AVALIAÇÃO DO POTENCIAL FITOQUÍMICO DE Chloris gayana Kunth (POACEAE)

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1 XI CONGRESSO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE PIVIC/CNPq/UFCG-2014 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL FITOQUÍMICO DE Chloris gayana Kunth (POACEAE) Maria Jose Cândido de Oliveira 1, Danielly Albuquerque da Costa 2 RESUMO A fitoquímica possui uma estreita relação com diversas áreas do conhecimento, visando à produção de alimentos funcionais, fitoterápicos, pesticidas, fragrâncias, aromas, entre outros produtos de alto valor agregado. Uma avaliação do caráter fitoquímico preliminar de Chloris gayana Kunth realizado durante a vigência PIVIC identificou a presença de compostos como triterpenos, esteroides, taninos, flavonoides e indicativo para alcaloides, o que pode classificar essa espécie como uma fonte potencial de aplicações terapêuticas, despertando o interesse dos cientistas por dar continuidade aos estudos com esta espécie de forma a contribuir para a identificação estrutural de seus constituintes químicos, o que pode resultar em obtenção de compostos bioativos. Buscou-se, na vigência , por meio da realização de processos cromatograficos, o isolamento e purificação de metabólitos secundários da fase hexânica de Chloris gayana Kunth. Obteve-se uma mistura de duas substancias que após triagem fitoquimica mostraram tratar-se de esteroides e encontram-se em fase final de purificação para posteriormente serem submetidas à obtenção de espectros e caracterização estrutual. O extrato etanólico da espécie em estudo apresentou potencial biotecnológico quando associado com a amicacina na antibioticoterapia contra doenças causadas por Staphylococcus aureus. Palavras-chave: Fitoquímica. Metabólitos secundários. Esteroides. EVALUATION OF THE POTENTIAL PHYTOCHEMICAL OF Chloris gayana Kunth ( POACEAE) ABSTRACT Phytochemical has a close relationship with various areas of knowledge, aiming at the production of functional foods, herbal medicines, pesticides, fragrances, flavors, and other products with high added value. An evaluation of the preliminary phytochemical Chloris gayana Kunth character performed during the term PIVIC identified the presence of compounds such as triterpenes, steroids, tannins, flavonoids and alkaloids for indicative, which can classify this species as a potential source of therapeutic applications, aroused the interest of scientists continue their studies with this species in order to contribute to the structural identification of chemical constituents, which may result in obtaining bioactive compounds. Was sought in the term, through the realization of chromatographic processes, the isolation and purification of secondary metabolites of Chloris gayana Kunth hexane phase. Obtained a mixture of two substances that after phytochemical screening showed that it was steroids and are in the final stages of purification to be later submitted to obtain spectra and estrutual characterization. The ethanol extract of the species studied showed that biotechnological potential when combined with amikacin in antibiotic therapy against diseases caused by Staphylococcus aureus. Keywords: Phytochemistry. Secondary metabolites. Steroids. 1 Aluna do Curso de Farmácia, Unidade Acadêmica de Saúde, UFCG, Cuité, PB, mjoliver_can@hotmail.com. 2 Farmácia, Professora, Doutora, Unidade Acadêmica de Saúde, UFCG, Cuité, PB, daniellyac@ufcg.edu.br * Autor para correspondência*

2 INTRODUÇÃO Tem-se observado nas últimas décadas um grande avanço científico no estudo dos vegetais, isto porque, os processos vitais de biossíntese são os responsáveis pela formação, acúmulo e degradação de inúmeras substâncias orgânicas no interior das células que formam os diversos tecidos dos organismos animais e vegetais (SANTOS, 2002). Convencionalmente, as plantas realizam dois tipos de metabolismo, o primário, cujos produtos são aminoácidos, lipídios, carboidratos e macromoléculas e o metabolismo secundário, onde são formados os compostos terpênicos, alcaloídicos, glicosídicos e vários outros (GONÇALVES, 2010). Os compostos resultantes do metabolismo primário são estudados, principalmente, no âmbito da bioquímica e os últimos no âmbito do que se convencionou denominar química de produtos naturais (MATOS, 2009). A pesquisa fitoquímica tem por finalidade analisar a presença de constituintes químicos nas espécies vegetais. No caso de não se dispor de estudos químicos sobre a espécie de interesse, a análise fitoquímica pode identificar os grupos de metabólitos secundários relevantes (SIMÕES et al., 2010). A fitoquímica possui uma estreita relação com diversas áreas do conhecimento, visando à produção de alimentos funcionais, fitoterápicos, pesticidas, fragrâncias, aromas, entre outros produtos de alto valor agregado (CENTRO DE GESTÃO E ESTUDOS ESTRATÉGICOS, 2010). Seu panorama é um diferencial para o Brasil, ao considerarmos sua diversidade vegetal exuberante que ainda não possui estudos e as possibilidades para o desenvolvimento de novos medicamentos (FOGLIO, 2006). A necessidade de desenvolvimento de novos fármacos que sejam efetivos contra algumas doenças ainda sem tratamento adequado, e que possam substituir os já existentes, a custos menores e dotados de menos efeitos adversos, tem impulsionado a grande comunidade científica a novas e incessantes pesquisas no estudo com plantas para a obtenção de novas moléculas (BARREIRO, 1990). Os estudos fitoquímicos das espécies vegetais são de grande importância e correspondem a uma fonte inexplorada que pode ser usada para a descoberta de alternativas terapêuticas (FOGLIO et al., 2006). Neste contexto está inserida a espécie Chloris gayana Kunth, conhecida popularmente por capim de Rhodes ou capim pé de galinha, pertencente à família Poaceae. Esta está constituída por capins, bambus e cereais, contendo cerca de 700 gêneros e espécies distribuídas por todos os continentes do planeta. No Brasil, esta família apresenta cerca de 180 gêneros e 1500 espécies com distribuição cosmopolita (JUDD et al.,2002 apud VIANA; FILGUEIRAS, 2008). Uma avaliação do caráter fitoquímico preliminar de Chloris gayana Kunth realizado durante a vigência PIVIC identificou a presença de compostos como triterpenos, esteroides, taninos, flavonoides e indicativo para alcaloides, o que pode classificar essa espécie como uma fonte potencial de aplicações terapêuticas, despertando o interesse dos cientistas por dar continuidade aos estudos com esta espécie de forma a contribuir para a identificação estrutural de seus constituintes químicos, o que pode resultar em obtenção de compostos bioativos. Buscou-se, na vigência , por meio da realização de processos cromatograficos, o isolamento e purificação de metabólitos secundários da fase hexânica de Chloris gayana Kunth, bem como disponibilizar o extrato etanólico e frações desta espécie para avaliação de toxicidade e de atividade antimicrobiana, por colaboradores da área de farmacologia. MATERIAL E MÉTODOS Material Usado Extrativos O extrato e frações de C. gayana Kunth foram solubilizados com solventes analiticamente puros (P.A) obtidos da marca Dinâmica e Impex, destacando-se o hexano, clorofórmio, etanol e metanol. Na evaporação dos solventes foi utilizado evaporador rotativo Quimis acoplado a bomba de vácuo e na dissolução das amostras chapa aquecedora Fisatom, modelo 725A. Para as medidas de massa utilizouse uma balança analítica bioprecisa, modelo FA2104N. Cromatográficos Para os processos cromatográficos foram utilizados sílica-gel 60 (Merck) 7734 (partículas com 0,063-0,2 mm, mesh) ou sephadex LH-20 (Merck) como fase estacionária, tendo como suporte

3 colunas de vidro cilíndricas ou funil de Buchner (coluna filtrante) com dimensões variando de acordo com a quantidade de amostra a ser cromatografada. As amostras foram analisadas por cromatografia em camada delgada analítica (CCDA) com as placas da Merck, observadas no UV-Visível modelo MA 544 Marconi e reveladas em vapores de iodo. Métodos A metodologia que foi utilizada neste trabalho seguiu as etapas abaixo discriminadas: Levantamento bibliográfico Durante o desenvolvimento do projeto foi feita a atualização bibliográfica sobre a espécie estudada no Chemical Abstract, Biological Abstracts, NAPRALERT e Web of Science, com a constante coleta de informações, visando à implementação de novas ideias e conhecimentos atualizados. As etapas iniciais referentes à coleta e classificação do material vegetal, bem como, a secagem, moagem e preparação do extrato bruto já haviam sido realizadas anteriormente, sendo proposta para vigência as etapas a seguir: Processamento cromatográfico da fase hexânica Da fase hexânica (13,46 g) obtida por particionamento realizado na vigência , separou-se 10,0 g, submetendo-a em seguida à coluna filtrante em um funil de Buchner sob vácuo. Utilizou-se sílica-gel 60 mesh como fase estacionária e como eluentes hexano, clorofórmio e metanol em gradientes crescentes de polaridade. Em seguida as frações obtidas foram concentradas no evaporador rotativo, resultando nas seguintes medidas de massa, conforme apresentado no Esquema 1, p.3. Esquema 1. Processamento cromatográfico da fase hexânica de Chloris gayana Kunth Coluna filtrante. Após análise por cromatografia em camada delgada analítica (CCDA) das frações obtidas da coluna filtrante, priorizou-se o estudo da fração CHCl 3 (hex), com 2,24 g. Esta foi submetida à cromatografia em coluna com sephadex LH-20, utilizando-se CHCl 3 : MeOH ( 1:1) como eluente (coluna C1), o que resultou em 11 frações, as quais foram monitoradas por CCDA, reunidas segundo seus Rf s, e posteriormente recromatografadas, desenvolvendo-se as seguintes colunas, C2, C3, C4, C5, C6 e C7, de onde obteve-se a subfração 06 considerada de interesse (Esquema 2, pag. 4). Triagem fitoquímica das frações hexânicas de interesse de Chloris gayana Kunth Quando necessário realizou-se triagem fitoquímica nas frações de interesse para se determinar a que classe de metabólito secundário pertenciam. Para tanto, seguiu-se à metodologia descrita por MATOS (2009) e/ou BIAVATI et al. (2007).

4 Disponibilização do material vegetal para realização de testes toxicológicos Foram disponibilizados o extrato etanólico bruto e respectivas fases resultantes do particionamento de C. gayana para equipe do professor Fernando de Sousa Oliveira, integrante do Núcleo de Pesquisa da Universidade Federal de Campina Grande, colaborador com atividade citotóxica, para a realização de testes toxicológicos em Artemia salina. Disponibilização do material vegetal para realização de triagem farmacológica Na busca de se evidenciar possíveis atividades terapêuticas, o extrato etanólico bruto de C. gayana foi encaminhado para Universidade Federal do Piauí para avaliação da atividade antimicrobiana a ser desenvolvida pela equipe do Professor Humberto Medeiros Barreto. Esquema 2 - Processamento cromatográfico da fase clorofórmica (Hex) Chloris gayana Kunth Colunas cromatográficas. *- Fração de interesse.

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO Após as sucessivas cromatografias, a subfração 06 (26,0 mg) oriunda da coluna C7, apresentou-se como um precipitado branco e cristalino que ao ser analisado por CCDA revelou-se como uma mistura de duas substâncias. A prospecção química realizado com C. gayana por nossa equipe em vigência anterior (PIVIC ) revelou presença de esteroides e alcaloides na fase hexânica. Como ambas as classes geralmente possuem aspectos semelhantes, apresentando coloração branca, e como não encontrou-se tempo hábil para obtenção dos espectros e elucidação estrutural das substâncias isoladas, priorizou-se realizar uma triagem na subfração 06 no intuito de prever a qual dessas classes de metabólitos citadas à amostra de interesse pertencia. Fez-se, então, testes preliminares para esteroides (reagente de Lieberman-Burchard) e para alcaloides (reagente de Dragendorff). Uma amostra da subfração 06 (1,0 mg) quando submetida ao teste de Lieberman-Buchard indicou tratar-se de esteroides, através do surgimento de coloração azul evanescente característica (Figura 1, p. 5).. Figura 1- Resultado positivo para o teste de Lieberman- Burchard (esteroides) Fonte: Dados da pesquisa (Próprio autor). Segundo KREPSKY (2014), o mecanismo exato como ocorre à reação colorimétrica ainda não foi totalmente comprovado. Contudo, acredita-se que o reagente de Lieberman-Burchard (anidrido acético + ácido sulfúrico concentrado) é o responsável por promover a desidratação e desidrogenação no núcleo fundamental, formando derivados corados com duplas conjugadas. No caso dos esteróides: 2 ligações duplas conjugadas no anel B ou 1 ligação dupla e um grupo metileno desimpedido no C7 (podendo sofrer oxidação e desidratação) seriam essenciais para a reação (Figura 2, p. 5). Figura 2- Representação de um esteroide (β-sitosterol)

6 O surgimento deste grupo de metabólito na fase hexânica é bastante comum, em virtude de serem abundantes nos vegetais e caracterizarem-se por possuírem baixa polaridade. O teste para alcaloides, por sua vez, mostrou-se negativo pela ausência de turvação e de formação de precipitado após uso do reagente Dragendorff Quanto aos testes toxicológicos a serem realizados com o EEB e cada fase obtida do particionamento (hexânica, clorofórmica e hidroalcóolica) de Chloris gayana encontram-se em fase final dos experimentos. Em relação à avaliação da atividade antimicrobiana, o extrato etanólico da espécie em estudo apresentou potencial biotecnológico quando associado com a amicacina na antibioticoterapia contra doenças causadas por Staphylococcus aureus (BARRETO et al., 2013). CONCLUSÃO O estudo da fase hexânica de Chloris gayana Kunth resultou numa mistura de duas substâncias que estão em processo final de separação para serem encaminhadas para espectros na Universidade Federal da Paraíba e posteriormente realizar-se a caracterização estrutural. A triagem fitoquímica realizada com uma amostra da mistura de interesse mostrou que a mesma pertence à classe de esteroides. Os resultados obtidos com atividade antibacteriana são promissores, estimulando a continuidade da pesquisa com esta espécie, no intuito de descobrir o(s) possível (is) constituinte(s) responsável(is) pelo efeito apresentado. Como perspectiva pretende-se encaminhar o extrato e fases obtidas do particionamento de C. gayana para pesquisadores que trabalham em outras áreas de atividade farmacológica para serem avaliados outros possíveis efeitos desta planta. AGRADECIMENTOS À UFCG, pela oportunidade de participar do PIVIC; Aos técnicos do Laboratório de Farmacognosia, da Unidade Acadêmica de Saúde, onde este projeto foi desenvolvido e realizado, por todo apoio e contribuição; Às colegas Vanessa Pinto e Rita de Cássia Fragoso pela colaboração; À professora Danielly Albuquerque da Costa por sua dedicada orientação. REFERÊNCIAS BARREIRO, E. J. Produtos Naturais e Bioativos de Origem Vegetal e o Desenvolvimento de Fármacos. Química Nova, v.13, n. 1, p , BARRETO, H. M et al. Atividade antimicrobiana e moduladora da resistência a antibióticos do extrato etanólico de Chloris gayana. In: SIMPÓSIO LATINO AMERICANO DE BIOTECNOLOGIA DO NORDESTE. Parnaíba: UFPI, Anais eletrônicos. Disponível em: Acesso em 25 ago BIAVATTI, M. W. et al. Ethnopharmacognostic survey on botanical compendia for potential cosmeceutic species from Atlantic Forest. Revista Brasileira de Farmacognosia. v.17, n.4, p , CENTRO DE GESTÃO E ESTUDOS ESTRATÉGICOS. Química verde no Brasil: Ed. rev. e atual. Brasília-DF, 2010, p FOGLIO, M.A. et al. Plantas Medicinais como Fonte de Recursos Terapêuticos: Um Modelo Multidisciplinar. MultiCiência: Construindo a história dos produtos naturais. CPQBA/UNICAMP, GONÇALVES, J.M. Avaliação da atividade antimicrobiana e triagem fitoquímica dos extratos de espécies da família Asteraceae encontradas no semiárido baiano. [Dissertação] apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana. Feira de Santana- BA, KREPSKY, P. B. Análise fitoquímica preliminar Disponível em: acesso em 15/06/14, às 17h44min.

7 MATOS, F. J. A. Introdução à Fitoquímica Experimental. 2ª ed. Fortaleza: Edições UFC, 2009, 148 p. RIBEIRO, C.M.R; SOUZA, A.N. Esquema geral para elucidação de substâncias orgânicas usando métodos espectroscópico e espectrométrico. Química. Nova, v. 30, n. 4, p , SANTOS, E. M. Floristica Etnobotânica e Tipagem Fitoquímica de espécies medicinais de uso popular nos cerrados dos municípios de Caxias e Timon, Maranhão. Seminário de Iniciação Científica da UEMA, SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6. ed. Porto Alegre: Ed. da UFSC, 2010, 1102p. VIANA. P.L., FILGUEIRAS. T.S. Inventário e distribuição geográfica das gramíneas (Poaceae) na Cadeia do Espinhaço, Brasil. Megadiversidade. n. 4, p.1-2, 2008.