microscópica Materiais e Reagentes: Equipamento: Placas de TSA Ansas de inoculação Câmara de fluxo laminar Página 15

16 Procedimento experimental: 1. Ligou-se e limpou-se a câmara de fluxo laminar. 2. As colónias identificadas foram isoladas em TSA pela técnica do riscado: a. Após ter retirado a massa de microrganismos a isolar, procedeuse ao riscado com a ansa de inoculação (nota: é necessário ter atenção na força aplicada com a ansa de modo a não perfurar o meio de cultura). b. De seguida, mudou-se a direção da placa de modo a ser possível espalhar os microrganismos por toda a placa, até ser possível atingir uma colónia isolada. 3. Quando terminado este processo incubou-se as placas a 30 C durante 24 horas. DIA 9 01 de agosto de 2013»Caracterização morfológica - preparação a fresco, coloração Gram e ensaios bioquímicos Materiais e Reagentes: Placas de petri Lâminas Fita-cola Papel de filtro Ansas de inoculação Lamelas Pinça Pipetas de Pasteur Papel absorvente Água Reagente de oxidase Reagente de catalase Cristal Violeta Lugol Safranina Descolorante (álcool + acetona) Óleo de Imersão Equipamento: Câmara de fluxo laminar Microscópio Bico de Bunsen Procedimento experimental: 1. Ligou-se e limpou-se a câmara de fluxo laminar. 2. Identificaram-se as lâminas segundo a codificação atribuída aos microrganismos isolados da amostra inicial. 3. Começou-se por utilizar a técnica da fita-cola nos fungos, que consiste em, levemente, colar um pedaço de fita-cola no fungo.feita a recolha colou-se o pedaço de fita-cola na lâmina, onde se colocou previamente uma gota de água. Página 16

17 4. Observaram-se as preparações ao microscópio com ampliação de 100x e óleo de imersão, fotografando cada uma delas. 5. Seguidamente fizeram-se as preparações a fresco, os testes bioquímicos (oxidase e catalase) e as preparações para a coloração de Gram. a. Preparações a fresco: com o auxílio da ansa de inoculação removeu-se uma pequena quantidade de colónia, depositou-se e espalhou-se a amostra numa lâmina com uma gota de água, colocandose de seguida uma lamela. Por fim observaram-se e fotografaram-se as preparações ao microscópio com ampliação de 100x e óleo de imersão. b. Oxidase: recortou-se uma folha de papel de filtro de modo a que "encaixasse" no fundo de uma placa de petri. Humedeceu-se o filtro com o reagente de oxidase (0,1g de N,N,N,N-tetrametil-1-4-diclorido de fenil diamónio + 10mL H2O). Com recurso a uma ansa de inoculação colocaram-se uma massa da colónia a caracterizar em cima do papel esfregando-as. Esperou-se cerca de um minuto para ver o resultado. Caso esteja presente a enzima citocromo oxidase então o teste dará positivo assumindo a cor violeta escuro ou azul forte (oxidase positiva). c. Catalase: colocaram-se várias gotas de reagente de catalase (3 % de H2O2 em H2O) na tampa de uma caixa de petri e com o auxílio de uma ansa de inoculação colocaram-se uma massa das colónias em cima de uma gota esfregando. Verificou-se a existência de bolhas de gás como indicador de atividade catalásica por parte dos microrganismos. d. Coloração de Gram: preparou-se o esfregaço, deixou-se secar e fixou-se, passando-se à chama três vezes. Coloriu-se, com muito cuidado para não tingir a área circundante, com Cristal Violeta. Aguardou-se um minuto e de seguida lavaram-se as lâminas com água corrente, apenas durante alguns segundos, tendo o cuidado de evitar que a água atinja diretamente a massa de microrganismos. Repetiu-se o processo de coloração dos isolados desta vez com Lugol. Lavaram-se as lâminas com um descolorante (solução de álcool a 96% e acetona) três vezes e de seguida com água corrente. Repetiu-se o processo de coloração já efetuado com com Safranina. Por fim, lavaram-se as lâminas em água corrente e secaram-se com papel absorvente. Observaram-se ao microscópio (ampliação 100x e óleo de imersão), fotografando cada uma e registando o resultado da coloração de Gram (positivo-azul/violeta, negativo-rosa). Página 17

18 Esquema 1: Tipificação de microrganismos Página 18

19 IV. Resultados Experimentais e Respetiva Análise Para avaliar a inativação da população microbiana ao longo do tempo (t=0 dias e t=5 dias após a irradiação) foram determinadas as unidades formadoras de colónias por aproximadamente 25g de morangos para três subamostras de morangos frescos (antes da irradiação - contaminação inicial 0kGy e após irradiação a três doses 0,5; 1,5 e 3kGy) através de contagens realizadas às 24h, 48h, 72h, 5º dia e 7º dia. Aquando da irradiação foram colocados dois dosímetros por dose. Posteriormente efetuou-se a leitura dos dosímetros obtendo-se os seguintes resultados: 0,5 kgy 1,5 kgy 3 kgy Tabela 3: Resultados obtidos pela leitura dos dosímetros Dose Absorvida (kgy) 0,800 Amostra Tempo de Absorvância Espessura Nível Posição irradiação 603 nm 651 nm (mm) frente A 0,086 0,049 0,313 B 0,085 0,049 0,793 00h30 A1, baixo A A2, 0,101 0,06 0,782 0,379 B 0,094 0,055 0,742 A3, frente A 0,304 0,182 2,327 B1, 0,316 B 0,291 0,175 2,232 01h20 2 B2, baixo A B3, 0,189 0,114 1,268 0,385 B C1, 0,186 0,111 1,251 frente A C2, 0,428 0,254 3,139 0,327 B 02h40 C3 0,432 0,26 3,168 baixo A 0,556 0,336 4,379 0,306 B 0,534 0,323 4,200 Dose média (kgy) 0,68 1,77 3,72 Débito dose (kgy/h) 1,36 Após os sete dias de incubação a 30ºC cada aluno determinou através das contagens efetuadas o valor de unidades formadoras de colónias por g de morango analisadas (ufc/g de morango) e com base nos resultados obtidos construíram-se duas curvas de sobrevivência (logaritmo de ufc/g de morango em função da dose absorvida em kgy), uma para cada tempo após a irradiação em estudo (t=0 e t=5) Tabela 4: Dados recolhidos t=0 dias Dose real (kgy) Log (UFC/g) Desvio Padrão Intervalo de Decréscimo Confiança relativo (%) 0 4,41 0,32 0,15 0 0,68 3,91 0,21 0, ,77 3,42 0,39 0, ,72 2,75 0,55 0,26 97 Página 19

20 Gráfico 1: Curva de sobrevivência t=0 dias Após o tempo de incubação efectuou-se a caracterização morfológica dos microrganismos isolados para o t=0, bem como a determinação da frequência relativa de cada tipo identificado. A representação gráfica apresentada no Gráfico 2 ilustra a frequência relativa dos tipos morfológicos por dose analisada. Gráfico 2: Frequência relativa de microrganismos consoante o tipo (esquema 1) e a dose absorvida Página 20

21 Como se pode observar no Gráfico 2, os grupos X (fungos filamentosos) e XI (leveduras) apresentam maior frequência relativa como seria expectável, visto que estão descritos como sendo os principais tipos de microrganismos em morangos frescos, além de que apresentam uma maior resistência aos efeitos nefastos da radiação ionizante. Este facto é notório quando verificamos que a população resitente a doses mais elevadas (3 kgy) de radiação gama é maioritariamente constituída por fungos filamentosos e leveduras (tipo X 67%, tipo XI 32,5%). Tabela 5: Dados recolhidos t=5 dias Dose real (kgy) Log (UFC/g) Desvio Padrão Intervalo de Decréscimo Confiança relativo (%) 0 4,93 0,19 0,09 0 0,68 4,65 0,46 0, ,77 3,66 0,65 0, ,72 3,37 0,45 0,23 96 Gráfico 3: Curva de sobrevivência t=5 dias Página 21

22 Relativamente ao teste sensorial verificou-se que a diferença entre os morangos irradiados e os não irradiados é notória, sendo que os irradiados são menos rijos, com menor consistência, mais doces e com um aroma mais ativo. Página 22

23 V. Conclusão O aumento progressivo do número de indivíduos da população mundial gera constantes desafios à sociedade. Segundo a ONU, estima-se que em 2050 a população mundial atingirá os 9,6 biliões de pessoas. Surgem então necessidades fundamentais, como a alimentação e cuidados de saúde para este número de seres humanos. Quanto menos contaminados os alimentos chegarem às prateleiras, menor será o número significativo de microrganismos neles presentes e assim maior será o seu período de consumo em segurança, o que aumentará a quantidade de alimento disponível. Neste estudo foi explorada a técnica de inativação microbiana através de radiação gama proveniente de uma fonte de Cobalto-60. Foi usada uma amostra de aproximadamente 1kg de morangos, dos quais cerca de 600g foram irradiados a diferentes doses. Através dos resultados obtidos, concluiu-se que a taxa de sobrevivência de microrganismos é menor quanto maior for a dose de radiação gama aplicada e que o grande pico de crescimento dos microrganismos se dá às 72 horas. Verificou-se, também, que nas doses de 1,5kGy e 3kGy existia um número superior de fungos do que de bactérias. Este número chegava por vezes a ser superior ao número de fungos presentes nas doses de 0kGy e 0,5kGy. Isto deve-se ao facto de os fungos possuírem uma maior resistência a condições adversas e a agentes letais como por exemplo os raios gama. A radiação ionizante, consoante a dose e o tempo aplicado, inibe ou retarda a divisão celular nas bactérias, mas nos fungos pode não surtir qualquer efeito na sua reprodução, já que estes apresentam uma forma esporulada com elevada resistência a condições inóspitas. Tal como acima referido, comprovou-se com a análise sensorial que os morangos irradiados passavam a apresentar menos rigidez, menor consistência, um sabor mais doce e um aroma mais ativo, possivelmente devido ao facto de as fibras, que garantem a consistência, textura e rigidez estarem associadas a cadeias de polissacarídeos que são decompostos por ação da radiação dando origem a polissacarídeos mais simples Tendo em consideração todos estes aspetos pensamos ter atingido todos os objetivos a que nos propusemos. Página 23

24 VI. Bibliografia (visitado em ) (visitado em ) (visitado em ) AGRADECIMENTOS Este trabalho é financiado por Fundos FEDER através do Programa Operacional Factores de Competitividade COMPETE e por Fundos Nacionais através da FCT Fundação para a Ciência e a Tecnologia no âmbito do projeto RE- CI/AAG-TEC/0400/2012 Página 24